肿瘤。2007年10月；9(10): 862–870.
基质细胞衍生因子-1促进结肠转移的细胞迁移和肿瘤生长1
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奥托·科尔马尔
*德国萨尔州洪堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
凯瑟琳·鲁珀特斯
*德国萨尔州洪堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
克劳迪娅·谢尔
†德国洪堡萨尔大学临床和实验外科研究所，D-66421
巴斯蒂安·容克
*德国萨尔州洪堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
贝蒂娜·蒂尔顿
*德国萨尔州霍姆堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
马丁·K·席林
*德国萨尔州洪堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
迈克尔·D·门格尔
†德国洪堡萨尔大学临床和实验外科研究所，D-66421
*德国萨尔州洪堡D-66421萨尔大学普通外科、内脏外科、血管外科和儿科
†德国洪堡萨尔大学临床和实验外科研究所，D-66421
2007年7月5日收到；2007年8月15日修订；2007年8月20日接受。
版权©2007 Neoplasia Press，Inc.版权所有 摘要
在已建立的肝外结肠直肠癌转移小鼠模型中，我们分析了基质细胞衍生因子（SDF）1是否刺激肿瘤细胞迁移在体外血管生成和肿瘤生长体内。
方法
利用趋化室，研究了CT26.WT大肠肿瘤细胞在不同浓度SDF-1刺激下的迁移。评估血管生成和肿瘤生长体内，将绿色荧光蛋白转染的CT26.WT细胞植入同基因BALB/c小鼠的背侧皮褶腔中。5天后，肿瘤局部暴露于SDF-1。使用活体荧光显微镜、组织学和免疫组织化学方法，在接下来的9天内研究细胞增殖、肿瘤微血管化和生长。暴露于PBS的肿瘤仅作为对照。
结果
体外>30%的未刺激CT26.WT细胞表达SDF-1受体CXCR4。在趋化性试验中，SDF-1引起细胞迁移的剂量依赖性增加。体内，SDF-1加速了新生血管的形成，并诱导了肿瘤生长的显著增加。SDF-1治疗的肿瘤毛细血管明显扩张。有趣的是，SDF-1治疗与增殖细胞核抗原的显著增加表达和裂解caspase-3的下调相关。
结论
我们的研究表明CXC趋化因子SDF-1促进肿瘤细胞迁移在体外和已确立的肝外转移的肿瘤生长体内由于血管生成依赖性诱导肿瘤细胞增殖和抑制凋亡细胞死亡。
关键词：癌症、转移、趋化因子、SDF-1、血管生成
介绍
结直肠癌是全世界男性和女性癌症相关死亡的主要原因之一。死亡通常是由无法控制的转移性疾病引起的。肝脏是最常见的转移部位，手术切除是治疗的唯一选择，5年总生存率高达58%[1–4]. 相比之下，肝外转移的表现长期以来被认为是肝脏病变切除的禁忌症。然而，最近的一些研究表明，肝和肝外结直肠癌转移瘤连续切除后，有希望的5年生存率约为30%[5–7].
转移过程包括一系列单独的步骤，这些步骤都是建立转移性肿瘤所必需的[8、9]. 而众所周知，趋化因子及其受体作为一种生理机制参与造血细胞向特定器官的“归巢”[10]，归巢在肿瘤细胞中也有功能[11]. 最近的研究表明，肿瘤细胞表达趋化因子受体的模式，相应的配体在这些癌症通常转移的器官中特异表达。例如，乳腺癌细胞和原发性乳腺癌已被证明表达趋化因子受体CXCR4，而特异性配体CXCL12，也被称为基质细胞衍生因子（SDF）1，在淋巴结、肺、肝、，以及代表乳腺癌第一个转移部位的骨髓组织[12]. 其他人也推测CXCR4参与不同类型恶性肿瘤的转移生长，包括结直肠癌[13–15]. 如Ottaiano等人所示[15]原发性肿瘤和转移性肿瘤中CXCR4和血管内皮生长因子（VEGF）表达的缺乏是结直肠癌患者无病生存的一个强有力的预后因素[16].
