美国国家科学院院刊。2007年9月11日；104(37): 14855–14860.
SIRT1通过激活内皮型一氧化氮合酶促进内皮依赖性血管舒张
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伊尔沃拉·马塔加贾辛格
宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学中心心血管研究所，邮编15213
Cuk-Seong Kim先生
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阿斯玛·纳格维
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山森托鲁
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蒂莫西·霍夫曼
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萨特·贝尔·荣格
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杰里米·德里科
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Kenji Kasuno先生
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伊拉克凯科巴德
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路易斯·伊格纳罗（Louis J.Ignarro）编辑，加州大学洛杉矶医学院，2007年7月30日批准
作者贡献：I.M.、C.-S.K.和K.I.设计的研究；I.M.、C.-S.K.、A.N.、T.Y.、T.A.H.、S.-B.J.、J.D.和K.K.进行了研究；I.M.、C.-S.K.和K.I.分析数据；K.I.写了这篇论文。
摘要
热量摄入减少会降低健康人的动脉血压，并改善肥胖和超重人群的内皮依赖性血管舒张功能。SIRT1蛋白脱乙酰酶介导热量限制（CR）对生物体寿命和代谢途径的许多影响。然而，SIRT1在调节内皮依赖性血管舒缩张力中的作用尚不清楚。在这里，我们发现SIRT1通过靶向内皮一氧化氮合酶（eNOS）去乙酰化促进内皮依赖性血管舒张。SIRT1和eNOS在内皮细胞中共定位和共沉淀，SIRT1去乙酰化eNOS，刺激eNOS活性并增加内皮一氧化氮（NO）。SIRT1诱导的内皮NO增加是通过eNOS钙调素结合域中的赖氨酸496和506介导的。动脉内皮中SIRT1的抑制抑制内皮依赖性血管舒张并降低生物利用度NO。最后，小鼠CR导致eNOS脱乙酰化。我们的结果表明，SIRT1通过去乙酰化eNOS在调节内皮NO和内皮依赖性血管张力中起着基础作用。此外，我们的结果提供了一种可能的分子机制，将CR对内皮和血管张力的影响与SIRT1介导的eNOS脱乙酰化联系起来。
关键词：热量限制、血管舒张、沉默信息调节器2、白藜芦醇、去乙酰化
热量限制（CR）是一种公认的降低动脉血压的非药理学方法。CR不仅能够独立控制轻度高血压患者的血压，还可以减少用于治疗高血压的药物数量和剂量(1,2). CR和CR导致的体重减轻也能改善肥胖和超重高血压患者的内皮依赖性血管舒张(三,4).
此外，氯丁橡胶还能延长生物体的寿命。在发芽酵母中，酿酒酵母，复制细胞的老化由证券投资风险2基因(5). CR延缓酵母老化取决于该基因的产物Sir2（沉默信息调节器2），Sir2是一种III类NAD依赖性组蛋白脱乙酰酶。哺乳动物Sir2的直系同源物SIRTUIN 1（SIRT1）靶向组蛋白和许多非组蛋白(6–10). 白藜芦醇，一种刺激SIRT1活性的植物多酚(11)，激活内皮一氧化氮合酶（eNOS）(12)改善内皮功能，防止血压升高，并恢复内皮功能障碍动物模型中的血管eNOS活性(13). 假设CR和白藜芦醇对血管功能的影响部分由SIRT1介导，我们研究了SIRT1在调节eNOS活性和内皮依赖性血管张力中的作用。
