某些mRNA翻译增加是对有丝分裂原刺激的重要反应(1–三)但是，将生长刺激与蛋白质合成机制的激活联系起来的信号通路知之甚少。雷帕霉素的研究(4)，一种有效的免疫抑制剂，发现了一种调节酵母蛋白质合成的信号通路(5)和动物细胞(6,7).体内雷帕霉素治疗会影响几种翻译调节因子的磷酸化，包括核糖体S6蛋白及其特异性激酶p706000万美元(8,9); eIF-4E结合蛋白4E-BP1(6,7)和4E-BP2(10); 和伸长系数2(11).
核糖体S6和4E-BP1调节不同类别mRNA翻译的启动。p70磷酸化6000万美元小核糖体亚单位的S6蛋白通过未知机制，在其5′非翻译区高效翻译含有寡嘧啶束的mRNA(12,13). 4E-BP1的磷酸化控制具有广泛二级结构的mRNA的cap依赖性翻译(三). 起始因子4F通过其eIF-4G亚基与eIF-4E的相互作用与这些mRNA复合，eIF-4E是一种识别N7-所有非细胞器mRNA的5′端的甲基-GpppN结构。在静止细胞中，4E-BP1与eIF-4G竞争结合eIF-4E，并通过取代mRNA中的起始因子4F来抑制翻译。生长刺激激活4E-BPl的磷酸化，从而降低其与eIF-4 E的亲和力，并释放cap依赖性翻译的阻滞(三). 通过阻止p70上特定残基的磷酸化S6k美元和4E-BP1，雷帕霉素抑制有丝分裂原刺激的p70活化6000万美元和S6的磷酸化(8,9)，以及4E-BP1与eIF-4E的解除关联(6,7).
FKBP12–雷帕霉素复合物与(14–17)并扰动RAFT1的函数(18,19)，ATM相关家族成员(20). RAFT1在雷帕霉素敏感信号通路中的确切作用及其与下游调节因子p70的联系S6k美元和4E-BP1没有很好的理解。在本文中，我们证明RAFT1直接磷酸化p706000万美元在磷酸化对雷帕霉素敏感的Thr-389残基上体内S6激酶活性所必需的(21,22).在体外，Thr-36和Thr-45上4E-BP1的RAFT1磷酸化阻止其与eIF-4E的相互作用，以及体内Thr-45磷酸化是4E-BP1–eIF-4E关联的主要调节器。
材料和方法
质粒和融合蛋白质。
大鼠p70的cDNA6000万美元或包含p70的残基332–506、332–415、415–502和66–235的区域6000万美元从p85中扩增6000万美元在Pmt2中使用带有适当引物的PCR。扩增产物被克隆到萨尔我和不是HA-prk5、myc-prk5、pGEX-4T（Pharmacia）或Pet32c（Novagen）的I位点。分别从I.M.A.G.E.克隆526490、475519和539369中，使用带有相应ORF 5′端和3′端引物的PCR扩增出人4E-BP1、小鼠4E-BP2和小鼠eIF-4E cDNA(23,24). 扩增产物被克隆到萨尔我和不是pGEX-4T、myc-pRK5或Pet 32c的I位点。所有PCR制备的cDNA均经DNA测序验证。将突变引入RAFT1，p706000万美元和4E-BP1 cDNA通过PCR突变(25)并通过DNA测序证实。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-p706000万美元和GST-4EBP1/2融合蛋白按所述进行纯化(15). eIF-4E、p70-S6-激酶和p70的66–235残基的6xHis-TRX融合蛋白6000万美元根据制造商（Novagen）提供的协议，在变性条件下纯化。p70融合蛋白6000万美元或RAFT1在HA-prk5的N或C末端融合到GST，在HEK293细胞中表达并按所述进行纯化(26).
瞬时转染和细胞治疗。
用磷酸钙沉淀法转染10厘米培养皿上的HEK293细胞(27). 当p70S6k美元或单独转染4E-BP1，100 ng p706000万美元在HA-prk5中或在myc-prk5中使用100 ng 4E-BP1和9.9μg空载体。
为了使转染后的细胞静止，培养板过夜，用PBS冲洗一次，然后放置在没有胎牛血清的培养基中30–48小时。细胞用10 nM雷帕霉素（钙生物化学）或乙醇载体处理30分钟，然后用10%胎牛血清刺激1小时或指定时间。在适当的处理后，用PBS冲洗10-cm培养皿上的细胞一次，并在1ml冰镇缓冲液A中溶解（50 mM Hepes-KOH，pH 7.4/40 mM NaCl/1 mM EDTA/0.5%Triton X-100/1.5 mM Na三沃4/50 mM NaF/10 mM焦磷酸钠/10 mCβ-甘油磷酸钠）和1 mM苯甲基磺酰氟、5 mg/ml抑肽酶、1 mg/ml抗血小板、1 mg/ml亮氨酸肽、6 mg/ml凝乳抑素和0.7 mg/ml胃蛋白酶抑素A。
体内32如前所述，对转染细胞进行P标记(28).
