线粒体E3泛素连接酶MARCH5是Drp1依赖性线粒体分裂所必需的

MARCH5 RNAi诱导线粒体伸长

为了进一步测试MARCH5在线粒体动力学调节中的作用，我们应用短发夹RNA干扰（shRNAi）介导的MARCH5protein表达下调。用靶向GFP（对照RNAi细胞；Lee等人，2004年)或靶向MARCH5（MARCH5RNAi细胞）的构建体。如Western blot所示，与对照RNAi细胞相比，MARCH5 RNAi导致MARCH5RNA表达显著下调(图2 A). 我们还测试了与MARCH5相互作用的线粒体动力学蛋白Mfn2、Drp1和Fis1的表达水平(Nakamura等人，2006年;Yonashiro等人，2006年). Western blot分析的对照RNAi和MARCH5 RNAi细胞的全细胞裂解物表明，MARCH4表达的减少与Mfn2、Drp1和Fis1蛋白水平的明显变化无关(图2 A). 分析线粒体形态，控制RNAi(图2 B)和MARCH5 RNAi(图2C)对细胞进行Tom20免疫染色。在～40%的MARCH5 RNAi细胞中，线粒体形成细长且相互连接的小管(图2、C和D). 与之前的报告相比，我们在MARCH5 RNAi细胞中没有检测到明显的线粒体碎片（MARCH5RNAi的5.67±2.31%，而对照RNAi则为6.67±4.72%；图2 D).

在单独的窗口中打开

图2。

MARCH5 RNAi诱导线粒体异常互联。（A） 通过Western blot分析转染GFP-和MARCH5-沉默载体9天后收获的GFP-RNAi或MARCH5-RNAi细胞的MARCH5。还测试了与线粒体动力学调节相关的Mfn2、Drp1和Fis1蛋白的表达水平。使用抗α-微管蛋白抗体作为负载对照。通过共焦显微镜分析GFP RNAi和MARCH5 RNAi细胞中抗Tom20单克隆抗体显示的（B–D）线粒体形态。GFP RNAi和MARCH5 RNAi细胞（D）中具有控制样管状线粒体、异常连接和破碎线粒体的细胞数量。数据表示每种条件下三次转染的平均±SD，每次计数150个细胞。

表达MARCH5 RING结构域突变体的细胞线粒体网络体积和连接性

为了进一步表征MARCH5活性的影响，我们使用以线粒体基质为靶点的GFP光活化变体（mito-PAGFP）分析线粒体网络单位大小和邻接性(Karbowski等人，2004年)在表达不同MARCH5结构的细胞中。为此，在双转染细胞中，4μm宽的感兴趣区域（ROI）(图3，A和B; 黑方块）用413-nm激光短暂照射，然后在413-nm光活化后立即用488-nm激光成像(图3，A和B; 中间面板）。这导致ROI内丝裂原-PAGFP的光激活。ROI光激活后立即进行的488-nm共焦成像显示了位于ROI内的线粒体网络单元的面积以及与ROI相邻的基质室的面积(Karbowski等人，2004年). 我们发现，在这里应用的条件下，在对照组（未发表的数据）和野生型MARCH5表达细胞中(图3 A)激活的线粒体通常仅限于光激活的ROI，而在MARCH5中^H43瓦(图3 B)和3月5日^C65S、C68S（未发表的数据）表达细胞的mito-PAGFP信号从ROI进一步重新分布。这表明抑制MARCH5活性后线粒体网络单位的大小增加。为了量化ROI激活线粒体所覆盖的相对面积，我们还对整个成像场进行了光激活。这导致描绘同一细胞内的所有线粒体(图3，A和B; 右侧面板）。ROI激活的线粒体覆盖面积（r）与全细胞线粒体覆盖面积的比值（w）的量化显示，表达MARCH5的细胞线粒体单位大小显著增加^H43瓦（r/w=0.595±0.179）和MARCH5^C65S、C68S与对照组（r/w=0.243±0.086）和野生型MARCH5（r/w=0.240±0.074）表达细胞相比（r/w=0.626±0.199）(图3 C).

在单独的窗口中打开

图3。

表达MARCH5 RING突变体的细胞线粒体体积和连通性的量化。采用线粒体-PAGFP扩散分析（A-C）和FRAP（D-F）研究野生型MARCH5和MARCH5RING突变表达细胞中线粒体网络单位的相对大小。对于基于mito-PAGFP的线粒体互联性分析，细胞被CFP-标记的WT MARCH5（A和C）、MARCH6共同转染^h43瓦（B和C），3月5日^C65S、C68S（C） 与有丝分裂PAGFP一起或单独用有丝分裂PAGFP转染（C）。表达野生型MARCH5（A）和MARCH4的典型细胞的假彩色图像^H43瓦（B） 如图所示。使用MetaMorph图像分析软件（C）量化线粒体互连程度。如图所示，红色条表示每个实验组17次测量的平均值±SD。黑钻石表示从每个单细胞测量中获得的值（C）。用CFP标记的WT MARCH5、MARCH4瞬时共转染HeLa细胞^h43瓦，3月5日^C65S、C68S-用FRAP测定YFP与mito-YFP或单独转染mito-YFP的线粒体体积。典型的对照组、表达有丝分裂YFP的细胞（D）和表达MARCH5的细胞^H43瓦FRAP实验中使用的mito-YFP（E）显示在用红环指示的感兴趣区域的光漂白之前和之后。每组19个单细胞分析的平均值后获得的FRAP曲线，以及指示实验组中FRAP的程度如F所示。