结果和讨论
为了确定SIRT1是否在调节内皮依赖性血管张力和大鼠主动脉环的血管舒缩功能中发挥重要作用，其中野生型SIRT1或显性阴性SIRT1突变（抑制内源性SIRT1）在内皮细胞中腺病毒表达(A类)，已测量。对照环被一种编码惰性物质的腺病毒感染大肠杆菌lacZ基因。与对照环相比，内源性SIRT1抑制环损害了乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张(B类)和较低的生物可利用NO(C类). 相反，NO供体硝普钠诱导的内皮非依赖性血管舒张在对照环和SIRT1被抑制的环中相似(D类). 此外，与对照环相似，野生型SIRT1过度表达的环在NOS抑制剂的存在下没有显示乙酰胆碱诱导的血管舒张作用N个G公司-硝基-我-精氨酸甲酯(我-名称）(E类)，表明SIRT1不激活内皮依赖性血管舒张的NOS非依赖性机制。因此，内皮细胞SIRT1通过NOS依赖机制促进内皮依赖性血管舒张和NO的血管生物利用度。
内皮细胞SIRT1通过NOS调节内皮依赖性血管舒张和生物可利用NO(A类)编码myc标记的SIRT1催化失活显性阴性突变体（AdSIRT1（H363Y））的复制缺陷型腺病毒(一和c（c）)用于抑制大鼠主动脉环内皮内源性SIRT1体外。对照环感染了一种编码惰性物质的腺病毒大肠杆菌lacZ基因（AdLacZ）(b条和d日). 腺病毒感染24小时后固定环并用抗myc抗体进行免疫染色。×100处代表环的显微照片(一和b条)和×400(c（c）和d日)如图所示。(B类)通过测量用苯肾上腺素预限制的环对血管扩张剂乙酰胆碱的舒张作用来测定内皮依赖性血管舒张作用。显示了AdSIRT1（H363Y）（■）和AdLacZ（◆）。*，P（P）与AdLacZ相比<0.001(n个= 7). (C类)通过测量存在和不存在NOS抑制剂时苯肾上腺素诱导的血管收缩的差异来测定生物可用NO我-姓名。显示了AdSIRT1（H363Y）（■）和AdLacZ（◆）。*，P（P）与AdSIRT1（H363Y）相比<0.01(n个= 7). (D类)通过测量苯肾上腺素对NO供体硝普钠预收缩环的舒张作用来测定内皮非依赖性血管舒张作用。AdSIRT1（H363Y）（△）和AdLacZ（■）(n个=4）。(E类)大鼠主动脉环感染体外使用AdLacZ（■和□）或AdSIRT1（△和▲）。AdSIRTI编码野生型SIRT1。NOS抑制剂存在（□和△）和不存在（■和▲）时内皮依赖性血管舒张我-NAME是通过测量预先用苯肾上腺素限制的环对血管扩张剂乙酰胆碱的舒张作用来确定的。n个=每组4个环。
蛋白质中的SIRT1脱乙酰基ε-乙酰赖氨酸残基。为了研究SIRT1是否脱乙酰化细胞中的eNOS，我们测定了内皮细胞中eNOS的乙酰化，其中内源性SIRT1表达被RNAi抑制。SIRT1表达减少增加了赖氨酸残基上内源性eNOS的乙酰化(A类). 同样，烟酰胺抑制内源性SIRT1活性可增加乙酰赖氨酸eNOS(A类). 相反，白藜芦醇对内源性SIRT1活性的刺激降低了eNOS在赖氨酸残基上的乙酰化(B类). 此外，SIRT1过度表达降低[三H] 醋酸盐掺入COS7细胞表达的eNOS(C类)而烟酰胺对内源性SIRT1的抑制作用增加[三H] 乙酸并入eNOS(C类). 最后，为了验证eNOS是SIRT1的真正底物，我们检查了SIRT1是否可以对乙酰化eNOS进行脱乙酰化在体外.乙酰化重组eNOS在体外用p300乙酰转移酶和乙酰基供体乙酰辅酶A，然后在有或无SIRT1辅因子NAD的情况下用活性SIRT1处理。以NAD依赖方式进行SIRT1脱乙酰乙酰化eNOS(D类). 因此，SIRT1去乙酰化eNOS在体外细胞中eNOS的乙酰化与SIRT1的活性和/或表达呈负相关。