体外试验激酶分析。
用myc-prk5中的10μg RAFT1 cDNA转染HEK293细胞。培养20小时后，用PBS冲洗细胞一次，并在1ml冰镇缓冲液a中溶解。清除后，使用上清液制备mycRAFT1免疫沉淀物，其中含有5μg抗myc抗体和50μl 50%蛋白g琼脂糖浆液（Calbiochem）。免疫沉淀物用含有1%Triton X-100和0.05%SDS的缓冲液W（50 mM Hepes-KOH，pH 7.4/40 mM NaCl/1 mM EDTA）洗涤一次，用含有0.5%Triton X-100%和0.5 M LiCl的缓冲液W洗涤两次，用含0.5 M LiC1的缓冲液W2次，用50 mM Hepes 7.4/150 mM NaC1/1 mM DTT洗涤一次(29). 激酶分析在30°C下以22μl的体积进行，持续20分钟，并含有一个10-cm培养皿中洗涤过的免疫沉淀物的1/5、1.5μg GST-4E-BP1或GST-4E-BP2或200 ng p706000万美元融合蛋白，[γ]的2μCi-32P] ATP（NEN）、25 mM Hepes-KOH、pH 7.4、50 mM KCl、20%甘油、10 mM MgCl2，4 mM氯化锰21 mM DTT和50μM未标记ATP。通过添加5μl 5×凝胶样品缓冲液停止反应。样品煮沸3分钟后，用4–12%SDS-PAGE将蛋白质溶解并转移到聚偏二氟乙烯；然后用放射自显影术观察磷酸化蛋白。
如前所述进行有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶和S6激酶检测(21).
肽图和磷氨基酸分析。
磷酸分析如下所述(30). 使用pH 1.9电泳缓冲液绘制肽图(30). 为了确定4E-BP1上的RAFT1磷酸化位点，我们比较了RAFT1-磷酸化4E-BPl和4E-BP2的胰蛋白酶肽图谱。我们推测4E-BP2衍生肽（图中标记为“a”）。A类)与4E-BP1中的半胱氨酸高度同源，但也含有半胱氨酸，半胱氨酸的几种氧化状态可能会产生具有相似但不相同迁移率的肽。4E-BP1残基20和50之间的六个苏氨酸被选为候选RAFT1磷酸化位点，因为它们符合这些标准。从潜在磷酸化位点具有单或双丙氨酸取代的突变体制备的肽图与野生型4E-BPl的肽图没有显著差异。然而，通过升序色谱法分离从每个TLC板纯化的肽“a”的乳糜酸消化物表明，RAFT1磷酸化位于同一胰蛋白酶肽中的两个同源位点，苏氨酸35/36和44/45。
RAFT1磷酸化Thr-36和Thr-45上的4E-BP1。(A类)磷酸分析表明，RAFT1磷酸化苏氨酸上的4E-BP1（数据未显示）。色氨酸肽图谱(下部)RAFT-磷酸化4E-BP1和4E-BP2(上部)共享一个主要肽（在下部)在4E-BP1图中作为一个单点迁移，但在4E-BP图中作为三个紧密间隔的点迁移。星号表示样本的应用位置。斑点“b”在野生型和激酶头RAFT1磷酸化的4E-BP1地图中可见，代表污染激酶的磷酸化位点。4E-BP1图谱中点“a”左右可见的点是点“a”中肽的部分消化产物（数据未显示）。(B类)Thr-36和Thr-45是RAFT1对4E-BP1磷酸化的主要位点。所示GST-4E-BP1突变体被磷酸化在体外通过RAFT1，如图所示。1安培显示突变体S64A和T69A的磷酸化以进行比较。(C类)p70上RAFT1磷酸化位点的比较6000万美元和4E-BP1。
抗体和免疫印迹。