如前所述，为了分析线粒体网络的复杂性，我们还应用了FRAP(Szabadkai等人，2004年;Karbowski等人，2006年)，在表达MARCH5-CFP的细胞中，MARCH5^H43瓦-CFP或MARCH5^C65S、C68S-CFP和线粒体基质靶向黄色荧光蛋白（mito-YFP）。测量FRAP，3-μm ROI(图3、D和E; 通过高功率激光照射，双转染细胞中的红圈）被光漂白至初始mito-YFP荧光的～50%。随后，对每400毫秒持续～14秒的YFP荧光恢复进行分析。在对照细胞中的mito-YFP萤光恢复到65.35±7.6%预漂白荧光的条件下，如每次测量的最后一个时间点所获得的，MARCH5中的荧光恢复^H43瓦和3月5日^C65S、C68S-表达细胞显著增高(图3 F; 分别为76.3±9.74和76.1±7.02）。确认免疫荧光结果(图1、B和F)，线粒体PAGFP分析(图3，A–C)和发布的数据(Yonashiro等人，2006年)，对照组和野生型MARCH5表达细胞之间的FRAP没有统计学上的显著差异(图3 F; 68.22±9.22，P>0.2）。这表明野生型MARCH5的异位表达不会影响线粒体的总体积，而MARCH5RING突变表达细胞中FRAP的增加反映了线粒体连接的增加。我们还对表达Drp1的细胞进行了对照FRAP实验^K38A公司线粒体分裂蛋白Drp1的显性阴性突变，或在转染病毒线粒体相关凋亡抑制因子（vMIA）的细胞中(图3 F). 已经表明Drp1^K38A公司诱导线粒体异常伸长(Smirnova等人，2001年)vMIA导致线粒体断裂(McCormick等人，2003年;Karbowski等人，2006年). Drp1中FRAP显著增加^K38A公司-表达细胞(图3 F; 80.2±9.24），vMIA表达细胞减少(图3 F; 54.03 ± 6.89). 在表达MARCH5 RING突变体的细胞和Drp1的细胞中，线粒体FRAP值没有显著差异^K38A公司（3月5日^H43瓦/图纸1^K38A公司P>0.1；和3月5日^C65S、C68S/图纸1^K38A公司，P>0.1），从而得出结论，MARCH5 RING结构域突变诱导的线粒体缺陷在定性和定量上与Drp1诱导的线粒体损伤相当^K38A公司，一种已确定的线粒体分裂抑制剂（另请参阅补充文本和图S2和图S3，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200611064/DC1).