尽管一些研究表明CXCR4受体可能参与结直肠癌的转移过程，但SDF-1的功能作用尚未确定。因此，通过使用小鼠结肠癌模型，我们研究了SDF-1是否影响已建立的肝外转移的血管生成过程和肿瘤生长体内。
材料和方法
肿瘤细胞系及培养条件
CT26细胞系是一种N个-亚硝基-N个-甲基氨基甲酸诱导的未分化结肠腺癌，与BALB/c小鼠同系。在我们的研究中，CT26.WT细胞系（ATCC CRL-2638；LGC Promochem GmbH，Wesel，Germany）在含有2 mM我-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany）补充10%胎牛血清（FCS Gold；PAA Laboratories GmbH（德国科尔贝））、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（PAA Laburatories GmbH）。细胞在37°C的含5%CO的增湿空气中培养2根据制造商的说明，使用CLONfectin（Clontech，Palo Alto，CA），用增强型绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-N1（Clonteh）转染CT26.WT细胞[17]. 通过克隆进行GFP转染。对于个人在体外和体内实验中，只使用了冷冻后前三代连续传代的细胞。植入当天，通过胰蛋白酶（0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA；PAA Laboratories GmbH）从亚流培养物（70-85%）中采集CT26.WT-GFP细胞，并在磷酸盐缓冲盐（PBS）溶液中洗涤两次。
CT26.WT细胞的流式细胞术分析
进行FACScan（加州山景城Becton Dickinson）分析，以评估三份CT26.WT和CT26.WT-GFP细胞上趋化因子受体CXCR4的表达。胰蛋白酶化后，将细胞固定在1 ml Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences，Heidelberg，Germany）中4°C下20分钟，用Perm Wash（BD bioscience）清洗两次，并在室温下用多克隆羊抗鼠CXCR4抗体培养40分钟（德国海德堡圣克鲁斯）或同种型匹配的对照抗体（Dianova，Hamburg，Germany）。使用兔抗羊Cy3-结合抗体（1:25；Dianova）进行荧光标记。为了去除多余的抗体，再次清洗细胞，然后将其保存在PBS中的1%多聚甲醛中。使用荧光标准微球（CaliBRITE Beads；BD Biosciences）校准流式细胞仪，以准确设置仪器。使用CellQuest数据处理程序（BD Biosciences）对肿瘤细胞的荧光特性进行选择性分析，每个样本评估5000个事件。
细胞迁移分析
使用24孔趋化室和孔径为8-µm的聚乙烯吡咯烷酮涂层聚碳酸酯过滤器（德国海德堡BD Falcon）评估CT26.WT细胞的迁移能力。趋化性试验一式三份。将在PBS中用0.1%BSA（Sigma-Aldrich Chemie GmbH）稀释的趋化剂SDF-1（重组小鼠SDF-1α/CXCL12，no.460-SD；R&D Systems，Wiesbaden，Germany）以0.1、1、10、100、200和400 nM的浓度添加到700µl RPMI 1640培养基的下部微孔中。单用0.1%BSA的PBS作为对照。500微升含1 x 10的细胞悬液5将RPMI 1640中的细胞添加到每个上部微孔中。然后，在37°C下，在含5%CO的湿润气氛中培养该室24小时2培养后，从过滤器的上表面去除非迁移细胞，粘附在下表面的迁移细胞用甲醇固定并用Dade Diff-Quick染色（德国慕尼黑Dade Diagnostika GmbH）。在10个高倍显微镜场中计算这些迁移细胞的数量。此外，收集迁移到下孔的细胞并用FACScan流式细胞术进行计数。粘附在过滤器下表面的迁移细胞表示为每10个高功率场的细胞数；迁移到下孔的细胞表示为每个孔的细胞数。
动物
实验经当地政府伦理委员会批准后进行，并符合英国癌症研究协调委员会实验性肿瘤动物福利指导原则（如1998年所述英国癌症杂志 77，1-10）和《实验动物护理和使用指南》（国家研究委员会实验动物资源研究所；NIH指南，第25卷，第28号，1996年）。使用体重为18至22克的12至16周龄雌性BALB/c小鼠（Charles River Laboratories GmbH，Sulzfeld，Germany）。动物在室温（22–24°C）和相对湿度（60–65%）下，在12小时的光/暗循环环境下，被安置在单笼中。小鼠被允许自由饮用水和标准实验室食物（德国拉格阿尔特罗姆）。
实验模型
在手术过程中，通过腹腔注射90 mg/kg体重的氯胺酮（Ketavet；Parke Davis，Freiburg，德国）和20 mg/kg体重（Rompun；Bayer，Leverkusen，德国）对动物进行麻醉。如前所述，为了对生长中肿瘤的微循环进行重复分析，将背皮褶腔模型用于活体显微镜检查[18]. 该腔室由两个对称的钛框架（重3.2克）组成，用于夹住背部皮肤的扩展双层。在直径为15 mm的圆形区域中完全去除一层。剩下的几层，包括表皮、皮下组织和横纹皮肤肌肉，用一块玻璃盖玻片覆盖在其中一个钛框架上[19]. 这些动物对房间的耐受性很好，没有任何不适或睡眠和饮食习惯改变的迹象。经过48小时的恢复期后，暂时取下腔室的盖玻片，并取下1 x 105细胞被植入腔室内横纹肌组织的表面。细胞植入后，立即用盖玻片再次覆盖心室组织[20].