细胞中SIRT1去乙酰化eNOS和在体外热量限制与小鼠肝脏中eNOS的脱乙酰化有关。(A类)内源性eNOS在赖氨酸残基上的乙酰化，有或无RNAi介导的内源性SIRT1的敲除，有或没有用SIRT1抑制剂烟酰胺处理细胞。用SIRT1 RNAi或对照RNAi转染大鼠主动脉内皮细胞，或用烟酰胺处理。用抗eNOS和抗乙酰赖氨酸抗体对全细胞裂解物中eNOS的免疫沉淀物进行免疫印迹（前两个面板）。使用非免疫IgG的免疫沉淀物作为对照。用抗eNOS、抗SIRT1和抗β-肌动蛋白抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹（底部三个面板）。(B类)内源性eNOS在赖氨酸残基上的乙酰化，使用或不使用SIRT1激活剂白藜芦醇进行处理。用抗乙酰赖氨酸和抗eNOS抗体对来自大鼠主动脉内皮细胞全细胞裂解物的免疫沉淀eNOS进行免疫印迹。用抗eNOS、抗SIRT1和抗β-肌动蛋白抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。(C类)成立[三H] 乙酸转化为COS7细胞中表达的eNOS。用eNOS转染的细胞，无论SIRT1是否过度表达，或用烟酰胺处理，均在含有钠的培养基中培养[三H] 醋酸盐。对细胞裂解物中的免疫沉淀eNOS进行放射自显影，并用抗eNOS抗体进行免疫印迹。用抗eNOS和抗SIRT1抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。(D类)SIRT1对乙酰化eNOS的脱乙酰作用在体外在存在或不存在SIRT1辅因子NAD的情况下，在乙酰基供体乙酰辅酶A（Ac-CoA）的情况下用p300乙酰转移酶乙酰化纯化的全长GST-eNOS和GST-eNO与活性SIRT1酶孵育。用抗乙酰赖氨酸和抗eNOS抗体对反应混合物进行免疫印迹。(E类)通过CR对小鼠肝脏中eNOS的去乙酰化。雄性和雌性小鼠随意喂食或限热量饮食（57.4 kcal/周）3周。用抗乙酰赖氨酸和抗eNOS抗体对来自肝匀浆的eNOS免疫沉淀物进行免疫印迹（顶部两个面板），用抗SIRT1和抗β-肌动蛋白抗体对匀浆进行免疫印记（底部两面板）。条形图显示了计算得出的乙酰化eNOS/总eNOS比率，表示为相对于各性别组随意喂食的小鼠。显示了3周结束时小鼠的体重（以起始体重的百分比表示）。AL，随意。
接下来，我们探讨在改变SIRT1表达或活性的条件下，eNOS的乙酰化是否发生改变体内.CR刺激哺乳动物中SIRT1的表达(6). 因此，我们研究了eNOS的乙酰化状态被SIRT1表达的变化调节的可能性，SIRT1表达对热量摄入的反应。我们比较了限制热量饮食和随意饮食小鼠肝脏中赖氨酸残基的eNOS乙酰化。持续3周的CR导致赖氨酸残基上eNOS乙酰化的减少(E类)因此，乙酰化eNOS的比例明显低于不限制热量饮食的小鼠。
为了确定SIRT1是否调节eNOS活性，我们在过度表达SIRT1的eNOS表达COS7细胞的裂解液中进行了NOS活性测定。SIRT1表达增加eNOS催化活性增加(A类). 为了表明eNOS活性受到乙酰化-脱乙酰化的直接调节，我们还检测了NOS催化活性在体外(B类). 重组eNOS的催化活性在体外p300乙酰转移酶乙酰化后降低。乙酰化eNOS与SIRT1的脱乙酰化以NAD依赖的方式挽救了NOS催化活性的下降。在NOS活性增加的同时，SIRT1过度表达增加了COS7细胞产生的eNOS衍生NO(C类). 催化失活显性阴性SIRT1突变体的类似表达水平没有增加NO水平。此外，在内皮细胞中，白藜芦醇增加了NO水平，内源性SIRT1的下调在很大程度上减轻了这种影响(D类). 为了确定SIRT1靶向的eNOS中的乙酰赖氨酸残基，我们对eNOS进行了结构-功能分析。我们针对牛eNOS中的两个赖氨酸残基：赖氨酸496和506（对应于人类eNOS的赖氨酸49和504）。这些残基位于eNOS的钙调素结合域（CBD）中。