我们的观察结果似乎与最近发表的对MARCH5 RING域突变表达细胞线粒体表型的解释相矛盾(Nakamura等人，2006年;Yonashiro等人，2006年). 据报道，线粒体断裂而非伸长是抑制MARCH5活性的主要反应。我们发现，在这里分析的所有病例中，在表达：（1）MARCH5的N端和C端YFP融合后^H43瓦; 和（2）MARCH5的C端熔断^c65、c68和3月5日^Δ1-71（图S2 A），以及Myc标记的MARCH5^H43瓦（图S2 B），在表达低到中等水平突变蛋白的细胞中，线粒体的形态正常或异常伸长和连接。一种解释是，在产生高水平MARCH的细胞中，更明显的是核周线粒体的扩大和圆形^5H43瓦，3月5日^C65S、C68S和3月5日^Δ1-71可以在低倍下解释为“碎片化”（图S1，A–C）。然而，与Opa1 RNAi细胞（图S3 a）或Mfn1KO和Mfn2KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）线粒体融合受损时不平衡分裂形成的小泡状线粒体相比（参见图7)MARCH5突变体表达细胞中的圆形核周细胞器要大得多（图S3 B）。此外，MARCH5 RING突变体的表达不会导致线粒体数量的明显增加（图S3、A和B；未公布的数据），这是线粒体分裂激活时的预期结果，表明线粒体分裂不会导致MARCH4抑制诱导的线粒体畸变。事实上，它已经在哺乳动物细胞中得到证实(Smirnova等人，2001年)和酵母(Griffin等人，2005年)强烈的裂变缺陷会导致核周塌陷和线粒体圆形化，而对这一过程的轻微抑制会导致网状线粒体的形成。考虑到只有相对较高水平的MARCH5突变表达才能刺激线粒体的核周塌陷和圆形化（未发表的数据），我们可以想象MARCH4的裂变程度^H43瓦或3月5日^C65S、C68S转染细胞与突变蛋白的表达水平成反比，正如预期在显性阴性突变的情况下发生的那样。由于这种关系，在最极端的情况下，可能发生与Drp1的“强”显性负突变体诱导的线粒体改变相当的线粒体改变(Smirnova等人，2001年). 因此，我们试图测试MARCH5突变表达细胞中圆形塌陷的线粒体是否是单独的单位，或者它们是否形成异常但相互连接的线粒体网络。为了实现这一点，我们使用了另一种基于FRAP的方法（图S4，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200611064/DC1). 对看似分离的圆形线粒体（图S4A中的ROI 1；漂白区直径～2μm）进行多次漂白（图S4，B-D中标记为“V”）和荧光恢复，同时避免相邻线粒体的直接光漂白。光漂白ROI 1（图S4B）的荧光强度变化，直接相邻的线粒体（ROI 2；图S4 C）和距离漂白区相对较远的线粒体（LOI 3；图S4D）被绘制为时间函数。我们发现，每次漂白后，ROI 1中的有效荧光恢复都会出现，这与逐渐耗尽有关，但ROI 2中的荧光恢复也会稍有延迟，ROI 3的变化很小。从这些数据中，我们可以得出结论，ROI 1和ROI 2之间发生了线粒体YFP的交换，ROI 3中的线粒体与ROIs 1和ROIs 2是分开的。此外，由于位于ROI 2中的线粒体也恢复了线粒体YFP荧光，它很可能还与另一个线粒体相连。因为线粒体基质靶向GFP可以以15–19毫秒的速率自由扩散(Partikian等人，1998年)在HeLa细胞的正常管状线粒体中，ROI 2的延迟反应表明它可能通过异常薄的线粒体小管与位于ROI 1内的线粒体相连。这与Dnm1p突变体中看似分离的圆形线粒体的观察结果一致秀丽隐杆线虫能够交换矩阵目标GFP(拉布卢斯等人，1999年). 总之，基于上述数据，我们得出结论，在表达MARCH5的细胞中^H43瓦和3月5日^c65、c68线粒体的异常互连是主要的形态学表现，抑制MARCH5活性会增加网络中线粒体的体积并减少线粒体单位的数量。这表明MARCH4活性的丧失可能会抑制线粒体裂变或激活融合。

在单独的窗口中打开

图7。

MARCH5 RING突变体的表达可恢复Mfn1KO和Mfn2KO细胞中的管状线粒体。（A） 野生型MARCH5和MARCH4内源性Mfn2的表达水平^H43瓦-Western blot分析表达细胞。全细胞裂解物（WCL）和富含线粒体的重膜（HM）组分是从有无MG132培养的HeLa细胞中获得的，并转染Myc-tagged MARCH5和MARCH6^h43瓦使用SDS-PAGE解析蛋白质，然后使用抗Mfn2多克隆抗体进行免疫染色。通过抗Hsp60抗体的免疫染色控制负荷。转染MARCH5-YFP（B；叠加图像上的黄色）或MARCH5的Mfn2KO细胞^H43瓦-YFP（C和D；叠加图像上的绿色）用抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体显示线粒体（叠加图像上为红色），并通过共焦显微镜进行分析。在E中，对细胞线粒体的形态进行评分。数据表示三次转染的平均值±SD，每次计数100个细胞。

MARCH5环结构域突变体的线粒体下融合

野生型MARCH5-YFP、MARCH5线粒体形态分析^H43瓦-YFP和3月5日^C65S、C68S-我们注意到，表达YFP的细胞野生型MARCH5均匀地修饰线粒体(图1 B)，3月5日^H43瓦(图1、C和D;图4 A)和3月5日^C65S、C68S(图1 E)主要局限于亚软骨聚集物，一些分散地局限于OMM。为了量化MARCH5与OMM的关联程度，用野生型MARCH5-YFP、MARCH4和MARCH6转染细胞^H43瓦-YFP或MARCH5^C65S、C68S-YFP随后进行Tom20免疫染色和共焦图像采集(图4 A). 使用图像分析软件Volocity的“共定位”功能，对绿色通道像素（MARCH5和MARCH5RING突变体）与红色通道像素（Tom20）的共定位进行量化。MARCH5的不同变体与OMM的关联度被描述为皮尔逊相关系数（r）(图4 B)其中，r值介于−0.3±0.3之间表示几乎没有关联，+0.3±0.7表示弱正关联，+0.7±1.0表示强正关联。利用这一分析，我们发现MARCH5-YFP以扩散的方式定位于OMM，只有偶尔的线粒体下聚结和线粒体外定位，显示出与OMM的高度关联（r=0.77±0.03；图4 B). 3月5日^H43瓦-YFP（r=0.46±0.11；图4，A和B)和3月5日^C65S、C68S-YFP（r=0.36±0.09；图4B）显示出与OMM的关联度明显较低，表明干扰MARCH5环结构域活性的突变导致该蛋白在OMM中的重新分布。

