介绍
PPAR在细胞和组织代谢中起着核心作用(1)并影响炎症过程(2). 其中一些受体在心脏是人体内最需要能量的器官之一。心脏能量是主要来源于脂肪酸（FAs）的氧化，这与心脏中PPARα表达相对较高(三). 相反，PPARγ表达于心脏中的含量相对较低。尽管如此，最近的数据显示PPARγ组织特异性缺失改变心脏功能(4). 此外，罗格列酮仍然会引起心脏病这些小鼠肥大，表明药物和强调依靠药物来理解特定转录因子的生物学作用。
在其他组织中，PPARγ调节组织甘油三酯（TG）的积累。肝细胞过表达PPARγ导致脂肪变性(5); 脂肪组织PPARγ缺失导致成熟脂肪细胞生成缺陷(6).心脏中的PPARγ能否以类似方式发挥作用已知。
脂质积累增加导致器官功能障碍，这一过程称为脂肪毒性。在心脏，脂质代谢缺陷、糖尿病和严重肥胖可导致扩张型心肌病(7).这种疾病已经在动物身上建立了模型。心脏过度表达PPARα增加FA氧化，但也导致心脏脂质堆积(8). 严重肥胖相关瘦素功能缺陷(9)和遗传摄取量增加导致心脏脂质增加的变化(10)或增加FA陷阱(11)也会导致脂肪中毒性心肌病。
在一些脂毒性扩张型心肌病啮齿动物模型中，PPARγ激动剂治疗可改善心脏功能(12,13). 人们假设PPARγ激动剂由于对心脏的直接作用而具有有益作用(14–16); 这令人惊讶，因为PPARγ导致其他组织中的脂质积聚。PPARγ激动剂具有多种系统性影响，最显著的是，它们引导了更大比例的血浆脂肪组织的TG和FA(17). 这样一个单独作用可以减少心脏对脂肪的摄取，改善脂肪毒性。
直接评估PPARγ增加对心功能、血脂的影响代谢和基因表达，我们创造了表达PPARγ1通过心脏α-肌球蛋白重链（α-MHC）启动子。这些小鼠增加了心脏对FA和no的摄取葡萄糖摄取减少并发展为扩张型心肌病。尽管PPARγ激动剂没有增加野生型心脏基因的表达这些药物增加了FA氧化和摄取基因的mRNA水平PPARγ转基因动物的心脏功能障碍加剧。
结果
心脏特异性PPARγ1转基因小鼠的建立。
小鼠通过α-MHC在心肌细胞中过度表达PPARγ启动子被指定为MHC-PPARγ1小鼠（图A） ●●●●。PCR筛选鉴定出的后代3携带MHC-PPARγ1转基因的创始人。第2个的后代这些创始人指定MHC-PPARγ1L（低表达）和γ1H（高表达）。雄性小鼠除非另有说明，否则在实验中使用。PPARγ1转基因在心脏中特异表达；在中未检测到任何表达肝脏、骨骼肌或脂肪（图B） ●●●●。在对照小鼠心脏中，PPARγ1 mRNA水平较低；对照组心脏PPARγ与18S rRNA的比值远低于对照组脂肪组织。相反，MHC-PPARγ1L小鼠有PPARγ到18S rRNA水平大约是脂肪组织中的两倍（图C） ●●●●。MHC-PPARγ1H心脏PPARγmRNA水平大约是MHC-PPARγ1L心脏。PPARγ蛋白水平是1.9倍（MHC-PPARγ1L）和7.2倍（MHC-PPARγ1H）转基因小鼠的心室比同窝对照小鼠的心室（图、D和E）。
PPARγ1转基因小鼠的构建和基因表达。(A类)PPARγ1基因位点和PPARγ1结构设计。使用α-MHC启动子驱动PPARγ1 cDNA表达。黑框表示外显子编号为。显示PCR引物。方框A1和A2表示PPARγ1特异外显子。(B类)心脏特异性MHC-PPARγ1表达。RNA的RT-PCR分析在使用引物A的3月龄MHC-PPARγ1L雄性小鼠：5‰α-MHC启动子外显子2和3′端的末端特异性特异于PPARγ1 cDNA核苷酸173–192。(C)PPARγ总mRNA在心脏的表达（两者均为内源性基因和转基因）在MHC-PPARγ1L和采用qRT-PCR对MHC-PPARγ1H雄性小鼠进行定量。底漆C是用于PCR扩增。数据显示为平均比率（±SD；n个=每组5）校正18S rRNA。***P（P）<MHC-PPARγ1小鼠0.001与对照组小鼠相比。(D类)核蛋白（30μg）来自4个月龄和8个月龄MHC-PPARγ1L和4个月大的MHC-PPARγ1H小鼠及其同胞对照组用多克隆PPARγ抗体进行Western blot分析。层粘连蛋白B1的Western blot显示为对照。(E类)乐队是使用分子分析软件进行量化。数据被标准化为数值对于室友控件（设置为1.0），规范化的表达单位为显示（±SD；n个=每组3人）**对<0.01; ***P（P）<0.001适用于MHC-PPARγ1与对照小鼠的比较。C、 凋落物控制；Tg、，转基因MHC-PPARγ1小鼠；PA，聚（A）位点。
正常繁殖的每个品系的转基因小鼠，以及葡萄糖、体重、，血脂水平与非转基因小鼠相似（补充表1；本文可在网上获得补充材料；doi:10.1172/JCI30335DS1）。