用抗myc 9E-10抗体（Calbiochem）检测myc4E-BP1和免疫沉淀myc-RAFT1，用抗血凝素抗体（Babco，Richmond，CA）检测和免疫沉淀HA-p706000万美元用抗GST抗体（Santa Cruz）检测GST-4E-BP1。凝胶样品通过SDS-PAGE溶解，转移到CAPS-甲醇（pH 11）中的聚偏二氟乙烯，并用一级抗体进行检测。用抗鼠或抗兔抗体（Amersham）和增强化学发光（NEN）进行蛋白质印迹。
7-甲基-GTP和eIF-4E亲和色谱法。
为了纯化内源性eIF-4E，向清除的细胞裂解液中添加30μl 50%7-甲基-GTP Sepharose（Pharmacia）浆液，并在室温下培养30分钟。用50 mM Hepes（pH 7.4/40 mM NaCl/2 mM EDTA/0.1%Triton X-100）洗涤树脂两次后，用1.25×凝胶样品缓冲液洗脱结合蛋白，并用SDS/17%PAGE进行解析，用抗myc抗体显示4E-BP1。
对于在体外4E-BP1和eIF-4E之间的结合反应，1μg TRX-eIF-4E融合蛋白在室温下与20μl包装的7-甲基-GTP Sepharose结合30 min，用缓冲液B（25 mM Hepes，7.4/100 mM KCl/1 mM EDTA/1 mM DTT）洗涤两次，并再次悬浮在40μl相同缓冲液中。添加20μl含有100 ng GST-4E-BP1的激酶分析反应产物，在冰上培养1 h，并用缓冲液B洗涤两次；然后用凝胶样品缓冲液洗脱结合蛋白。免疫印迹后，用抗GST抗体检测4E-BP1。
结果
体外试验RAFT1磷酸化物p70 S6激酶和4E-BP1。
因为RAFT1自身磷酸化(18,31)并且是ATM相关蛋白激酶家族的成员，我们询问RAFT1是否可以直接磷酸化p706000万美元以及4E-BP1。体外RAFT1，野生型，但不是激酶死亡（D2357E），在HEK293细胞中表达并通过免疫沉淀磷酸化细菌产生的p70纯化6000万美元和4E-BP1（图。A类). RAFT1强烈偏好p706000万美元作为底物，4E-BP1（2000 ng）是p70的10倍以上6000万美元（150 ng）是通过RAFT1获得大约相等水平磷酸化所必需的（图。A类，下部面板）。p70中的主要RAFT1磷酸化位点6000万美元是残基332-415内催化结构域的C末端。该区域包含Thr-389和Ser-404，已知其磷酸化被雷帕霉素抑制体内(21).体外，RAFT1不磷酸化p70的N-末端的一半6000万美元（残基66–235），其中含有Thr-229，第三个体内雷帕霉素敏感性磷酸化位点(21).
RAFT1磷酸化4E-BP1和p70的C末端一半6000万美元 在体外. (A类)通过免疫沉淀法纯化HEK293细胞中表达的野生型和激酶缺失型RAFT1，并用[γ-32P] ATP和4E-BP1或p70的指示融合蛋白6000万美元通过放射自显影术显示磷酸化蛋白(上部)Ponceau染色显示了分析中每个融合蛋白的相对数量(下部). (B类)FKBP12-雷帕霉素部分阻断4E-BP1和p70的RAFT1磷酸化6000万美元。使用指定底物进行激酶分析，如A类除了免疫沉淀物首先在冰上与100 nM FKBP12（含或不含10 nM雷帕霉素）孵育1 h。这些结果代表了五个类似的实验。
RAFT1与FKBP12-雷帕霉素预孵育降低4E-BP1和p70的磷酸化6000万美元单独使用FKBP12的对照组分别约为50%和85%（图。B类). FKBP12-雷帕霉素的不完全抑制并不意外，因为RAFT1与GST-FKBP12-雷帕霉素亲和树脂络合后仍能强力自磷酸化(31). 此外，雷帕霉素处理并没有完全消除Tor2蛋白的假定激酶活性，Tor2是RAFT1的酵母同源物，因为雷帕霉素对酵母的处理并没有重现用激酶死亡蛋白替代野生型Tor2时观察到的所有效果(32).