我们选择CBD是因为该结构域中的苏氨酸497被蛋白激酶C磷酸化，并且该残基的去磷酸化刺激eNOS活性(14). 我们推断，由于类似的空间和/或电荷效应，向CBD中的赖氨酸残基添加乙酰基对eNOS活性的影响类似于向CBD的磷酸受体残基添加磷酸基团。因此，赖氨酸496和赖氨酸506被改为非乙酰化精氨酸（K496R和K506R）。与野生型eNOS相比，COS7细胞中eNOS（K496R）或eNOS的表达导致NO水平显著升高(E类). 此外，与野生型eNOS相比，SIRT1的过度表达不会刺激来自eNOS（K496R）或eNOS的NO（K506R）。这些发现表明野生型eNOS中的K496和K506在调节NO生成中起着重要作用，SIRT1对eNOS的刺激作用需要这些残基的完整性。
SIRT1刺激eNOS活性并增加内皮NO(A类)测定了表达eNOS的COS7细胞裂解液中NOS催化活性（精氨酸转化为瓜氨酸），包括SIRT1过度表达和不过度表达。用抗SIRT1和抗eNOS抗体对裂解液进行免疫印迹。*，P（P）与没有SIRT1的eNOS相比，<0.05。(B类)NOS催化活性在体外在p300、SIRT1和NAD缺失和存在的情况下。底部显示了总eNOS和乙酰赖氨酸eNOS。*，P（P）与eNOS+p300相比，<0.05。(C类)在表达eNOS的COS7细胞培养基中测量NO代谢产物（亚硝酸盐和硝酸盐），有无SIRT1或非活性SIRT1（H363Y）的过度表达。用抗eNOS和抗SIRT1抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。由于斑点暴露不足，在裂解液中未发现内源性SIRT1。*，P（P）与没有SIRT1的eNOS相比，<0.05。(D类)在转染SIRT1 RNAi或对照RNAi，或用SIRT1激活剂白藜芦醇处理的大鼠主动脉内皮细胞培养基中测量亚硝酸盐和硝酸盐，P（P）与对照RNAi相比<0.05。**，P（P）与对照RNAi.#相比<0.01，P（P）>与SIRT1 RNAi相比为0.05。(E类)在表达eNOS（WT）、eNOS或eNOS的COS7细胞（K506R）中检测亚硝酸盐和硝酸盐，SIRT1过表达与否，P（P）与eNOS（WT）相比<0.05。
SIRT1被描述为在细胞质和细胞核之间穿梭(15). 为了确定SIRT1是否与eNOS相关，eNOS主要存在于细胞质中，我们评估了eNOS和SIRT1在内皮细胞中的定位。双重免疫荧光显示内源性SIRT1和eNOS在核周细胞质中共定位(A类). 此外，联合免疫沉淀显示SIRT1和eNOS在内皮细胞中相互关联(B类). 因此，一部分SIRT1在内皮细胞的细胞质中与eNOS共定位并结合。
SIRT1和eNOS在内皮细胞中定位并相互关联。(A类)人脐静脉内皮细胞内源性eNOS（红色）和SIRT1（绿色）的双重免疫荧光。用抗eNOS抗体和Texas Red-labeled（红色）二级抗体对固定的、渗透的细胞进行染色，然后用抗SIRT1抗体和FITC-标记（绿色）的二级抗体进行染色(c–e类). 对照细胞被德克萨斯州红标染色(一)和FITC-标签(b条)不含抗eNOS和抗SIRT1一级抗体的二级抗体。图中显示了在荧光显微镜上拍摄的典型的红色、绿色和合并图像（×40）。箭头指向合并图像中eNOS和SIRT1的共定位（黄色）。(B类)大鼠主动脉内皮细胞内源性eNOS和SIRT1的免疫共沉淀。用抗eNOS或抗SIRT1抗体免疫沉淀全细胞裂解物。免疫沉淀用抗eNOS和抗SIRT1抗体进行免疫印迹。使用带有非免疫IgG的免疫沉淀物作为对照。
eNOS的CBD内有四个赖氨酸残基。其中两个残基被鉴定为乙酰化的假定位点表明，SIRT1可能会靶向该结构域中的多个残基，通过协调这些残基的脱乙酰化来刺激酶活性。此外，考虑到磷酸化在eNOS调节中的已知作用，它表明，对于其他蛋白质，乙酰化和磷酸化可能以相互依赖的方式发生，以调节eNOS活性(16,17).