MHC-PPARγ1小鼠心脏中的PPARγ活性。
我们估计了PPARγ活性在通过评估下游基因的表达评估MHC-PPARγ1小鼠。令人惊讶的是，尽管脂肪样PPARγ1的表达水平，幼年MHC-PPARγ1L小鼠（4个月大）的心脏表达下游基因与对照相似（图A） ●●●●。八个月龄MHC-PPARγ1L小鼠，然而，乙酰辅酶A氧化酶（AOX）（1.35倍）、肉碱的表达更高棕榈酰转移酶-1（CPT1）（1.63倍），FA转定位酶（CD36）（1.61倍）、FAS（1.44倍）和脂肪分化相关蛋白（ADRP）（1.81倍）（图B） ●●●●。
PPARγ靶基因在大鼠心脏中的表达MHC-PPARγ1小鼠。(A类和B类)四个月和八个月大MHC-PPARγ1L雄性小鼠；(C)4个月大PPARγ1H雄性小鼠。数据显示为平均比率（±SD；n个=每组5-9）校正18S rRNA，并归一化为窝友对照组（套同于1.0）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***对<0.001适用于MHC-PPARγ1小鼠与窝友对照组。
相比之下，心脏中的多个基因显著上调4个月大的MHC-PPARγ1H小鼠（图C） ，包括参与脂质氧化、摄取、合成和存储，例如AOX公司,CPT1型,CD36型,船边交货,美国存托凭证、和SREBP1号机组ATP-结合盒运输A1的表达（ABCA1），介导胆固醇逆向转运至载脂蛋白A-I并被诱导PPARγ(18)，是1.73倍在4个月大的MHC-PPARγ1H小鼠中更高（图C） ●●●●。
对照组和MHC-PPARγ衰老小鼠的PPAR基因表达。
确定为什么MHC-PPARγL转基因在下游没有改变年轻小鼠的基因表达，我们评估了PPAR家族成员的表达对照组和转基因衰老小鼠。如其他人所述(19)，PPARα表达随着衰老小鼠（补充图1A）。此外，PPARα的表达在2个月龄和9个月龄的MHC-PPARγL中分别减少了29%和60%转基因小鼠分别与其同窝对照组进行比较。两者都不是内源性和转基因PPARγ1和PPARδ的表达2个月和9个月大的小鼠心脏之间存在差异（补充图1、B和C） ●●●●。因此，PPARα表达的改变可能会改变下游MHC-PPARγL转基因的影响。
MHC-PPARγ1小鼠的心脏脂质含量和摄取。
MHC-PPARγ1小鼠CD36表达增加可增加摄取血浆游离脂肪酸和脂蛋白衍生脂肪酸。心脏TG和FA含量为在8个月大的MHC-PPARγ1L小鼠中增加（图A） ●●●●。油红O染色显示积聚较多MHC-PPARγ1L小鼠心脏内中性脂质的含量与室友对照组相比（图、B和C）。电子显微镜显示心肌细胞肌浆，线粒体轮廓扭曲MHC-PPARγ1L小鼠（图D） ●●●●。在一些区域，嵴被破坏（图E） ●●●●。
MHC-PPARγ1小鼠心脏脂质积聚增加。(A类)心脏TG（左面板）和FFA含量（右面板）为MHC-PPARγ1L转基因小鼠显著增加(n个=每组7）。(B类)油红O染色显示大量中性脂滴随机分散贯穿MHC-PPARγ1L雌性心肌细胞的细胞质24小时禁食后的小鼠（右侧面板）（原始放大倍数，×400). (C)油红O染色定量使用分子分析软件(n个=每组3人）。数据将其归一化为室友对照组的值（设为1.0）。(D类). 电子显微照片（原始放大，×15000）的心肌组织显示脂质大量增加MHC-PPARγ1L心肌细胞肌浆内的液滴雄性小鼠（右侧面板）与同窝小鼠（左侧面板）的比较。所有这些脂滴位于线粒体附近，线粒体变形线粒体轮廓。(E类)电子显微照片（原件放大倍数，×50000）线粒体内基质与电子透光灶（箭头）MHC-PPARγ1L小鼠，部分区域嵴被破坏。(F类) [14C-TG]VLDL摄入心脏8个月龄的MHC-PPARγ1L雄性小鼠和同窝对照小鼠年龄(n个=每组6人）。LD，脂滴；M、 线粒体。数据显示为平均值±SD*P（P）<0.05,**P（P）<0.01, ***对< 0.001与室友对照组相比。DPM，每分钟衰减一次。
8个月龄MHC-PPARγ1L心脏VLDL-TG摄取量为74%大于室友控制心脏(P（P）<0.01; 图F） ，其中与脂质摄取基因和心脏脂质的表达增加相对应存储。肝脏和骨骼肌的脂质摄取没有被PPARγ1转基因（数据未显示）。
葡萄糖转运蛋白4在MHC-PPARγ1中的表达和葡萄糖摄取老鼠。
与MHC-PPARα转基因小鼠不同(8)，葡萄糖转运蛋白4(GLUT4公司)和GLUT1公司MHC-PPARγ1L小鼠的mRNA水平没有变化（数据未显示），并且在MHC-PPARγ1H小鼠中上调（表). 丙酮酸脱氢酶激酶4调节葡萄糖氧化的基因也在MHC-PPARγ1H小鼠（表).