实验方案
16只动物接受了肿瘤细胞移植。5天后（第0天），将动物分为两组。打开背部皮褶室，局部应用SDF-1（SDF-1；n个= 8). 最终制剂中的浓度为100 nM。这种浓度直接暴露在背部皮褶室的组织中。因此，这也是治疗时皮肤褶皱室中的浓度。只接受PBS的动物作为对照组（对照组；n个= 8). 所有动物在暴露-SDF-1前以及暴露后2、4、7和9天直接进行重复的活体显微镜分析。实验结束时，收集装有肿瘤组织的腔室进行组织学和免疫组化。
活体内荧光显微镜
使用改进的蔡司Axio-Tech显微镜（德国奥伯科钦蔡司）和100-W HBO汞灯，通过外照射技术进行活体荧光显微镜检查。显微镜图像由电荷耦合设备摄像机（FK 6990，COHU；Prospective Measurements，Inc.，San Diego，CA）监控，并传输到视频系统（VO-5800 PS；Sony，Munchen，Germany）进行后续离线分析。使用蓝光外照射（激发波长450-490 nm；发射波长>520 nm）分析肿瘤大小、生长动力学和新生血管[21].
微循环分析
通过使用计算机辅助图像分析系统（CapImage；Zeintl Software，德国海德堡）对录像图像进行逐帧分析，离线评估微循环参数。数据分析由对治疗一无所知的检查人员进行。
肿瘤细胞的荧光标记允许从周围未受影响的宿主组织精确描绘肿瘤。在每个观察时间点，首先扫描腔室内荧光标记肿瘤块的表面，以确定肿瘤大小（以平方毫米表示肿瘤面积）。接下来，在肿瘤边缘随机选择八个感兴趣区域（ROI）。在这些ROI中，新生血管的开始（即新生血管芽、芽和血管的发育）被记录下来，并从0到8进行评分，其中0=ROI无新生血管和8=所有ROI中的新生血管[22]. 功能毛细管密度（cm/cm2)肿瘤微血管的长度，定义为每个观察区域内红细胞灌注毛细血管的长度[23]在肿瘤边缘的八个ROI内和肿瘤中心的四个额外ROI内进行分析。新形成的肿瘤微血管的直径是垂直于血管通路测量的，以微米表示[17].
组织学和免疫组织化学
实验结束时（第9天），采集肿瘤和邻近宿主组织。在光学显微镜下，福尔马林固定活组织切片包埋在石蜡中。按照标准程序，切割五个显微镜切片，并用苏木精-伊红染色进行常规组织学检查。测量肌肉层的肿瘤细胞浸润，并将其表示为肿瘤基底长度的百分比[24].