RAFT1激活和4E-BP1和p70 S6激酶磷酸化的时间进程。
正如人们对上游激酶的期望一样，血清诱导的RAFT1激活先于p706000万美元和4E-BP1磷酸化，但遵循类似的激活和失活模式。RAFT1激活阶段很快，在15分钟达到峰值，但失活较慢，在血清刺激后2小时活性仍然升高（图。A类). 在血清刺激前用10 nM雷帕霉素治疗30分钟，不会抑制RAFT1的激活（数据未显示）。p70的磷酸化S6k美元和4E-BP1，如表观分子量的增加所反映的，在添加血清后5分钟内开始，15分钟显著升高，1小时达到峰值，然后缓慢衰减（图。B类). S6激酶的激活和4E-BP1–eIF-4E复合物的破坏遵循相同的时间过程，这与MAP激酶对血清的激活和失活动力学不同（图。B类). 因为RAFT1在静止细胞中具有显著活性（图。A类)其中p706000万美元和4E-BP1去磷酸化，RAFT1的比活性不能是p70的唯一决定因素6000万美元和4E-BP1磷酸化状态。因此，除了RAFT1活性外，其他因素，如p70的可及性6000万美元和4E-BP1结合到RAFT1激酶结构域和/或靶向它们的磷酸酶活性，也必须在控制其磷酸化程度方面发挥重要作用。
血清刺激RAFT1激酶向p70的活性6000万美元和4E-BP1。(A类)从静止的HEK293细胞中纯化的野生型RAFT1，用10%的血清刺激指定的时间，并通过免疫沉淀纯化，用指示的融合蛋白和[γ-32P] ATP。SDS-PAGE后，转移到聚偏二氟乙烯和Ponceau染色，对应于p70的条带6000万美元切除332–415和4E-BP1，并通过闪烁计数确定每一个中的放射性量。增加了32p70的P掺入相似6000万美元332–415和4E-BP1，以及p70的折叠激活6000万美元如下所示。所示结果代表了三个类似的实验。(B类)p70的时间进程6000万美元磷酸化(顶部)激活（图）和4E-BP1磷酸化以及eIF-4E释放(中部和底部). 第70页6000万美元并用免疫印迹法检测4E-BP1。内源性MAP激酶激活动力学如图所示，以供比较。
Thr-389上的RAFT1磷酸化p70 S6激酶。
我们测定了p70上RAFT1磷酸化的位点S6k美元和4E-BP1，看看它们对非磷酸化氨基酸的突变是否会模拟雷帕霉素的作用。p70的残留物332-4156000万美元包含RAFT1磷酸化的主要位点（图。A类). RAFT1-磷酸化融合蛋白的糜蛋白酶消化产生含有磷酸苏氨酸的疏水肽（图。A类). Thr-389是RAFT1磷酸化的主要位点在体外（图。B类)作为Thr-389而非Ser-404的丙氨酸替代物，消除了大部分RAFT1磷酸化。没有其他激酶被报道磷酸化Thr-389，它是三个残基（Thr-229、Thr-388和Ser-404）中的一个，其磷酸化被雷帕霉素处理完全阻断体内(21). 在我们的在体外在实验条件下，我们没有发现p70的Thr-229或Ser-404的磷酸化6000万美元，尽管它们与Thr-389有显著同源性(21). 需要进一步的工作来确定RAFT1是否不能磷酸化这些位点，因为它们在测试的融合蛋白中不可访问，或者它们是否不符合首选的RAFT1磷酸化基序。Thr-389磷酸化对p70活化的重要性6000万美元这一残基的磷酸化状态与S6激酶活性相关(21,22). 我们发现与野生型相比，p70的T389A突变体6000万美元不到1%的S6激酶活性，对血清刺激无反应，SDS-PAGE显示阶梯状下降（图。C类). 雷帕霉素对野生型p70有类似作用6000万美元（图。C类).
RAFT1磷酸化物p706000万美元在Thr-389上。(A类)RAFT1-磷酸化p70的色氨酸肽图谱6000万美元332–415和纯化肽的磷酸分析。肽“a”是肽“b”的不完全消化，胰蛋白酶肽图仅显示一个点（数据未显示）。(B类)用T389A突变体替代野生型p706000万美元332–415消除了大多数RAFT1磷酸化。(C类)T389A第70页S6k美元在HEK293细胞中表达的蛋白并没有被血清刺激激活（图），并且在SDS-PAGE上显示阶梯减少。(D类)野生型（WT）而非激酶缺失型（DE）RAFT1磷酸化HEK293纯化的p706000万美元在N末端与GST融合(左侧)但不是在C终点站(对). 所有p706000万美元融合蛋白能够自动磷酸化（−）。添加p70的量6000万美元除p70外大致相等S6k美元-雷帕霉素处理细胞产生的GST，其含量约为其他细胞的三分之一(下部).