表1
4月龄婴儿糖代谢和GLUT4调节基因的表达MHC-PPARγ1H小鼠
GLUT4基因经历了一个复杂的基因调控程序。这个GLUT4–需要肌细胞增强因子2（GLUT4-MEF2）位点GLUT4转录的代谢调控(20–22). MEF2A、，MEF2C和MEF2D亚型，但不是MEF2B亚型，在心脏中表达。PPARγ辅活化子1（PGC1）也与MEF2C相互作用上调培养肌肉细胞内源性GLUT4表达与葡萄糖摄取(23). GLUT4表达MHC-PPARγ1H小鼠与MEF2C表达增加相关和MEF2D（1.48倍，P（P）<0.001和1.55倍，对=0.009），但MEF2A无变化。PGC1β基因表达也上调（1.68倍；对=0.01）在MHC-PPARγ1H小鼠的心脏中（表).
使用以下方法评估体内心肌葡萄糖输入2-脱氧-d日-[三H] 葡萄糖。心脏对葡萄糖的摄取没有变化在MHC-PPARγ1L心脏中（图A、 左面板），在MHC-PPARγ1H小鼠中增加37%与室友对照组相比(P（P）<0.05; 图A、 右侧面板）。PAS技术MHC-PPARγ1L小鼠心脏糖原储备增加与室友对照组相比（图B） ●●●●。PAS淀粉酶（PAS-D）完全清除心脏中的糖原部分（图C） ●●●●。这些数据表明在MHC-PPARγ小鼠中，尽管心脏脂质摄取升高时，葡萄糖摄取没有减少。
心脏葡萄糖摄取和糖原储存增加MHC-PPARγ1雄性小鼠。(A类)2-脱氧-d日-[三H] 葡萄糖摄入心脏MHC-PPARγ1和野生型对照小鼠。MHC-PPARγ1L小鼠8个月大(n个=7英寸每组）；MHC-PPARγ1H小鼠4个月大(n个=每组6人）。(B类)PAS染色来自8个月龄MHC-PPARγ1L雌性小鼠（中面板）和室友控制（左侧面板），禁食6小时后（原始放大倍数，×400）。箭头显示局部染色增强。使用分子分析软件量化糖原含量(n个=每组3-4个），并归一化为值用于PAS培训控件（设置为1.0）（右侧面板）。G、 糖原。数据包括显示为平均值±标准偏差*对与之相比<0.05有垃圾管理**对< 0.01.(C)用PAS淀粉酶（PAS-D）去除糖原染色消化（左面板和中间面板），并使用分子分析软件（右侧面板）。
MHC-PPARγ1小鼠的心脏功能。
MHC-PPARγ1L和MHC-PPORγ1H心脏左心室扩张心室和收缩功能受损。心脏与体重的比率为8月龄MHC-PPARγ1L和4月龄增加MHC-PPARγ1H小鼠（图，A和B）。扩张型心肌病表型明显可见（图C和D），也可通过超声心动图观察（图，E–J）。左侧心室收缩内径增加（0.17±0.03 vs0.14±0.01厘米；对=0.021）和分数缩短率从53%±3.6%降至48%±5.2%(对=0.036）PPARγ1L小鼠8个月龄时（图、F和G）。这个MHC-PPARγ1H小鼠有更严重的心脏功能障碍。四个月大PPARγ1H心脏的左室收缩尺寸较大（0.28±0.02对0.17±0.03；对<0.001），缩短部分的减少幅度更大（从47.3%±5.3%至30.2%±3.2%；对<0.001）（图、I和J）。
MHC-PPARγ1小鼠的扩张型心肌病。(A类和B类)心脏与体重的比例为MHC-PPARγ1L均增加(n个=11–13）和MHC-PPARγ1H雄性小鼠(n个= 8–9). (C)代表性的心脏照片对照组和MHC-PPARγ1L雄性小鼠。(D类)组织学对照组和对照组心脏H&E染色组织切片MHC-PPARγ1L雄性小鼠。(E类和H（H）)年左心室运动的代表性超声心动图图像MHC-PPARγ1L和MHC-PPORγ1H小鼠。超声心动图左心室收缩内径增加(F类和我)减少了部分缩短(G公司和J型)MHC-PPARγ1L和MHC-PPARγ1H小鼠。FS，分数缩短；LVD，左侧心室收缩末期内径。数据显示为平均值±SD。*P（P）<0.05, **P（P）<0.01,和***P（P）<0.001与室友对照。