为了研究细胞增殖和凋亡细胞死亡，用间接免疫过氧化物酶技术对增殖细胞核抗原（PCNA）和裂解caspase-3进行染色。因此，脱蜡切片用3%H培养2O（运行）2和2%山羊正常血清阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合位点。使用单克隆小鼠抗泛PCNA抗体（PC10，1:50；德国汉堡DakoCytomation）和多克隆兔抗小鼠裂解caspase-3抗体（Asp175，1:50，德国法兰克福Cell Signaling Technology）作为主要抗体[25]. 裂解的caspase-3抗体仅检测激活的caspase-3的短片段（17/19 kDa）的内源性水平，而不检测全长caspase 3。使用生物素化的山羊抗小鼠和山羊兔Ig抗体作为链亲和素-生物素复合物过氧化物酶染色的第二抗体（1:200，LSAB 2 System HRP；DakoCytomation）。以3,3′-二氨基联苯胺（DakoCytomation）为显色剂。切片用Mayer血肿染色进行复染，并用光学显微镜检查。
为了评估趋化因子受体CXCR4的表达，将肿瘤切片包埋在组织冷冻培养基（Jung；Leica Microsystems，Nussloch，德国）中进行免疫组化，snap冷冻在液氮中，并保存在-80°C。切割五个微米的冷冻切片，在4℃冷丙酮中固定5秒，在4%福尔马林中固定10分钟，并用2%的正常驴血清封闭。然后用多克隆山羊抗小鼠CXCR4抗体（1:10；Santa Cruz）培养组织切片。使用驴抗羊IgG HRP结合抗体（1:500；德国弗赖堡Amersham）作为二级抗体。以3,3′-二氨基联苯胺为显色剂。切片用Mayer血肿染色进行复染，并用光学显微镜检查。
作为阴性对照，在相同条件下，将每个样本的额外切片暴露于适当的IgG等型匹配抗体（Sigma-Aldrich Chemie GmbH），而不是一级抗体，以确定抗体结合的特异性。所有对照染色均为阴性。
统计分析
所有值均表示为平均值±SEM。在证明各组间方差的正态性和同质性假设后，通过嵌套设计对研究组进行比较，包括方差分析和事后（post-hoc）根据Bonferroni概率与α误差校正进行比较，以补偿多次比较。统计显著性设置为P（P）< .05. 使用软件包SigmaStat（SPSS，Inc.，芝加哥，IL）进行统计分析。
结果
体外试验FACScan分析和迁移分析
FACScan分析显示31.5±2.5%的CT26.WT细胞为CXCR4受体阳性(). 用增强的GFP表达载体pEGFP-N1转染CT26.WT-GFP细胞后，CXCR4的表达量相当（32.2±4.3%）(). 在细胞培养中，两种细胞系在7天的观察期内具有相似的生长特征().
对CT26.WT（A和C；白色方块）和CT26.WT-GFP（B和D；黑色方块）细胞的FACScan分析显示，趋化因子受体CXCR4（C和D）的阳性染色细胞为～30%。同型配对对照抗体作为阴性对照（a和B）。注意，GFP转染细胞和未转染细胞之间CXCR4的表达没有差异。在7天的观察期内（E），这两个细胞系表现出可比的生长特征。数据表示为平均值±SEM。
迁移实验表明，只有少数细胞在对照条件下迁移（即PBS刺激；). 0.1 nM剂量的SDF-1在聚碳酸酯过滤器处诱导细胞迁移增加3.4倍。使用1 nM SDF-1时，这种迁移最为明显，与对照组相比增加了4.3倍(). 值得注意的是，SDF-1浓度的进一步增加导致粘附在迁移室过滤器下表面的细胞数量显著减少。对通过过滤器迁移至下孔的细胞数量的分析表明，与PBS对照组相比，低剂量SDF-1刺激（0.1–100 nM）后，细胞数量增加了2倍至6倍，而高剂量200和400 nM导致细胞数量指数增加（16倍至17倍().
细胞迁移分析包括趋化室和孔径为8-µm的聚乙烯吡咯烷酮涂层聚碳酸酯过滤器。请注意，只有少数细胞在控制条件下迁移（a和B中的控制），而低剂量（1 nM）SDF-1的刺激使粘附在过滤器下表面的迁移细胞比例（a）增加最明显。相反，对细胞迁移到下孔（B）的分析显示，SDF-1暴露后，细胞迁移量呈剂量依赖性增加。数据表示为平均值±SEM。
肿瘤生长
背皮褶腔植入和肿瘤细胞植入均不影响BALB/c小鼠的一般状况。所有动物术后恢复顺利，在14天的时间内，它们耐受良好的活体荧光显微镜观察。结肠直肠CT26.WT-GFP细胞在背侧皮褶腔中的摄取率为100%。在两组的整个观察期内，活体内荧光显微镜显示肿瘤进行性生长(,A类和B类). 与PBS对照组相比，第0天局部应用SDF-1可显著加速肿瘤生长。这表现为在9天的观察中，晚期肿瘤面积增加().