在单独的窗口中打开

图4。

MARCH5 RING突变体的线粒体下融合。表达野生型MARCH5-YFP、MARCH5的HeLa细胞^H43瓦-YFP和3月5日^C65S、C68S-对YFP进行Tom20免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。表达MARCH5的细胞示例^H43瓦-用于分析的Tom20的YFP（绿色）和免疫染色（红色）如A所示。Tom20与MARCH5蛋白的共定位程度是使用图像分析软件Volocity（B）进行的。B中显示的值表示Pearson相关单位（r），它显示了共焦图像不同通道中像素的关联程度。（C） Myc-tagged野生型MARCH5和MARCH6的寡聚状态^H43瓦用化学交联剂BMH或溶剂DMSO处理的细胞进行Western blot分析。对富含线粒体的重膜组分（HM）进行SDS-PAGE和Western blot分析。用抗Myc单克隆抗体检测到MARCH5。用抗Hsp60单克隆抗体控制负荷。星号代表非特定带。

接下来，我们研究了MARCH5环结构域的抑制是否会影响该蛋白的寡聚化，这可能有助于线粒体上的局部外观。为此，用化学交联剂双马来酰亚胺己烷（BMH）处理富含线粒体的重膜组分（HM）并对Myc-tagged MARCH5进行Western blot分析(图4C). 我们发现，与野生型MARCH5（主要检测为33-kD单体和～65-kD形式）相比^H43瓦也形成了高分子量的配合物。MARCH5的～65-kD形式很可能代表该蛋白的同型二聚体（图S4）。含有MARCH5 RING突变的高分子量复合物的分子成分目前尚不清楚。然而，这些结构很可能有助于MARCH5 RING突变亚线粒体病灶的形成。MARCH5 RING突变体的亚线粒体定位和寡聚化与野生型蛋白质相比的差异表明，含有非活性MARCH6及其底物的蛋白质复合体稳定和/或异常增大，可能是由于泛素化受到干扰。

MARCH5环结构域突变导致裂变蛋白Drp1的线粒体组装异常

我们研究了某些OMM相关蛋白，包括参与线粒体形态发生的蛋白，是否也在MARCH5中积累^H43瓦-和3月5日^C65S、C68S-丰富的线粒体聚集体。转染MARCH5-YFP和MARCH5的细胞^H43瓦-YFP在与编码OMM、OMP25和Fis1的Myc标记整合膜蛋白的哺乳动物表达载体共转染或不共转染的情况下，用抗Myc抗体或检测内源性Tom20、Tom22、嗜内素B1和Drp1的抗体进行免疫染色。尽管Tom20的分布发生了变化(图4 A)未发现Tom22、OMP25和嗜内素B1以及YFP标记的线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2（未发表的数据），裂变蛋白Drp1的异常定位模式明显(图5，A–B′). 在最极端的情况下，发生在MARCH5程度高的细胞中^H43瓦-观察到YFP表达，Drp1的核周簇形成极度扩大（图S5A，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200611064/DC1). 符合MARCH5^H43瓦，MARCH5的表达^C65S、C68S-YFP还诱导Drp1线粒体聚集异常(图5，C和C′). 此外，共焦分析(图5，B–C′)皮尔逊相关值的量化(图5D)表达MARCH5的细胞^H43瓦-YFP或MARCH5^C65S、C68S-YFP和Drp1染色显示这些蛋白质有明显的共定位(图5D)表明MARCH5参与了Drp1的调节。然而，裂变蛋白Fis1(Yoon等人，2003年;Stojanovski等人，2004年)未定位于这些MARCH5/Drp1-阳性结构（图S5 B）。因为在线粒体断裂的早期，酵母Fis1p需要募集Dnm1p(Shaw和Nunnari，2002年)，MARCH5可能参与人类Fis1下游的线粒体断裂。

在单独的窗口中打开

图5。

Drp1与MARCH5 RING突变体的线粒体复合物共定位。转染MARCH5-YFP（A；绿色）、MARCH5的细胞^H43瓦-YFP（B；绿色）和3月5日^C65S、C68S-对YFP（C；绿色）进行Drp1（红色）免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。A–C中的插入物显示了各个细胞的放大片段（白色方块）。使用蔡司LSM510软件（A′-C′）测量位于相应图像中所示细胞区域的Drp1（红线）和MARCH5变体（绿线）的相对荧光强度。注意，MARCH5和Drp1系在MARCH5 RING突变体表达细胞中可以高度重叠。利用Volocity软件（D）的共定位功能分析了Drp1与MARCH5不同变体共定位的总体程度。所示值代表皮尔逊相关单位（见正文）。如前所述获得的Drp1 RNAi（E、F和H）和对照RNAi细胞（G和H）(Lee等人，2004年)，转染MARCH5-YFP（E和H）和MARCH5^H43瓦-YFP（F–H），对Tom20进行免疫染色，以显示OMM（叠加图像中的红色），并通过共焦显微镜进行分析。E和F中的底部面板显示放大的单元格碎片，用红色方块表示。箭头表示过氧化物酶体、箭头线粒体^H43瓦用Tom20作为对照RNAi和Drp1 RNAi细胞进行定量（H）。关联度以皮尔逊相关单位（r）表示。