激活p706000万美元体内除Thr-389外，还需要多个位点的磷酸化，如Ser-367(33). 因此，细菌产生6xHis-Trx-p70就不足为奇了6000万美元在RAFT1磷酸化之前或之后，融合蛋白对S6不起作用（数据未显示）。我们推断p706000万美元除Thr-389外，在所有必要的残基上被磷酸化的应具有被RAFT1磷酸化激活的潜力在体外为了获得这种蛋白，我们纯化了重组p706000万美元雷帕霉素处理仅15分钟的HEK293细胞融合蛋白，导致Thr-389选择性去磷酸化(21). 第70页6000万美元当从对照细胞或雷帕霉素处理的细胞中纯化时，与GST N末端融合的GST对S6完全不起作用（数据未显示），表明N末端的GST部分阻止S6激酶活性所必需的激活输入或干扰蛋白质的正常折叠。该输入不能是Thr-389的磷酸化，因为在体外免疫沉淀RAFT1磷酸化（图。D类)不激活蛋白质（数据未显示）。A第70页6000万美元血清以雷帕霉素敏感的方式刺激C末端附着GST的变体，使其达到野生型水平的25%（数据未显示）。然而，令人惊讶的是，当从对照细胞或雷帕霉素处理的细胞中纯化出这种蛋白质时，它不是RAFT底物在体外（图。D类). 此外，从HEK293细胞纯化的可溶性RAFT1融合蛋白不能磷酸化mycp70S6k美元对照细胞或雷帕霉素处理细胞的免疫沉淀（数据未显示）。除了多种细胞提取物或脂质的激酶反应外，包括3′和4′磷酸化磷脂酰肌醇，并不能恢复可溶性RAFT1磷酸化免疫沉淀mycp70的能力6000万美元或免疫沉淀的RAFT 1磷酸化可溶性p706000万美元-GST（未显示数据）。这些实验表明，在p70的潜在活性版本中，Thr-389对RAFT1是隐藏的6000万美元，并且很可能获得该残基需要由存在的辅因子诱导的蛋白质构象变化体内但不是在体外.非活性p706000万美元变体，如细菌制备的p70S6k美元或HEK239生产的GST-p706000万美元，具有（可能是因为它们折叠错误）可访问的Thr-389，但可能缺少S6激酶活性所必需的其他修饰。
4E-BP1在Thr-36和Thr-45上的RAFT1磷酸化阻碍其与eIF-4E相互作用的能力。
使用RAFT1磷酸化4E-BP1和4E-BP2的比较胰蛋白酶肽图谱来帮助我们，我们确定了Thr-36和Thr-45为4E-BPl上的RAFT1磷酸化酶位点（图。 A类和B类; 看见材料和方法详细信息）。4E-BP1的MAP激酶磷酸化发生在Ser-64上(34)并且，随着更长的激酶反应，也在Thr-36和Thr-45(35). Thr-36、Thr-45和Thr-389及其周围残基的蛋白质比对显示，4E-BP1和p70上的RAFT1磷酸化位点6000万美元氨基酸同源性小；p70中Thr-389侧翼的大疏水氨基酸6000万美元，而4E-BP1的Thr-36和Thr-45为S/TP基序（图。C类). 4E-BP1的RAFT1磷酸化在体外降低其与eIF-4E相互作用的能力，用T36A/45A双突变体替换野生型4E-BP1或用激酶缺失变体替换野生类型RAFT1，消除了RAFT1减少相互作用的功能（图。A类). 鉴于4E-BP1和p70上RAFT1磷酸化位点的差异6000万美元，RAFT1优先于p706000万美元MAP激酶也磷酸化4E-BP1并影响其与eIF-4E的结合(34)，接受这个必须小心在体外结果作为足够的证据宣布RAFT1为体内4E-BP1激酶。我们发现Thr-36和Thr-45在从32P-标记细胞（图。B类)雷帕霉素在这些部位阻止了约50%的血清刺激的磷酸盐增加（图。C类). 最近的一份报告(35)发现雷帕霉素部分阻断4E-BP1中几个S/TP位点的胰岛素刺激磷酸化，包括Thr-36和Thr-45，以及Ser-64、Thr-69和Ser-82。进一步评估Thr-36和Thr-45磷酸化的作用体内我们在静止的HEK293野生型细胞T36A、T45A或T36/45A 4E-BP1中表达，并检测血清刺激对其功能的影响。将Thr-36突变为丙氨酸会显著增加血清刺激后仍与eIF-4E结合的4E-BP1的量，而T45A和T36/45A突变的影响更为显著（图。D类). 即使在血清刺激后，含有T45A的突变体与eIF-4E的结合程度与野生型4E-BP1在无血清刺激或在存在雷帕霉素的血清刺激后的结合程度相同（图。D类，将车道1和4与7进行比较）。这些结果表明，苏氨酸被RAFT1磷酸化在体外尤其是Thr-45是4E-BP1和eIF-4E之间相互作用的重要中介体体内.