CT26.WT-GFP细胞植入BALB/c小鼠后背皮褶腔内肿瘤生长的时间进程。第9天，在第0天进行局部假治疗（A）并暴露于100 nM SDF-1（B）的小鼠的代表性肿瘤的立体显微镜照片。肿瘤面积随时间的定量分析（C）显示，在假手术治疗的对照组（白色圆圈）和接受SDF-1治疗的动物（黑色方块）中，肿瘤都在进行性生长。然而，值得注意的是，与PBS对照组相比，使用SDF-1后肿瘤生长显著增加。数据表示为平均值±SEM。*P<.05与PBS控制。（A和B）原始放大倍数，x4。
新生血管形成
在两组中，分析显示第2天肿瘤边缘内新发育微血管的ROI新生血管率为40%至50%。值得注意的是，在第4天，对照组的这一比率达到了～65%，但在SDF-1治疗后增加到>95%(). 实验结束时，两组的所有ROI均显示肿瘤边缘内有新的血管形成。
通过活体荧光显微镜测定CT26.WT-GFP肿瘤在背侧皮褶腔内新生血管的时间进程和功能性毛细血管密度。荧光显微镜图像显示第4天对照动物（a）和SDF-1处理的动物（B）的肿瘤边缘中的毛细管网络。对新生血管形成开始的分析显示，与PBS对照组相比，对照组肿瘤（白色圆圈）和SDF-1治疗的肿瘤（黑色方块）的新生血管形成加速（C）。对肿瘤边缘内毛细血管密度的分析证实了SDF-1治疗导致的血管加速，如趋化因子暴露（D）后第4天毛细血管密度增加所示。数据表示为平均值±SEM。*P<.05与PBS控制。（A和B）原始放大倍数，x40。
肿瘤的血管网络以新形成的、混乱排列的毛细血管为特征。这些网络的毛细血管密度在肿瘤边缘和肿瘤中心之间没有差异（数据未显示）。然而，有趣的是，与假对照组相比，SDF-1治疗的肿瘤在应用SDF-1后4天肿瘤边缘内形成了更高密度的新形成肿瘤血管(). 实验结束时，两组肿瘤的边缘和中心显示出相似的毛细血管密度。
由于新生血管与血管内皮生长因子的作用导致的血管扩张有规律地相关，因此我们分析了肿瘤血管网络中的毛细血管直径。SDF-1治疗后，肿瘤中心新形成的毛细血管明显(P（P）<.05）在第2天和第4天与对照组相比扩张(). 与肿瘤中心的观察结果相比，肿瘤边缘的毛细血管直径（未显示数据）显示出相同的特征。
通过活体荧光显微镜测定新形成肿瘤血管毛细血管直径的时间进程。治疗诱导后第9天，荧光显微镜图像显示PBS对照动物（a）和SDF-1治疗动物（B）肿瘤中心的毛细血管网络。定量分析显示，与PBS对照组（白色圆圈）相比，SDF-1暴露后的毛细血管直径（黑色方块）显著增大（C）。数据表示为平均值±SEM。*P<.05与PBS控制。（A和B）原始放大倍数，x80。
形态学、增殖、凋亡细胞死亡和CXCR4表达
SDF-1暴露后第9天，肿瘤的苏木精-伊红染色显示，背皮褶腔内有肝外实体生长。与使用SDF-1后肿瘤生长显著增加（在9天的观察期间肿瘤面积增加）相平行，组织学标本的定量分析显示SDF-1治疗后肿瘤生长更具侵袭性，伴有肌肉浸润。与假对照组10.5±6.3%相比，SDF-1暴露后肿瘤基底部浸润23.3±9.5%表明了这一点。
PCNA作为细胞增殖的指标，在对照组中几乎40%的肿瘤细胞显示阳性染色(,A类和电子). 值得注意的是，经SDF-1治疗后，PCNA阳性细胞的比率显著增加至>70%(,B类和电子). 这表明SDF-1直接介导的肿瘤细胞增殖增加。
在PBS（对照；A和C）和SDF-1治疗（SDF-1；B和D）后第9天，CT26.WT-GFP肿瘤中的PCNA（A和B）和裂解caspase-3（C和D）免疫组化。定量分析PCNA阳性细胞的数量（以所有细胞的百分比表示）显示，与对照组的肿瘤相比，SDF-1治疗的肿瘤中的阳性染色细胞显著增多（E）。对裂解caspase-3表达的分析（以所有细胞的百分比表示）表明，与PBS对照组相比，SDF-1治疗后凋亡细胞的数量显著减少（F）。数据表示为平均值±SEM。*P<.05与PBS控制。（A–D）原始放大倍数，x175。
为了研究凋亡细胞的死亡，用免疫组织化学方法检测裂解的caspase-3产物。第9天，可以在肿瘤内观察到少量阳性染色细胞(,C类和天). 有趣的是，定量分析表明(P（P）<.05）与假对照相比，SDF-1应用后凋亡细胞的比例较低().