心力衰竭标志物基因脑型利钠肽（BNP）和心钠素（ANF）在MHC-PPARγ1小鼠中升高（表). 增加了4个PPARγ1H生产线中的月数，但不到8个月PPARγ1L线。
表2
心力衰竭标志基因在MHC-PPARγ1L和MHC-PPARγ1H小鼠
罗格列酮对野生型和MHC-PPARγ1小鼠的影响。
与其他脂毒性心脏模型相比(13,16,24)罗格列酮治疗8个月大婴儿MHC-PPARγ1L小鼠导致心脏功能进一步恶化：脂肪堆积增加，心脏变大，缩短分数减少（图、A和B）。这与罗格列酮治疗后心脏CD36和ADRP基因表达增加MHC-PPARγ1L小鼠（图C） ●●●●。当野生型小鼠接受罗格列酮治疗时，心脏的正常表达PPARγ下游基因在8个月大的婴儿中异常减少鼠标（图C） ●●●●。脂肪组织和肌肉罗格列酮治疗后CD36表达增加（补充图2).
MHC-PPARγ1L和C57BL/6野生型小鼠，有或无罗格列酮治疗。(A类)8个月大的油红O型心脏组织学MHC-PPARγ1L雌性小鼠（中间面板）或不带（左侧面板）罗格列酮治疗。染色被量化并标准化为同窝控件的值（设置为1.0）（右侧面板）。数据显示为平均值（±SD；n个=每组3-4人）。(B类)心体重比（左侧面板）和超声心动图测量右心室部分缩短8月龄MHC-PPARγ1L雄性小鼠（含或不含罗格列酮）治疗。(C)心肌基因表达的qRT-PCR分析8个月大的雄性C57BL/6野生型（左侧面板）和MHC-PPARγ1L使用或不使用罗格列酮治疗的小鼠（右侧面板）(n个=每组6-7人）*P（P）<0.05, **对<0.01，以及***对与未使用罗格列酮治疗组相比，<0.001。罗西，罗格列酮，WT，野生型C57BL/6小鼠。
导致MHC-PPARγ1小鼠心脏功能障碍的途径。
探讨脂质诱导的心肌病，我们检查了心脏组织，以寻找脂质积聚的证据触发程序性细胞死亡。四个月龄MHC-PPARγ1H小鼠心脏神经酰胺水平增加了40%，神经酰胺是一种能够诱导细胞凋亡(25)与室友相比控件（图A） ●●●●。这与随着长链碱基1（LCB1）和LCB2的表达增加丝氨酸棕榈酰辅酶A转移酶。凋亡相关基因的表达-B细胞白血病/淋巴瘤2（Bcl2），Bcl-2样蛋白（Bcl-XL），BCL2相关X蛋白（Bax）和caspase-9也显著增加增加（图B） ●●●●。这个CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP），是内质网应激介导的细胞死亡调节因子在MHC-PPARγ1H小鼠。iNOS没有变化。有证据表明MHC-PPARγ1L和MHC-PPARγ1H，但非对照，心脏（图、C和D）。
MHC-PPARγ1心脏的脂细胞增多症。（A） 在4个月大的婴儿心脏组织中测量心脏神经酰胺MHC-PPARγH雄性小鼠及其窝鼠对照二酰甘油激酶测定和组织重量归一化（n=3–6). (B类)神经酰胺合成基因（LCB1和LCB2），内质网应激诱导凋亡相关基因（CHOP）与细胞凋亡MHC-PPARγ1H男性中的基因（Bax和caspase-9）上调老鼠的心脏。抗凋亡基因Bcl2和Bcl-XL也上调(n个= 8–9). (C)心脏病对照组（左侧面板）和8个月龄婴儿的心室组织MHC-PPARγ1L（中面板）和4个月大MHC-PPARγ1H雄性小鼠（右图）进行DNA染色通过TUNEL协议（原始放大倍数，×200). 含有碎裂核染色质的凋亡细胞核染色呈深棕色。(D类)TUNEL阳性心肌细胞计数并表示为TUNEL阳性心肌细胞的数量每平方毫米组织面积。数据显示为平均值（±SD），并标准化为同窝对照的值（设置为1.0）。*P（P）<0.05, **P（P）<0.01,和***P（P）<0.001与室友对照。