Drp1同源物、动力蛋白和动力蛋白介导的内吞囊泡断裂的膜移位受GTP的结合和水解调节(欣肖，2000;Praefcke和McMahon，2004年). 因此，我们测试了Drp1与MARCH5的共定位是否依赖于Drp1 GTPase活性。细胞与MARCH5共转染^H43瓦-YFP和GTPase-非活动Drp1^K38A公司，对Drp1进行免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。如前所示(Yoon等人，2001年)不同于过度表达的野生型Drp1，它能正确定位于小的亚线粒体病灶(Smirnova等人，2001年;Karbowski等人，2002年)，图纸1^K38A公司形成仅与线粒体部分相关的扩大聚集体。我们发现这些Drp1^K38A公司包含结构不与MARCH5同位^H43瓦-YFP（图S5 C），而过表达的野生型Drp1确实如此（未发表的数据）。这表明Drp1的GTPase活性是其转位到MARCH5所必需的^H43瓦-在OMM上富集YFP的复合物。有趣的是，Drp1没有可检测到的作用^K38A公司野生型MARCH5-YFP和MARCH5的亚线粒体定位^H43瓦-YFP公司。相反，Drp1表达的下调导致MARCH5的重新分布^H43瓦-来自foci的YFP(图5 G)线粒体定位更为分散(图5、E和F)与Tom20共定位的程度显著高于在对照RNAi细胞中表达的Tom20(图5 H). 这表明3月5日^H43瓦-YFP集群在某种程度上依赖于Drp1。然而，免疫荧光和Western blot（未发表的数据）显示，MARCH5 RNAi并未诱导Drp1异常分布。总的来说，这些数据表明MARCH5和Drp1之间存在功能上的相互依赖性。

MARCH5环结构域突变体稳定线粒体裂变复合体

数据显示MARCH5的表达^H43瓦或3月5日^C65S、C68S对Drp1的定位有很大影响，而且Drp1表达影响MARCH5^H43瓦分布，表明MARCH5参与线粒体裂变复合体的调节。MARCH5线粒体Drp1的异常组织^H43瓦和3月5日^C65S、C68S，但不表达野生型MARCH5的细胞(图5，A–D)，表明依赖于Drp1的裂变循环的某些线粒体步骤之间的转换被MARCH5活性的抑制所阻断。在哺乳动物细胞和酵母中，Drp1/Dnm1p在细胞质和线粒体之间循环(Smirnova等人，2001年;Lesses-Miller等人，2003年). MARCH5突变体表达引起的异常裂变复合物的形成可能是由Drp1的亚细胞动力学变化引起的。为了验证这一假设，YFP-Drp1在表达MARCH5-CFP、MARCH5的细胞中的迁移率^H43瓦-CFP和3月5日^c65、c68-用FRAP分析对照细胞中的CFP（MARCH5/Drp1质粒比率5:1）(图6 A). 我们证实，就像内源性Drp1一样(图5 A)，YFP-Drp1的亚细胞定位被MARCH5 RING突变体的表达所改变，YFP标签不影响这些蛋白质的共定位（未发表的数据）。为了测量FRAP，通过YFP-Drp1表达细胞的4-μm条带通过高功率激光照射进行光漂白，随后在～20 s内监测荧光恢复。恢复曲线被归一化，恢复最快的野生型MARCH5的最后一个时间点值为100%，每个样品的直接漂白后值（1.06s漂白后）为0%。如所示图6 A在表达MARCH5的细胞中，YFP-Drp1组装复合物的迁移率明显下降^H43瓦或MARCH5^C65S、C68S与YFP-Drp1或Drp1和野生型MARCH5共转染细胞相比，有明显差异。

在单独的窗口中打开

图6。

MARCH5 RING突变降低Drp1的细胞流动性。瞬时转染YFP-Drp1的HeLa细胞是否与MARCH5-CFP、MARCH5共转染^H43瓦-CFP和3月5日^C65S、C68S-利用FRAP分析（A）分析CFP中Drp1的细胞迁移率。下图（A）显示了所示实验组在光漂白后1.73 s和19.66 s的平均回收曲线和FRAP值。Western blot（B）分析Drp1与线粒体的关联程度。全细胞裂解物（WCL）和富含线粒体的重膜（HM）组分是从转染Myc-tagged、野生型MARCH5和MARCH6的HeLa细胞中获得的^H43瓦使用SDS-PAGE对蛋白质进行解析，然后对Drp1进行免疫染色。用抗Hsp60抗体控制负荷。从表达Myc-tagged、野生型MARCH5和MARCH4的细胞中获得的HM组分^H43瓦也用化学交联剂BMH或溶剂DMSO处理。通过Western blot分析样品的Drp1（C）。