FOXO转录因子家族的SIRT1脱乙酰基成员(18,19). LXXLL基序（其中L为亮氨酸，X为任何氨基酸）在不同物种的FOXO蛋白质中保守(20). 该基序介导小鼠FOXO1与SIRT1的相互作用，并对SIRT1诱导的FOXO1脱乙酰基化至关重要(20). LXXLL基序也存在于SIRT1的其他既定靶点中，包括p53、PGC-1α和p300/CBP。不同物种的eNOS包含至少一个LXXLL基序，支持我们的说法，即SIRT1与eNOS结合并靶向eNOS进行脱乙酰化。
短期CR改善肥胖和超重受试者内皮功能障碍(三,4)代谢异常的纠正可能会对内皮功能产生不利影响。然而，在健康的非肥胖个体中，长期CR可降低收缩压和舒张压(21)表明CR可能激活血管舒张的生理机制，而这些机制与代谢紊乱的纠正无关。尽管这些研究可能很有趣，但很难将CR对血管张力的有利影响仅归因于SIRT1。CR也刺激eNOS表达(22); 因此，其对内皮功能的有益作用可能与SIRT1诱导的eNOS脱乙酰化无关。然而，将eNOS确定为SIRT1的底物，结合抑制内源性SIRT1促进内皮功能障碍和CR导致eNOS脱乙酰化的结果，提示SIRT1在内皮依赖性eNOS介导的血管稳态中的重要作用：在低热量摄入期间，这一作用可能会变得更加突出。
材料和方法
细胞和细胞转染。
人脐静脉和大鼠主动脉内皮细胞购自Clonetics（加州圣地亚哥）和Cell Applications（加州圣迭戈）。COS7细胞购自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）将cDNA或RNAi转染细胞。
抗体、免疫沉淀和免疫印迹。
eNOS和SIRT1的免疫沉淀通常是通过将2μg抗体（来自加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司的兔多克隆抗eNOS抗体和抗SIRT1抗体）与1 mg细胞裂解液孵育过夜，然后再孵育40μl蛋白A-Sepharose浆液（新泽西州阿默沙姆市皮斯卡塔韦市）4小时来实现的。清洗后，免疫沉淀物在SDS/PAGE凝胶加载缓冲液中煮沸，经过SDS/PACE，转移到硝化纤维过滤器中，并用指定的一级抗体和适当的过氧化物酶结合二级抗体（圣克鲁斯生物技术）进行检测。使用适当的一级和二级抗体对50μg全细胞裂解物进行类似的蛋白质印迹。化学发光信号是通过使用SuperSignal West Pico或Femto底物（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）开发的，印迹是通过Gel Doc 2000 Chemi-Doc系统（加州Hercules，Bio-Rad）成像的。
RNA干扰。
从Invitrogen购买经验证的SIRT1隐形siRNA（5′-GCAACUCUCUGCCUGAUUUUGUA-3′，人类SIRT1 mRNA的核苷酸1152-1175）和适当的对照RNAi。根据制造商提供的方案，将该siRNA转染到内皮细胞中。
亚硝酸盐+硝酸盐测量。
将转染有所示质粒或RNAi的COS7或内皮细胞在无酚红完全生长培养基中培养48 h。使用10-kDa截止过滤器（Microcon YM10；Millipore，Billerica，MA）将培养基脱蛋白。然后对培养基进行处理，以测量NO代谢物亚硝酸盐（NO2−)和硝酸盐（NO三−)根据制造商的建议，使用市售试剂盒（硝酸盐/亚硝酸盐荧光测定试剂盒；密歇根州安阿伯市Cayman Chemicals）测定NO的稳定分解产物。减去背景荧光后，对总细胞数（蛋白质量）的值进行标准化。