PPARγ1在人和链脲佐菌素诱导的糖尿病中的表达老鼠心。
然后我们测试PPARγ的表达是否可以在糖尿病小鼠的心脏。糖尿病小鼠心脏的表达量增加了2.1倍PPARγ含量高于对照组小鼠(对= 0.003)（图A） ●●●●。我们还评估了人类心脏中PPARγ的表达。人类心脏有8.1至PPARγmRNA水平是小鼠心脏的14.5倍（图B） ●●●●。这些数据表明PPARγ在人类心脏中功能更强。
链脲佐菌素诱导PPARγ1表达上调糖尿病小鼠和人类心脏。(A类)4个月龄野生型C57BL/6雄性小鼠接受链脲佐菌素（STZ），3周后，来自对照组和糖尿病患者的心脏采集小鼠（葡萄糖>300 mg/dl）和PPARγ1 mRNA通过qRT-PCR分析。(B类)心脏组织取自正常人个体（正常胡）和心脏病患者的心脏移植（Hu Tx）。PPARγ1和18S rRNA在使用人类和野生型小鼠常见引物的人和野生型鼠mRNA小鼠基因***对与小鼠组相比<0.001。
讨论
在PPAR转录因子家族的3个成员中，PPARγ是表达在心脏的最低水平。然而，最近对心肌特异性PPARγ-基因敲除小鼠在这种转录因子在维持正常心脏功能中的作用(4). PPARγ有几个有充分记录的效应改变组织中的糖脂代谢。在两个脂肪组织中(26,27)和肝脏(28)，这个转录因子增加葡萄糖和脂质的摄取，增加TG的储存。
为了研究PPAR的药理作用，这些转录因子单独或在其强效激动剂VP16存在下(29)已在组织中转基因表达。我们的目的是研究PPARγ仅在心脏中的作用，并确定外源配体是否调节其活性；这是必要的区分PPAR激动剂的局部和全身作用。我们创建了几行评估PPARγ功能的PPARγ转基因小鼠特别是在心肌细胞中。在低表达株系中在幼年动物中发现了心肌细胞基因。PPARγ的影响仅在年龄较大的MHC-PPARγ1L小鼠中观察到激活。相比之下MHC-PPARγ1H细胞系，PPARγ表达增加下游基因出现在幼年小鼠中。脂质氧化和摄取的表达基因增加，葡萄糖摄取没有减少，心脏脂肪毒性随后出现扩张和功能障碍。因此，产生了心脏糖脂毒性。
2株PPARγ1转基因小鼠表现出相似的表型，但时间和严重程度不同。幼年MHC-PPARγ1L小鼠无明显变化PPARγ下游基因的变化，如CD36、ADRP和CPT1，甚至尽管PPARγ在心脏中的表达水平与脂肪组织。这很令人惊讶，但在某些方面反映出缺乏效果心肌细胞PPARγ缺乏对控制基因表达的影响脂质和葡萄糖代谢(4). 我们最初想知道激动剂的缺乏是否阻止了预期的基因诱导。然而，无论是高脂肪饮食还是罗格列酮都不会导致PPARγ在4个月大的PPARγ1L小鼠中激活（数据未显示）。我们还注意到罗格列酮治疗野生型小鼠减少了PPARγ靶点。我们怀疑罗格列酮会自然转向与其他组织，尤其是脂肪组织发生PPAR配体。在另一个模型中脂毒性方面，罗格列酮减少了向心脏输送血脂(13). 在某种程度上MHC-PPARγ1L转基因是由于心脏组织中PPARα。有趣的是，具有最高水平PPARγ，即脂肪组织，具有相对低水平的PPARα表达(30)，而心脏等富含PPARα的组织中PPARγ。原因尚不清楚，但我们的数据表明PPAR转录因子存在相互调节。