我们还测试了MARCH5活性对表达水平、线粒体关联的影响(图6 B)和齐聚反应(图6 C)内源性Drp1。从表达Myc-tagged、野生型MARCH5或MARCH4的HeLa细胞获得的全细胞裂解物（WCL）和重膜（HM）组分^H43瓦通过蛋白质印迹进行分析(图6 B). 数据表明，虽然Drp1的总表达水平不受MARCH5 RING结构域活性的影响，但与线粒体相关的Drp1数量在MARCH5RING中略有增加^h43瓦-表达细胞，在表达野生型MARCH5的细胞中表达程度较低(图6 B). 获得了这些分析中使用的WCL和HM馏分。因此，可以得出结论，MARCH5 RING突变体影响Drp1的细胞动力学，但不影响该蛋白的降解（另请参阅图2 A). 接下来，为了揭示线粒体相关Drp1的寡聚状态，HM组分的小份也用BMH处理(图6 C). 使用这种方法，我们没有发现Drp1齐聚反应中有任何明显的变化。这些数据表明，形成光学显微镜可检测的Drp1复合物的亚基的组织不受MARCH5活性的影响。

总之，我们得出结论，Drp1的细胞流动性，而不是蛋白酶体依赖的该蛋白降解受MARCH5活性的调节。

MARCH5环突变体逆转Mfn1和Mfn2敲除细胞线粒体缺陷

据报道，除了Drp1和Fis1(Nakamura等人，2006年;Yonashiro等人，2006年)，线粒体分裂所需的蛋白质，MARCH5也与Mfn2共免疫沉淀(Nakamura等人，2006年)，一种线粒体融合蛋白。因此，我们分析了野生型MARCH5和MARCH6的影响^H43瓦Mfn2蛋白酶体依赖性降解的表达(图7 A). 为了抑制蛋白酶体依赖的Mfn2降解，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。从MG132处理或未处理的表达Myc-tagged、野生型MARCH5或MARCH4的HeLa细胞中获得富含线粒体的HM组分^H43瓦虽然蛋白酶体活性是Mfn2降解所必需的，但MARCH5对MG132处理或未处理细胞中的Mfn1水平没有影响(图7 A).

MARCH5对线粒体分裂和融合的相对贡献尚不清楚。通过分析野生型MARCH5和MARCH5RING突变体是否可以补充Mfn1（Mfn1KO）和Mfn2（Mfn 2KO）敲除MEF中的线粒体缺陷，我们测试了MARCH4活性对线粒体分裂与融合的影响程度。研究表明，Mfn1KO和Mfn2KO MEF中异常破碎的线粒体是这些细胞器融合减少和无限制分裂的结果(Chen等人，2003年). Drp1的异位表达^K38A公司是一种强烈的线粒体分裂抑制剂，可逆转Mfn1KO和Mfn2KO细胞的线粒体缺陷(Chen等人，2003年). 这表明这些细胞中线粒体的残余融合足以重建管状线粒体(图7、B和E)当在Mfn1KO或Mfn2KO细胞中表达时，两者均为MARCH5^H43瓦(图7，C–E)和3月5日^C65S、C68S(图7 E)明显逆转线粒体断裂，诱导正常网状线粒体的形成(图7、C和E)或者，在最极端的情况下，诱导异常互联的细胞器(图7、D和E). MARCH5 RING突变体诱导Mfn1KO和Mfn2KO细胞中网状线粒体的重建表明，MARCH5 RING结构域的活性是线粒体膜动力学的重要决定因素。

因为MARCH5与线粒体融合蛋白Mfn2共免疫沉淀(Nakamura等人，2006年)，可能由于Mfn1和Mfn2之间的部分功能冗余(Chen等人，2003年)MARCH5 RING突变体可刺激Mfn1KO细胞中Mfn2的活性，以及Mfn2KO细胞的Mfn1活性。因此，我们测试了线粒体融合对MARCH5 RING突变诱导的Mfn2KO细胞线粒体伸长的相对贡献(图8). 我们测量了对照Mfn2KO细胞的线粒体融合(图8、A和D)，在表达MARCH5的Mfn2KO细胞中^h43瓦(图8、C和D)使用基于mito-PAGFP的分析(Karbowski等人，2004年). 作为阳性对照，我们使用体外表达Mfn2的Mfn2KO细胞(图8、B和D). 如图所示，在ROI光激活后的不同时间点量化线粒体融合的相对速率(图8). ROI光激活后45分钟，Mfn2KO MEF中的mito-PAGFP荧光稀释度因Mfn2的异位表达而显著增加(图8、A、B和D; Δ_{mito-PAGFP荧光}与Δ相比，Mfn2KO MEF中约28.5%_{mito-PAGFP荧光}～表达Mfn2的Mfn2KO MEF中76%；P=1.176×10⁻¹⁸). 这些数据表明，Mfn2KO细胞中的线粒体融合是通过Mfn2的重新表达而重建的。相反，Mfn2KO MEF中的线粒体融合仅因MARCH5的表达而略有改善^H43瓦(图8、A、C和D; 光活化后45分钟Δ_{mito-PAGFP荧光}～39.7%的Mfn2KO MEF表达MARCH5^H43瓦; P=0.026）。这些3月5日^H43瓦-Mfn2KO MEF中线粒体融合的诱导改善表明，MARCH5活性在一定程度上可以调节线粒体融合。然而，我们发现MARCH5 RING突变体对Drp1 RNAi细胞线粒体形态没有额外影响(图5 F)，而Mfn2的过度表达显著延长了Drp1活性缺陷细胞中的线粒体(桑特尔和富勒，2001年). 因此，可以得出结论，MARCH5 RING突变体主要通过抑制线粒体分裂来重建Mfn1KO MEF和Mfn2KO MEFs中的管状线粒体。

