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公共科学图书馆一号。2007; 2（6）：e527。
在线发布2007年6月13日。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0000527
预防性维修识别码：项目经理1885285
PMID：17565380

人类肌肉卫星细胞作为基孔肯雅病毒感染的靶细胞

西蒙娜·奥兹登，1 米歇尔·休尔，2 Jean-Pierre Riviere公司，三 云雀L.咖啡，4 菲利普·阿方索，1 文森特·穆利，5 让·德·蒙雷登，6 Jean-Christophe罗杰，6 穆罕默德·阿姆拉尼，6 让-吕克·伊文，7 玛丽·克里斯汀·贾法尔，8 Marie-Pascale法语，4 马里恩·苏里索，9 奥利维尔·施瓦茨，9 吉莉安·巴特勒·布朗，5 菲利普·德斯普雷斯，4 安托万·盖萨因，1和皮埃尔·埃曼纽尔·塞卡尔迪1，*
张林奇，学术编辑
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

基孔肯雅病毒（CHIK）是一种蚊子传播的甲型病毒，可导致人类急性感染，其特征是发烧、多关节痛、头痛和肌痛。自2005年以来，CHIK病毒的出现与印度洋前所未有的CHIK疾病暴发有关。临床上，此次疫情的特点是多关节痛无效，97.7%的病例报告有肌痛。由于人类CHIK病毒的细胞靶点未知，我们研究了骨骼肌CHIK感染的致病事件和靶点。

方法/主要发现

两名肌炎综合征CHIK病毒感染患者的肌肉活检免疫组织学研究表明，病毒抗原仅存在于骨骼肌祖细胞（设计为卫星细胞）内，而不存在于肌纤维内。为了评估CHIK病毒在人类卫星细胞中复制的能力，我们评估了病毒在原始人类肌肉细胞上的感染情况；在CHIK病毒感染的卫星细胞中观察到病毒生长，具有细胞病变效应，而肌管基本上对感染不敏感。

结论/意义

该报告为CHIK病毒的发病机制提供了新的见解，因为它是第一个确定人类CHIK病毒细胞靶点并报告人类肌肉卫星细胞被病毒制剂选择性感染的报告。

介绍

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种由蚊子传播的α病毒，属于该家族多哥病毒科1952年首次在坦噶尼喀报道。它是突发性急性感染的原因，其特征是高烧、关节痛、肌痛、头痛、寒战、畏光和皮疹[1]症状通常持续时间短（一周），通常恢复完全，尽管一些患者在感染后几周内反复发作[1]，[2]这种病毒在非洲、印度和东南亚流行，由伊蚊通过城市或森林传播周期传播。CHIK病毒在印度洋大量出现，截至2006年3月，留尼汪岛报告了20多万例病例[3]，以及2006年2月至8月期间印度超过125万例疑似病例[4]最近，在法国、德国、瑞士和挪威发现了输入性CHIK病毒感染病例[5]从临床角度来看，Réunion疫情的特点是规模和毒力非典型，伴有疼痛和无效的多关节痛，肌痛被报告为主要临床症状（97.7%的病例）[6]最近的一项临床研究报告了高肌酸激酶（CPK）横纹肌溶解症的发生[7]对CHIK病毒感染的病理生理机制，尤其是CHIK病毒的细胞靶点知之甚少。我们研究了肌肉细胞在CHIK发病机制中的可能参与体外受精两名肌炎综合征感染患者的肌肉活检方法在体外在人类肌肉卫星细胞的培养中，可以分化成肌管。

材料和方法

体外研究：

研究了两次肌肉活检。第一次肌肉活检是在2005年留尼汪岛CHIK病毒疫情爆发期间从1号患者身上获得的。这位67岁的患者出现了肾功能衰竭、高血压和酒精中毒的症状。他因CHIK病毒感染的典型临床表现入院：多关节痛、发热和肌痛。此外，还报告了在无创伤的情况下横纹肌溶解症的症状（CPK 41600 IU/mL；肌红蛋白8300 IU/mL）。血清中CHIK病毒RT-PCR为阴性，检测到低水平的CHIK病毒特异性IgM（0.5 IU/mL）。登革热病毒的血清学检测结果在极限范围内（IgM:1.9 IU/mL），而爱泼斯坦-巴尔病毒和肝炎病毒的检测结果为阴性。在疾病的急性期（危机开始后大约十天），对股四头肌进行肌肉活检，以进行解剖病理诊断（经La Réunion F.Guyon医院的机构批准）。在接下来的几周里，病人康复了。

关于第二次活检，2号患者是一名71岁的女性，她于2006年1月抱怨头痛、关节痛和皮疹。大约三个月后，她因CHIK病毒感染的典型临床症状入院，包括发烧、头痛、关节疼痛和肌痛，并伴有四肢肌肉无力，肌电图无纤颤。乙型和丙型肝炎病毒、HIV、HTLV-1和2、登革热病毒、钩端螺旋体病的血清学检查均为阴性。在此阶段，一个月后，CHIKV特异性IgG分别为40.9和IgM：1.1 I.U./mL，39.3和<1 I.U./mL。在该疾病的复发期，对股四头肌进行了肌肉活检以进行解剖病理诊断。