NOS催化活性。
用市售试剂盒测量NOS活性。简而言之我-[14C] 精氨酸到我-[14C] 根据制造商的建议，使用瓜氨酸测定全细胞裂解物或重组纯化GST-eNOS中的NOS活性（NOS检测试剂盒；加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）。对细胞数量（总蛋白）的值进行标准化。
重组蛋白质。
将牛eNOS全长cDNA克隆到pGEX4T-2（Amersham）细菌表达质粒中。用异丙基β表达并诱导蛋白质-d日-BL21-Gold（DE3）pLysS（Stratagene）细菌宿主菌株中的硫代半乳糖苷（IPTG）（0.1 mM）。按照制造商推荐的批量纯化方案，使用谷胱甘肽Sepharose珠（Amersham Biosciences）纯化表达的eNOS。洗脱组分的纯度通过SDS/PAGE和考马斯染色测定。
双重免疫荧光染色。
将接种在盖玻片上的内皮细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中1×PBS（pH 7.2–7.4）中30分钟。在用10%山羊血清、0.4%Triton X-100和10 mM甘氨酸渗透后，将其在封闭溶液中培养（室温下10%山羊血清培养1小时），然后在37°C下应用第一个一级抗体（1:200稀释度的兔多克隆抗eNOS）1小时。然后在37°C的黑暗中应用德克萨斯州红标记荧光二级抗体（1:50稀释度；宾夕法尼亚州西格罗夫市Jackson ImmunoResearch Laboratories）1小时。然后在37℃的黑暗中使用第二级一级抗体（1:200稀释度的鼠抗SIRT1单克隆抗体）1个小时。然后在37°C的黑暗中添加FITC-标记的绿色荧光二级抗体（1:50稀释；Jackson Immuno-Research Laboratories）1小时。每一步后，在含有10 mM甘氨酸的PBS中清洗盖玻片三次，持续5分钟。然后使用ProLong Gold防褪色试剂（Invitrogen）安装盖玻片，并在双荧光Axiover显微镜下进行分析（德国耶拿蔡司）。对照盖玻片的处理方法相同，但遗漏了主要抗体。
定点诱变。
使用商用QuikChange试剂盒（Stratagene）进行诱变。通过测序验证所有突变。
体外试验乙酰化和脱乙酰化。
将纯化的GST标记的重组eNOS脱盐，并通过使用Zeba旋转柱（Pierce）用乙酰化缓冲液（50mM Tris·HCl，pH 8.0/137mM NaCl/0.1mM EDTA，pH 8.0/10%甘油/1mM DTT/0.1mM PMSF/2μM曲霉菌素A）交换缓冲液。每次乙酰化反应使用5毫克GST-eNOS。将其与乙酰辅酶A（20μM）和p300乙酰转移酶（60单位，活性Motif）在30°C下孵育40分钟，并摇晃。乙酰化反应后立即通过添加脱乙酰化缓冲液（25 mM Tris·HCl，pH 8.0/137 mM NaCl/2.7 mM KCl/1 mM MgCl）进行脱乙酰化反应2/1 mg/ml BSA），1 mM NAD+和活性重组SIRT1（10单位；Biomol，普利茅斯会议，PA），并在37°C下摇晃培养1小时。反应混合物进行SDS/PAGE和免疫印迹。