在单独的窗口中打开

图8。

MARCH5的影响^H43瓦Mfn2KO细胞线粒体融合率。Mfn2KO MEFs（A和D）、Mfn2-KO MEF体外表达Mfn2（B和D）或MARCH5的线粒体融合^H43瓦-CFP（C和D）采用基于mito-PAGFP稀释法进行分析。包含光激活的mito-PAGFP（红色方块）的细胞区域的详细信息显示在相应图像下方。用较高的探测器增益获得了光激活前的细胞图像。对实验时间内有丝分裂PAGFP的稀释率进行定量（D）。数据被归一化，光活化后30秒的mito-PAGFP荧光为100%。数据表示62（Mfn2KO细胞）和53（Mfn 2KO表达MARCH5的细胞）的平均值±SD^H43瓦)和32个（Mfn2KO细胞体外表达Mfn2）ROI测量值（D）。

哺乳动物表达载体、诱变和RNA干扰

人类MARCH5（GenBank/EMBL/DDBJ登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_017824”，“term_id”：“1519311600”，“term_text”：“NM_017824“}}NM_017824)使用来自IMAGE克隆#3905766（Invitrogen）的校对聚合酶Pfx（Invit罗gen）用以下引物进行扩增：5′-ATCGCTCTCGACATGCCGGACCACCTATA-3′和5′-ACTAGGATCTCTTCTTGCTGGATAATT-3′，并克隆到YFP-N1和YFP-C1的XhoI和BamHI位点（BD Biosciences）以生成YFP-MARCH5和MARCH5-YFP。3月5日^h43瓦-YFP和MARCH5^C65S、C68S-使用诱变引物：5′-GAGGATCTACAAAAAATGGGTGTGGCAGCTTCTAACGCTGGGTG-3′和5′-CACACAGCGTGTAGACAAGCTGCCAAACCATTTTGTAGATCC-3′为MARCH5生成YFP^H43瓦-和MARCH5的YFP和5′-GTACAGCCAGAGTGCATCTCCATGCACAATGGCTGAATACTAATAG-3′和5′-CTATAGGTATTCACACATGCAGATGCACACTGGCTGTAC-3′^C65S、C68S-YFP和Pfu聚合酶（Stratagene），以MARCH5-YFP为模板。3月5日^Δ1-71使用以下引物获得：5′-ATCGCCATG GCTGAATACCTAGTTTTTCC-3′和5′-ACTAGGGATCCGTCTTTGTTCTGGATATT-3′，并将XhoI/BamHI克隆到YFP-N1中，生成MARCH5^Δ1-71-YFP公司。所有结构均通过测序进行验证。小鼠Mfn2表达载体(Chen等人，2003年)由D.Chan（加利福尼亚州帕萨迪纳加州理工学院）提供。

如前所述进行短发夹RNAi(Lee等人，2004年). 用于MARCH5 shRNAi生成的寡核苷酸为：5′-CTGGAATTCGAGAGAACACTACTGAAGTTGATAGTGTTCTTCGAATTAGTTTTTTTTTG-3′和5′-GATCCAAAAACAATATATTCGAAACAAGACACACCTAGCTTCATAGGTTCCTCGAATTCCAGCG-3′。如前所述，使用Drp1 shRNAi和对照GFP shRNAi-生成载体(Lee等人，2004年).

共焦显微镜分析

为了进行共聚焦显微镜分析，细胞培养在2孔硼硅酸盐盖玻片（Nunc）中。使用LSM510 Meta成像站（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）拍摄图像。用100×/1.4彩色校正的Plan-Apochromat（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）物镜采集免疫染色固定细胞的图像。对于活细胞成像，细胞在35°C下保持不超过30分钟，并使用100×/1.45α-Plan-FLUAR物镜（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）成像。如前所述，对线粒体体积进行FRAP分析(Szabadkai等人，2004年;Karbowski等人，2006年)，除非另有说明。使用YFP-Drp1的FRAP分析来确定Drp1的亚细胞迁移率。用YFP-Drp1和CFP融合MARCH5构建物以1:5的摩尔比共同转染细胞。在YFP-Drp1表达细胞中，使用30.0-mV氩激光将4μm条带光漂白，激光功率输出为50%，传输为100%。随后，用相同的激光器将YFP-Drp1荧光恢复的12位延时图像采集设置为50%的激光功率输出和1%的透射。在光漂白后以400 ms的间隔进行了19.66 s的时间间隔成像。探测器增益保持在最亮结构饱和以下的水平，从而导致主要聚焦的Drp1的FRAP。FRAP曲线是使用LSM510软件（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）获得的。如前所述，对线粒体基质靶向光活化GFP（mito-PAGFP）进行了光活化研究(Karbowski等人，2004年). 对于共转染细胞的有丝分裂-PAGFP和FRAP分析，通过CFP荧光鉴定表达WT MARCH5和MARCH5RING突变体的细胞。