Thr-36和Thr-45被磷酸化体内，并且这些残基突变为丙氨酸产生4E-BP1变体，其组成性结合eIF-4E在体外和体内.（A）4E-BP1磷酸化在体外通过野生型（WT）RAFT1，但不通过激酶读取（DE）RAFT，无法绑定到eIF-4E(左侧，车道1和2）。即使在激酶分析中与野生型RAFT1孵育后，T36/45A突变体仍然与eIF-4E结合(左侧，车道3）。在每种条件下，提供等量的GST-4E-BP1用于结合(对). 持续30分钟的激酶分析如图所示。A类但只使用了100ng的融合蛋白。然后提供反应产物以与预结合到7-甲基-GTP Sepharose的重组eIF-4E结合。用抗GST抗体免疫印迹法检测结合4E-BP1。(B类)色氨酸肽图谱(下部)4E-BP1分离形式的标记细胞体内具有32P（P）(上部)并按规定条件进行处理。肽“a”在用T36/45A突变体制备的图谱中被消除（数据未显示）。(C类)血清刺激使Thr-45的磷酸盐含量增加2倍，雷帕霉素阻止50%的增加。肽“a”从B类并按中所述进行分析材料和方法.用密度计对斑点进行定量。(D类)Thr-36和Thr-45的丙氨酸突变可阻止血清诱导的eIF-4E释放4E-BP1，并模拟雷帕霉素的作用。用编码野生型或指示突变型4E-BP1的质粒转染HEK293细胞，用雷帕霉素和血清处理，并观察4E-BPl的迁移模式(上部)或绑定到eIF-4E的4E-BP1数量(下部)通过免疫印迹法测定。
讨论
在这项研究中，我们提供了雷帕霉素敏感信号通路的三个组成部分之间的联系，雷帕霉素敏感性信号通路是生长因子诱导蛋白质合成增加的重要介质。我们证明RAFT1是p70的难以捉摸的疏水导向Thr-389激酶6000万美元雷帕霉素对Thr-389磷酸化S6激酶激活的敏感性和重要性体内已经建立了良好的基础(21,22). 此外，RAFT1在调节其与cap-binding蛋白eIF-4E相互作用的位点磷酸化4E-BP1在体外和体内第70页6000万美元和4E-BP1(19)是已知的第一个RAFT1的外源性底物，其磷酸化状态是调节蛋白质翻译的关键开关(三).
RAFT1在控制其功能的残基上磷酸化4E-BP1的发现具有挑衅性，并使4E-BPl途径与导致S6磷酸化的途径不同，其中中间激酶p706000万美元，转换并放大初始信号。虽然本文的工作支持RAFT1作为一种生理4E-BP1激酶，但我们不能排除存在类似于p70的未知4E-BPl激酶的可能性6000万美元识别4E-BP1的所有雷帕霉素敏感S/TP位点，并含有p706000万美元-类似RAFT1-磷酸化基序，其磷酸化控制其活性。
我们发现p70的磷酸化6000万美元FKBP12-雷帕霉素与RAFT1结合仅部分抑制4E-BP1。这与最近一篇关于4E-BP1（PHAS-1）的RAFT1（mTOR）磷酸化的报告形成对比，在该报告中观察到4E-BPl磷酸化几乎完全被抑制(19). 我们研究之间的一个主要差异是使用的雷帕霉素浓度。鉴于我们在我们的在体外激酶反应等。(19)使用10μM雷帕霉素，其浓度是抑制4E-BP1磷酸化所需浓度的1000倍以上体内药物-受体复合物如何影响RAFT1体内目前尚不清楚，但这种相互作用的最终结果可能是RAFT1激酶活性仅对特定的蛋白质底物（如p70）产生抑制6000万美元FKBP12-雷帕霉素可以通过几种潜在机制实现这一点，例如空间位阻RAFT1激酶结构域，通过二次修饰或相互作用蛋白阻止RAFT1活化，或改变其亚细胞定位。另一方面，其对靶蛋白激酶活性的降低可能足以阻止处于竞争激酶和磷酸酶持续控制下的蛋白质磷酸化。