在体内无线电标签[三H] 醋酸盐。
COS7细胞与eNOS和SIRT1质粒共转染。细胞在含有5 mM烟酰胺和300μCi/ml钠的无醋酸盐培养基中培养过夜[三H] 在收获前用醋酸盐浸泡5小时。收集细胞并在含有10 mM烟酰胺和5μM曲古抑菌素a的缓冲液中进行裂解。使用带有IgG对照的eNOS抗体免疫沉淀1毫克蛋白质，在SDS/PAGE样品缓冲液中溶解，并在8%SDS/PACE上溶解。将凝胶固定在含有10%冰醋酸和40%甲醇的溶液中1小时，然后在商业放射自显影增强溶液（Amplify；Amersham）中再培养30分钟。干燥凝胶，并在−80°C下暴露于薄膜中5天。
小鼠CR。
六只8周龄的雄性和雌性C57BL6小鼠或保持57.4 kcal/周的饮食，或允许随意喂食3周。使用Prolab Isopro RMH 3000啮齿类食物。每周给老鼠称重。3周后处死小鼠，并将其肝脏均质化。通过免疫印迹法评估匀浆中SIRT1的表达。用乙酰赖氨酸抗体免疫印迹法测定匀浆中eNOS的赖氨酸乙酰化。
血管反应性。
幼龄（3-4个月大）Wistar–Kyoto大鼠因过量服用戊巴比妥钠而死亡。迅速进行胸骨中部劈开，小心切除降主动脉，并将其置于冰镇Krebs缓冲液中（118.3 mM NaCl/4.7 mM KCl/2.5 mM CaCl2/1.2毫微米千赫2人事军官4/25 mM氯化钠三/1.2 mM硫酸镁4/11 mM葡萄糖/0.0026 mM CaNa2EDTA）。将主动脉清除多余脂肪，横切成5–10个环（2.0–3.0 mm），每个环感染6×1011每毫升AdLacZ、AdSIRT1（H363Y2/5%一氧化碳2)与Krebs缓冲溶液混合，并保持在37°C和pH 7.4。每个环悬挂在四腔肌电图系统（DMT）的5 ml器官室中的两个钢丝箍筋之间。一个镫骨连接到三维微操作器，另一个连接到力传感器。收缩力被电子记录下来。所有环在1小时内以500 mg的增量拉伸至2000 mg，以优化对KCl的收缩反应。给药一剂KCl（60 mM）以验证血管平滑肌的生存能力。苯肾上腺素的累积剂量-反应曲线（10−9到10−5M） 通过给药一半log剂量获得。通过生成乙酰胆碱的剂量-反应曲线来确定内皮依赖性血管舒张。乙酰胆碱引起的血管舒张作用表示为收缩百分比，收缩百分比由对预收缩张力的抑制百分比决定。通过在用一氧化氮合酶抑制剂预处理的环中生成乙酰胆碱的剂量-反应曲线来评估内皮依赖性一氧化氮合酶诱导的血管舒张我-名称（10−4M） ●●●●。通过测定对抑制剂收缩反应的增加来测定NO的生物利用度我-用苯肾上腺素（10）预限制的环状NAME−6M） ●●●●。通过在用苯肾上腺素（10−6M） ●●●●。
致谢
我们感谢T.Michel（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供的eNOS cDNA和A.Cook（英国剑桥大学）提供的SIRT1 cDNA。这项研究得到了美国心脏协会（宾夕法尼亚州-特拉华州附属机构）的支持。
缩写
| 我-名称 | N个G公司-硝基-我-精氨酸甲酯 |
| 铬 | 热量限制 |
| 中央商务区 | 钙调素结合域。 |
脚注
作者声明没有利益冲突。
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