随着年龄的增长，MHC-PPARγL转基因的作用变得明显：参与FA摄取和氧化的基因表达增加心脏累积TG。心脏扩张，射血分数降低表达较高水平的失败标记物（BNP和ANF）。其他心脏模型随着年龄的增长，功能障碍表现出更大的病理变化。随着年龄的增长，心脏变得更大即使在没有任何心脏病理的情况下，葡萄糖和较少的FA使用(31). 如果类似过程发生在小鼠，正常氧化的PPARγ配体可能在老年PPARγ1L心脏。或者，与年龄相关的PPARα表达(19)可能允许更多配体结合PPARγ并允许该转录因子与未占用的PPAR响应元素关联。
与MHC-PPARγ1L年轻小鼠缺乏作用相反MHC-PPARγ1H细胞系发生基因改变，有心脏功能障碍的证据2个月。这些动物的严重扩张型心肌病导致100%的死亡率5个月（补充图3E）。
我们进行了几项研究，以量化PPARγ1小鼠。发现更多来自VLDL-TG的FAPPARγ1心脏。心脏葡萄糖摄取和GLUT4表达未降低（PPARγ1L）或升高（PPARβ1H）。这是与糖原储存量增加有关。这些研究与与心脏PPARα过度表达的结果相类似(8). MHC-PPARα转基因小鼠患有扩张型脂毒性心肌病。心肌细胞PPARα诱导的FA氧化（例如AOX和CPT1）和FA摄取基因（CD36）。这可能有助于在氧化程度较高的情况下，心脏脂质增加。与…对比MHC-PPARγ1小鼠、MHC-PPAR-α小鼠的GLUT4表达与心脏葡萄糖摄取(8). 因此，PPARγ和PPARα增加了表达FA氧化和摄取的基因，导致TG积累，但在它们对葡萄糖代谢的影响。
在正常生理条件下，心脏利用脂肪酸作为其主要能量基底。由于心肌细胞中TG的储存能力有限，FA的吸收和氧化是紧密耦合的。增加了FA交付和FA氧化受损导致心肌内TG蓄积和脂肪毒性。糖尿病和严重肥胖患者心脏功能障碍的病因被认为是涉及脂肪毒性(32).
心脏功能下降归因于有毒脂质的积聚(33)、增加FA氧化和/或减少葡萄糖利用率。仅葡萄糖摄取和氧化的减少与此相关心脏功能障碍；在缺血性条件下尤其如此(32).GLUT4公司mRNA水平在几种心脏脂肪毒性模型中降低(8,34)和链脲佐菌素诱导的糖尿病(35,36). 然而，脂毒性的发展MHC-PPARγ1小鼠的扩张型心肌病不是由葡萄糖摄取缺陷。因此，脂代谢的改变并没有减少葡萄糖的利用可能是心脏功能不全的主要原因MHC-PPARγ1小鼠和其他脂毒性模型。
许多因素，包括MEF2(20,22)和PGC1β(23)，调节骨骼肌中GLUT4基因的表达，脂肪组织和心脏。在一项研究中，MEF2A（而非MEF2D）与GLUT4在心脏的表达增加(37).在我们的小鼠中，PPARγ的心脏表达与上调MEF2C、MEF2D和PGC-1β，但不是MEF2A。其他人建议PPARγ单独上调GLUT4表达(38).
乍一看，我们的结果似乎与PPARγ激动剂对动物和灌注心脏的治疗(16). 然而，这些药物在体内对血浆和组织脂质代谢的变化使心脏变得复杂伴随这些药物的使用和非PPAR效应(4). 噻唑烷二酮类药物对PPAR的作用心脏的激活应该是在由于更多的血脂被引导到脂肪组织，可用的配体(17)以及直接的心脏效应。因此，曲格列酮的有益作用(12)和罗格列酮(13)论脂毒性心肌病可能导致，至少部分原因是脂质从心脏，而不是直接激活心脏PPARγ调节基因。我们的数据显示心脏基因表达减少罗格列酮治疗的野生型小鼠心脏与这一解释一致。然而，随着PPARγ激动剂循环水平的升高或强效药物，心脏功能障碍与我们的MHC-PPARγ1小鼠可产生上述结果。
脂肪毒性的原因还只是部分了解。此外，在我们的模型中对于TG，MHC-PPARγ1H中神经酰胺含量增加，但没有增加MCH-PPARγ1L，心脏。其他患者的心脏神经酰胺水平增加脂毒性心肌病(11,12). 最近，神经酰胺合成的抑制已经证明可以纠正导致骨骼肌胰岛素的脂肪毒性喂食高脂肪食物的小鼠的抵抗力(39).神经酰胺可能导致某些细胞凋亡(40).