免疫细胞化学

通过间接免疫荧光或免疫过氧化物酶对细胞培养物和肌肉活检切片进行免疫细胞化学分析。培养物在丙酮中固定10分钟。用10%的正常山羊血清在PBS中稀释培养30分钟后进行免疫细胞化学，以避免非特异性抗体结合。巴斯德研究所（巴黎）生产的两种不同的HMAF被用作第一抗体；一个HMAF“#1”，以前报道过[8]使用的稀释度为1/1000，而第二种（#2）使用的浓度范围为1/1000-1/1600。在其他实验中，使用了一种针对α病毒核衣壳蛋白保守区的单克隆抗Semliki病毒，稀释至1/50[9]如前所述，抗法国嗜神经病毒株黄热病病毒、西尼罗河病毒（IS-98-ST1株）或夏威夷登革热1型病毒株的HMAF用作阴性对照的主要抗体[8]，[10]。从Dako（丹麦Glostrup）（小鼠单克隆抗CD56、-CD8、-CD68和-CD20，“即用型Envision”）、Neomarker（美国加利福尼亚州弗里蒙特）（兔抗CD3）或Sigma（美国密歇根州圣路易斯）（兔子抗层粘连蛋白）购得的其他抗体，并按照制造商的说明使用。

对于免疫荧光，根据制造商的说明使用与荧光素结合的特异性二级抗体（Vector Laboratories，CA，USA）。抗体在0.05%皂苷和10%正常山羊血清中在4°C下培养过夜或在室温下培养1小时。清洗后，将制剂装入Vectashield培养基中（Vector laboratories，CA，USA）。在所有实验中，根据制造商的说明，使用过氧化物酶ImmPRESS试剂盒抗小鼠免疫球蛋白（Vector Laboratories，CA，USA）和DAB液体底物系统，通过免疫过氧化物酶在固定细胞培养物上观察病毒蛋白。

对于从股四头肌活检获得的石蜡包埋切片，在石蜡去除后，将切片重新水化，并与10%的正常山羊血清孵育30分钟，然后处理以检测病毒抗原。正如最近一篇论文所报道的那样，一名非感染患者和一名患有肌炎综合征的HTLV-1感染患者的肌肉切片被用作阴性对照[11].

细胞和培养条件：

卫星细胞（即在出生后和成年肌肉中持续存在的肌源性前体细胞）最初是从5天大婴儿的股四头肌中分离出来的，如前所述（“CHQ5B”细胞）[12]在一个实验中，还使用了另外两种分别来自14岁和25岁两名供体的原代肌肉卫星细胞培养物（称为“KM162C14Q”和“KM155C25”）来测试CHIKV感染的敏感性。细胞由AFM组织库（法国巴黎）提供；根据法国生物伦理学法规，并经Pitié-Salpétrière医院（法国巴黎）的机构批准，所有患者在将组织捐赠给组织库之前都获得了知情同意。在添加50µg/ml庆大霉素和20%胎牛血清的Ham’s F-10中培养的细胞在达到一半汇合时进行胰蛋白酶消化。在添加100µg/ml转铁蛋白、10µg/ml胰岛素和庆大霉素的DMEM培养基中诱导卫星细胞分化为肌管3至5天[12].

病毒感染：

肌肉卫星细胞生长在24孔板的盖玻片上，对于某些培养物，分化为肌管三到五天。然后将肌肉卫星细胞或肌管培养物感染两种不同的CHIK病毒分离物或单独感染载体。这两个菌株05-115和06-49都是在2005-2006年留尼汪暴发期间通过C6/36蚊子细胞传代获得的，如前所述[8]分离物05-115被描述为留尼汪暴发的祖先基因型（基因型1），而分离物06-049（基因型4）被描述为在三个不同的同义替换和E1蛋白中的一个氨基酸变化（Ala–>Val；位点226）后出现[8]在感染实验中，肌肉细胞（增殖和终末分化的肌管）在37°C下暴露于含有1%FCS至约10 ffu/细胞CHIK病毒分离物的培养基中2小时。培养物在添加50µg/ml庆大霉素和2%胎牛血清的Ham’s F-10培养基中保存24、36、48和72小时（根据实验）。使用模拟感染的肌肉细胞培养物（卫星细胞或肌管）进行对照实验。

结果

体外研究：临床病例

为了确定肌肉内CHIK病毒的可能细胞靶点体内分析了两名肌炎综合征感染患者的活检结果(图1A). 1号患者是一名67岁男性，有CHIK病毒感染的典型临床表现，包括多关节痛、头痛和肌痛。此外，观察到肾功能衰竭和横纹肌溶解症的迹象（CPK 41.600 IU/mL）。症状开始后约10天，在疾病急性期结束时进行股四头肌活检，以进行病理诊断。在接下来的几周里，1号患者康复了。2号患者是一名71岁的女性，她于2006年1月患上了典型的CHIK病毒综合征，包括头痛、关节痛和皮疹。大约三个月后，她因经典CHIK病毒感染的临床表现入院，包括发烧、头痛、关节疼痛和肌痛。然后进行股四头肌活检进行病理诊断。与1号患者相比，这相当于疾病的复发(图1A).