免疫荧光和共定位分析

细胞在PBS中用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.15%Triton X-100渗透20分钟，然后在室温下用10%BSA封闭45分钟。然后在RT下对细胞进行90分钟的免疫染色，或在4°C下用以下主要抗体进行过夜：抗细胞色素c（c）单克隆抗体（BD Biosciences；1:250）、抗Tom20单克隆抗体（BD Biosciences；1:250）、抗Tom20多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.；1:500）、抗Dlp1单克隆抗体（Drp1；克隆8；BD Biosciences；1:1000）和抗Myc单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，1:1000）。在室温下用AlexaFluor（488、546和633）共轭二级抗体（BD Biosciences；1:250）清洗细胞并染色1小时。对于共定位分析，使用覆盖细胞整个深度的12位共焦z截面投影，间隔为0.25μm。所有实验组的图像都是在共焦显微镜的相同设置下获得的，除了在绿色通道中进行探测器增益调整以使饱和水平正常化之外。使用Volocity软件（Improvision）的同位菜单分析图像。创建覆盖细胞整个区域的ROI，然后调整红通道下限，以排除进一步分析中的背景染色。共定位统计数据由ROI中包含的点确定，并表示为Pearson相关值，该值在-1和1之间变化。皮尔逊相关性反映了两个变量之间的线性关系。当应用于图像分析时，它可以用于确定共焦图像不同通道像素关联的统计显著性，从而确定细胞中不同蛋白质的共定位程度。相关性为零表示变量之间没有线性关系，而相关性为1表示完全正线性关系。

MARCH5抗体生成

为了生产抗体，使用5′-AACTAGCATGCCGGACCAAGCTACA-3′和5′-ACTAGGATCTTATGCTTTCGTTCTGGATA-3′扩增全长MARCH5，并使用NdeI/BamHI将其克隆到pET15b（CLONTECH Laboratories，Inc.）中以获得pET15b-MARCH5。大肠杆菌用pET15b-MARCH5转化。包含全长的包涵体^HIS6系列根据制造商的建议，分离MARCH5并将其溶解在变性结合缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，500 mM NaCl，40 mM咪唑和6M盐酸胍）中，并使用HISTrap HP（GE Healthcare）进行纯化。^HIS6系列利用重折叠缓冲液（20 mM Tris、pH 8.0、500 mM NaCl、500 mmM精氨酸/HCl和0.2%Triton X-100）透析重折叠MARCH5。使用重组全长抗体提高MARCH5特异性抗体^HIS6系列将MARCH5注射到新西兰白兔体内。使用^HIS6系列根据制造商的建议，MARCH5与HiTra NHS激活的HP（GE Healthcare）绑定。使用相同的方案获得抗Mfn2多克隆抗体，并使用1-405 Mfn 2片段免疫兔子。

细胞分馏、化学交联和Western blot

为了进行Western blot分析，HeLa细胞转染了^Myc3型3月5日，^Myc3型3月5日^H43瓦或对照载体（YFP-N1；CLONTECH Laboratories，Inc.），根据制造商的建议使用Effectene（QIAGEN）。转染后18 h收集细胞，然后将其悬浮在细胞裂解缓冲液中（250 mM蔗糖、20 mM Hepes/KOH、pH 7.5、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂1 mM EDTA、1 mM EGTA和完整蛋白酶抑制剂[Roche]）。通过25号针头（使用1毫升注射器）通过15个通道破坏细胞。重膜分数（HM）通过10000离心获得克在交联实验中，HM部分在裂解缓冲液中再次悬浮，并在冰上培养30分钟，用1 mM BMH（Pierce Chemical Co.）或DMSO作为对照。通过添加100 mM甘氨酸停止反应，样品在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，并通过Western blot进行分析。Western blot分析中使用的商业抗体为：抗Drp1（Dlp1）单克隆抗体（克隆8；BD Biosciences）、抗Hsp60单克隆抗体、抗α-微管蛋白单克隆抗体和抗Fis1多克隆抗体（Biovision）。

我们感谢David Chan博士赠送Mfn1和Mfn2敲除细胞，感谢小鼠Mfn 2构建物，感谢Zheng Li博士批判性阅读手稿，感谢Kristi Norris和DerFen Suen博士提供Mfn 2中抗体，感谢Pascaline Clerc博士帮助定量化共定位数据，感谢Carolyn Smith博士帮助共焦显微镜，NINDS DNA测序设施和苏珊·史密斯寻求技术援助。

这项工作得到了国立卫生研究院（NINDS）校内研究计划的支持，以及马里兰大学生物技术研究所（M.Karbowski）的机构支持。