内质网应激，与FA过量相关，在MHC-PPARγ1小鼠(33)，是一个内质网内环境稳态中断引发的细胞反应内腔中错误折叠的蛋白质的积累。到目前为止，涉及到几种蛋白质内质网应激诱导的细胞凋亡已被证实，包括CHOP和Bcl-2家庭成员(41). CHOP是一个C/EBP家族的转录因子。其基本表达在非应激状态，但随着生理和药理应激(42). 上调监管CHOP的表达表明ER应激介导的细胞凋亡γ途径参与MHC-PPARγ小鼠心脏。
在我们的MHC-PPARγ小鼠心脏中，有细胞凋亡的证据；一些促凋亡基因被诱导（Bax和caspase-9），但一些抗凋亡基因也增加（Bcl2和Bcl-XL）。似乎心脏病PPARγ过度表达导致神经酰胺或ER增加应激触发caspase-9介导的内在凋亡信号通路也诱导了生存信号。
人类PPARγ激动剂治疗与周围水肿和心力衰竭加重(43); 这是我们看到的在最近的PROactive中(44)和糖尿病雷米普利和罗格列酮药物（DREAM）研究的缓解评估(45). 此外，使用PPARα/PPARγ双重激动剂导致心肌病等心力衰竭(46). 组织特异性缺失肾脏中PPARγ减少钠摄取(47). 因此，人们假设PPARγ激动剂是盐和水的滞留，这一过程可能导致水肿和心力衰竭(48). 然而，正如被其他人注意到(49)，盐保留通常会导致高血压；PPARγ激动剂与血压降低(44). 因此使用这些药物治疗的一些患者心力衰竭增加的原因可能是发现药物对心肌的毒性作用复杂只有少数患者。
总之，我们已经研究了PPARγ1在心肌细胞。众所周知，PPARγ在脂肪细胞中表达增加脂质和葡萄糖摄取，前者通过增加CD36表达和后者，部分是通过上调GLUT4。随后的扩张心肌病是由糖脂毒性引起的，因为TG和糖原都是储存不当。PPARγ激动剂罗格列酮增加了毒性，但不增加心脏PPARγ下游基因表达在野生型小鼠中。在某种程度上，这可能是由于法线的重定向其他组织的PPARγ配体。小鼠心脏中的PPARγ是随着链脲佐菌素诱导的糖尿病增加。此外，这个转录该因子在人类心脏中的表达水平较高。可能有心脏毒性PPARγ激动剂对人类的影响是由于糖脂毒性。幸运的是，这仅见于少数糖尿病患者基因变异使他们对什么是有用的形式异常敏感治疗。
方法
MHC-PPARγ小鼠的产生和鉴定。
审查了小鼠的创建以及所有代谢和遗传研究经哥伦比亚大学动物保护和使用委员会批准。含有1.7-kb小鼠PPARγ1 cDNA的转基因构建物与PPARγ2不同的是缺少30个额外的全日空航空公司2-末端氨基酸被克隆到α-MHC启动子（5.4 kb）。Sac1和Nae1消化MHC-PPARγ1产生线性7.8kb片段，用于微量注射（图A） ●●●●。转基因小鼠通过将MHC-PPARγ1构建物微注射到受精1细胞C57BL/6×CBA F1鸡蛋。方正老鼠和PPARγ1的转基因表达通过分析引物A（5ι-AGCGTGGTCCACATTCTTC-3ι；A）的基因组DNAMHC启动子外显子2）特异的正义引物和反义引物特定于PPARγ1 cDNA核苷酸173-192。PPARγ1 mRNART-PCR证实了心脏中的表达（转基因和内源性）具有PPARγ1-特异性引物B，意义：5？-GAGTGGACGACAAGATTTG-3？和反义：5（-GGTGGCGAGAATGGCATCT-3）。比较心脏PPARγ与脂肪组织的表达，我们测量了心脏和使用引物同时表达脂肪组织PPARγPPARγ1和PPARγ2（引物C，意义：5？-ATCTACACGATGCTGGC-3？和反义：5（-GGATGTCCCTCGATG-3）（图A） ●●●●。
蛋白质印迹分析。
来自4个月龄和8个月龄MHC-PPARγ1L和4个月大的MHC-PPARγ1H小鼠及其同胞对照组用核提取试剂盒制备并分离核蛋白根据制造商的说明（Active Motif）。三十用Western blot分析微克核蛋白PPARγ抗体（sc-7196；1:100稀释；Santa Cruz Biotechnology股份有限公司）。为了控制蛋白质负荷，去除印迹并与抗层粘连蛋白B1抗体（哥伦比亚霍华德·沃曼赠送大学）。使用分子分析通过密度测定法量化条带软件（Bio-Read）。
心脏和血脂。
禁食（6小时）小鼠的血液从逆行神经丛采集，用于测定血浆总胆固醇（TC）、TG和FFA。测量组织用PBS灌注脂质和心脏，并在4°C和1M内均质含有脂肪酶抑制剂的NaCl缓冲液，用于防止TG水解。脂质根据改良的方法从心脏组织中提取（50 mg）Folch等人(50). 干燥的油脂是溶解在含有2%Triton X-100的PBS中。心脏和血浆TC、TG和FFA使用Infinity试剂盒（Thermo Electron Corp.）和NEFA C套件（Wako）。