讨论
本研究的主要发现是SDF-1促进结直肠癌细胞的剂量依赖性迁移在体外和肿瘤生长的实体转移体内。有趣的是体内生长刺激很可能是由血管生成依赖性的肿瘤细胞增殖诱导和凋亡细胞死亡抑制引起的。
尽管许多趋化因子与多个受体结合，而趋化因子受体通常与多个趋化因子结合，但SDF-1仍是CXCR4的唯一已知配体[10,12]. 相反，SDF-1不仅可以绑定到CXCR4，还可以绑定到CX3CR7[26]. SDF-1诱导CXCR4的内化，促进钙动员和有丝分裂原激活的蛋白激酶途径的激活，如ERK-1/2、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）和蛋白激酶B-激酶，这些与细胞迁移、增殖、分化和生存有关[27].
CXCR4被认为通过激活肿瘤细胞的滚动、整合素功能、阻滞和跨内皮迁移，促进肿瘤细胞和内皮细胞之间的相互作用[28,29]. 尽管从未被证明体内，SDF-1被认为可以指导肿瘤细胞的组织内定位，并通过直接影响肿瘤细胞的迁移来诱导转移[30,31]如最近提出的单核细胞趋化蛋白-1 CCL2[32]. 使用非小细胞肺癌细胞系在体外，Phillips等人[33]显示了CXCL12-CXCR4趋化梯度的定向运动，在10 ng/ml SDF-1浓度下迁移的细胞数量最高。与他人一致[34–36]，我们的在体外测定还显示肿瘤细胞迁移对SDF-1的反应呈剂量依赖性增加。这进一步支持SDF-1参与转移性肿瘤生长。
大量先前的研究表明，CXCR4在肿瘤细胞上的过度表达与肿瘤生长增加和癌症表型相关[28,36–38]CXCR4的中和作用抑制生长体内[13,14]. 这些数据表明CXCR4在肿瘤生长和转移中的作用；然而，他们并没有证明SDF-1的功能。事实上，关于SDF-1在致癌作用中的作用，只有很少的信息体内.Orimo等人[39]已经证明抑制乳腺癌细胞的生长体内SDF-1被封锁。相比之下，Phillips等人[33]未能证明SDF-1的中和作用会影响原位或异位部位原发性非小细胞肺癌肿瘤的大小。除了这一争议外，还没有关于直接接触SDF-1如何影响肿瘤生长的信息体内目前的研究结果首次证明SDF-1的应用能够直接促进肿瘤生长体内。
SDF-1如何刺激已确诊肿瘤的生长和转移的机制尚不完全清楚。有证据表明，趋化因子影响细胞增殖和凋亡细胞死亡。在之前的一项研究中，我们已经证明SDF-1刺激可引起ERK-2（一种公认的转录激活剂）和蛋白激酶B的核移位[27]. 其他研究进一步表明，SDF-1诱导有丝分裂原活化的蛋白激酶和Akt活化，但不影响Fas配体诱导的细胞凋亡[35]. SDF-1/CXCR4通路影响侵袭性和微转移性肿瘤细胞的生长[14]，通过抗凋亡AKT激酶反映下游信号[40]和脂质激酶PI3-激酶[41]. 一些证据表明，PI 3-激酶介导的蛋白激酶B激活抑制凋亡并促进细胞存活[42–44]. 此外，ERK-1/2和Akt激活介导抗凋亡途径并增加细胞增殖[40,42]. 虽然所有关于SDF-1/CXCR4通路在细胞增殖和凋亡细胞死亡中的作用的研究都是在在体外设置[35、36]，我们在此首次证明SDF-1能够刺激肿瘤细胞增殖并抑制凋亡细胞死亡体内这些很可能是观察到的趋化因子介导的肿瘤生长刺激的原因。