组织基因表达。
使用Pure Link Micro-to-Midi全纯化系统制备总RNA套件（Invitrogen）。最初用DNase I处理一微克RNA（Invitrogen）15分钟。然后使用ThermoScript RT-PCR试剂盒（Invitrogen）。实时定量RT-PCR（qRT-PCR）使用ABI 7700（应用生物系统）进行。放大使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行。使用的底漆补充表2和3中列出了PCR扩增的方法。分析是使用序列检测软件（应用生物科学）执行。标准使用未稀释和稀释（1:10、1:100和1:1000）生成曲线心脏组织的cDNA样本。相关系数为0.98或更高。数据用18S rRNA标准化。
组织学分析。
对禁食24小时的男性和女性心脏的中性脂质进行评估用PBS灌注小鼠。心脏被植入组织-胸腺最佳切割温度化合物（樱花）。心肌中室切片（6μM厚）用油红O染色，并用苏木精。
PAS和PAS-D染色用于显示心脏糖原。红心来自禁食6小时的雄性和雌性小鼠置于10%中性缓冲福尔马林中。将心室中段固定在甲醇中10分钟并染色使用希夫试剂（Poly Scientific）和H&E糖原染色通过用淀粉酶处理心脏切片来证明麦芽（Sigma-Aldrich），可以去除糖原。
TUNEL染色。
4个月龄和8个月龄MHC-PPARγ1L和4个月大的MHC-PPARγ1H固定在福尔马林中，包埋在石蜡切片。用TUNEL对组织进行DNA片段染色符合制造商规范的协议（研发系统）。通过计数TUNEL阳性来量化数据每平方毫米细胞面积的心肌细胞。
超声心动图分析。
使用技术对清醒小鼠进行二维超声心动图如前所述（Sonos 5500系统；飞利浦医疗系统）(10). 二维超声心动图获取图像并以数字格式记录。图像被分析由一名对小鼠基因型不知情的研究人员离线。左心室舒张末期内径（LVDd）和左心室收缩末期内径测量LVD。缩短百分比计算为：%FS=（[LVDd-LVD]/LVD）×100。
电子显微镜。
8月龄小鼠的左心室用2.5%戊二醛固定在0.1M Sorensen缓冲液（0.2 M一元磷酸盐/0.2 M二元磷酸盐磷酸盐1:4 vol/vol；pH 7.2），后固定在四氧化锇中，并嵌入EPON 812（电子显微镜科学）。超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅，并在JEM-1200ExII电子下进行检测显微镜（JEOL）。
摄入VLDL和葡萄糖。
通过连续超速离心从正常人中分离出人VLDL并用[羧基-14C] 三油酸（PerkinElmer）通过胆固醇酯转移蛋白（CETP）如前所述(51). 禁食16小时首次静脉注射MHC-PPARγ1小鼠和同窝小鼠1×106每分钟衰减（DPM）2-脱氧-d日-[三H] 葡萄糖（PerkinElmer）。五十五分钟2-脱氧后-d日-[三H] 葡萄糖注射液，1×106的DPM[14注射C-TG]VLDL。五分钟注射VLDL后，采集血液，并彻底检查血管经心脏穿刺注入10ml PBS。然后切除组织累积放射性[三H] 葡萄糖和[14C-TG]极低密度脂蛋白测量。注射的葡萄糖和VLDL量由血浆调节每次注射后30秒的放射性计数，并与实验结束时进行血浆计数。转基因小鼠的组织摄取与对照同窝对照的摄入量进行比较。
神经酰胺含量。
使用二酰甘油酯激酶法测定心脏神经酰胺水平如前所述(52).
人体组织。
正常人心脏组织取自美国国家疾病研究所互通式立交。11名原位心脏移植受者的心脏（50.3±8.8岁），患有特发性扩张型心肌病从哥伦比亚大学医学中心外科获得（CUMC）。CUMC的机构审查委员会批准了所有研究方案。正常人左心室总RNA购自Ambion（编号5856）。通过qRT-PCR和用人类18S rRNA标准化。用于qRT-PCR的引物序列由小鼠和人类基因（补充表3）。爆炸(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网站/)分析表明，这些引物占97%人和小鼠PPARγ1mRNA和18S rRNA的同源性为90%，分别是。
罗格列酮治疗。
给4个月龄和8个月龄的小鼠喂食含罗格列酮的食物15天。该食物由Research Diets生产，含有200毫克/公斤的药物；这是相当于成年小鼠平均每天摄入10毫克/千克的剂量4.5克/天。这些剂量与其他研究人员使用的剂量相似(53).
统计。
我们使用Prism软件包（GraphPad软件）分析数据。使用非配对双尾模型对两组进行比较学生的t吨测验。所有值均表示为平均值±SD。从统计学角度考虑各组之间的差异重要时间P（P）<0.05.