肿瘤中的新血管生成是由促血管生成因子和血管生成抑制因子过度表达的不平衡决定的。具有高度保守的三氨基酸基序（Glu-Leu-Arg；ELR基序；ELR+)包括CXCL1–3和CXCL5–8（例如MIP-2和IL-8）是有效的启动子，而缺乏ELR基序的CXC趋化因子（ELR-)包括CXCL4是有效的血管生成抑制剂[45]. 尽管SDF-1不是ELR+CXC趋化因子，它被认为通过与其受体CXCR4的相互作用参与介导血管生成[46,47]. SDF-1/CXCR4通路已被证明对发育至关重要，因为缺乏CXCR4或其配体SDF-1的小鼠由于血管系统的主要缺陷而在围产期死亡[48].
Darash-Yahana等人利用前列腺肿瘤[28]已经证明在过表达CXCR4的肿瘤中血管数量增加了4.5倍，并得出结论，这种趋化因子受体的高表达通过增加VEGF的分泌来加速血管生成。CXCR4的中和作用成功地抑制了新血管的形成，这一事实支持了这些结果[13,28].体外研究进一步表明，CXCR4介导肿瘤细胞向SDF-1迁移，这种迁移依赖于自分泌VEGF的表达[46]. 值得注意的是，SDF-1可能影响VEGF的表达。Brand等人[35]已经在结直肠癌细胞系HT-29中证明，SDF-1刺激诱导VEGF mRNA表达的8倍上调和VEGF蛋白水平的5.8倍增加。
Yang等人证实了这些发现[49]在胶质母细胞瘤细胞系中，证明功能性CXCR4的表达与恶性表型相关，并且SDF-1的刺激有助于VEGF的产生在体外据推测，VEGF和SDF-1可能协同诱导肿瘤血管生成[50]. 通过上调CXCR4对血管内皮细胞的作用，VEGF协同SDF-1介导的血管内皮细胞迁移和扩张。Carr等人[51]在在体外主动脉环模型表明，尽管缺乏循环内皮前体细胞，但外源性SDF-1增加了血管萌芽。与此同时，Orimo等人[39]间接实验表明，分泌大量SDF-1的癌相关成纤维细胞通过招募内皮前体细胞促进血管生成。在这些实验中，抑制CXC趋化因子显著降低血管生成反应，这一事实支持了SDF-1在血管生成中的作用[39]. 这些结果与Phillips et al[33]他们证明阻断SDF-1不会影响肿瘤血管化过程。在本研究中，我们通过直接的实验方法证明外源性应用SDF-1确实会影响结肠肿瘤的血管生成和血管形成体内然而，SDF-1并没有诱导新生血管数量的总体增加，而是特别加速了血管形成过程。这种作用很可能与VEGF表达增加有关，因为与PBS治疗的对照组相比，SDF-1治疗的肿瘤显示出显著的血管扩张，这可能是由众所周知的生长因子的延迟作用引起的。
总之，我们已经证明，趋化因子SDF-1通过促增殖和抗凋亡作用以血管生成依赖性的方式促进实体转移瘤的生长。因此，我们的结果表明SDF-1/CXCR4信号通路可能是辅助抗肿瘤治疗的一个有希望的靶点。
鸣谢
我们感谢C.马克思、J.贝克尔和R.M.尼克尔斯的技术援助。
脚注
1本研究得到了萨尔大学研究委员会和医学院的资助（HOMFOR-A/2003/1）。
工具书类
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