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CHIK病毒感染患者#1和#2的病程和组织病理学数据。

67岁的1号患者（在留尼汪岛CHIK病毒疫情暴发期间进行了股四头肌活检）呈现出CHIK病毒感染的典型临床表现：多关节痛、发热和肌痛。此外，还报告了横纹肌溶解症的症状（肌酸激酶41600 IU/mL）。对股四头肌进行肌肉活检，以便在疾病急性期（红星）进行病理诊断。在接下来的几周里，病人康复了。2号患者是一名71岁的女性，她于2006年1月抱怨头痛、关节痛和皮疹；大约三个月后，她因CHIK病毒感染的典型临床症状入院，包括发烧、头痛、关节疼痛和肌痛。在疾病复发期（红星），对股四头肌进行了活检。1A：1号患者的肌肉活检切片。苏木精-伊红染色。未观察到重要的细胞浸润。可以看到肌肉纤维的萎缩和坏死，以及中央细胞核（箭头）。（放大倍数：×60）。1B：1号患者肌肉活检切片。苏木精-伊红染色。检测到肌肉纤维抽空。（放大倍数：×140）。1C、D：2号患者肌肉活检切片显示，苏木精-伊红（C）和马森三色（D）染色的横切面（C）及纵切面（D）有重要的单核浸润；还观察到大量纤维化（D）；（放大倍率：C:×140；D:×80）

体外研究：组织学

这些肌肉活检的组织学研究揭示了两种不同的病理变化特征。在1号患者活检切片中，散在肌纤维萎缩和坏死(图1A)，可见少量浸润细胞。也可以看到肌肉纤维的真空化(图1B). 相反，2号患者活检切片显示存在广泛的急性和慢性间质混合炎症(图1C)包括间质多形核细胞、淋巴细胞和组织细胞。还观察到大面积坏死和胶原增生，如图1D.

体外研究：免疫组织化学

免疫组织化学鉴定浸润细胞。在1号患者的肌肉切片中，罕见的浸润细胞主要对CD3或CD8或CD68呈免疫反应(图2 D、B、E分别），表明浸润内存在T细胞（抑制/细胞毒性亚群）和巨噬细胞；也观察到罕见或无CD56（自然杀伤细胞）或CD20（B细胞）免疫反应细胞(图2A、C）。

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免疫细胞化学鉴定浸润细胞。

患者#1（A至E）或患者#2（F至J）的肌肉切片按照材料和方法用于以下抗原的免疫细胞化学（免疫过氧化物酶检测）：CD56（小鼠单克隆抗体；Dako；A，E）；CD8（小鼠单克隆抗体；Dako；B，G）；CD20（小鼠单克隆抗体；Dako；C，H）；CD3（新标记物；D，I）；CD68（小鼠单克隆抗体；Dako；E，J）。在患者#1（A至E）中，少数浸润细胞主要检测到CD68和CD3的免疫反应。在2号患者中，大量浸润主要由CD68和CD3免疫反应细胞组成。反染色：henatoxylin-eosin。免疫反应细胞（红棕色）用箭头表示，I和J除外（太多）。放大倍数：×170。

在2号患者的肌肉切片中，发现大量浸润细胞对CD68（巨噬细胞）呈免疫反应(图2J)CD3（T细胞）(图2I). 可见少量CD56、CD8或CD20免疫阳性细胞(图2。F、 G、H）。综上所述，这些模式没有特异性，与病毒性肌炎的诊断相符。

体外研究：免疫组织化学检测病毒抗原

在1号患者的活检中，可以通过免疫组织化学（使用抗CHIK病毒超免疫小鼠腹水）检测CHIK病毒抗原[8]（HMAFs）作为单个细胞(图3B，C)或免疫反应细胞群(图3A、D). 在一些病例中，阳性细胞出现在带有中央核的肌纤维周围(图3C). 通过免疫荧光或免疫过氧化物酶染色，在两种不同的腹水中也得到了类似的结果(图3E). 重要的是，所有免疫反应细胞都呈现出类似卫星细胞的纺锤形曲线形状。如CHIK病毒抗原和层粘连蛋白的双重标记所示，它们位于基底层之下，这一点得到了证实(图3I)或通过对卫星细胞进行CHIK病毒抗原和神经细胞粘附分子双重标记，这是识别卫星细胞的附加标准（数据未显示）。在所有检查的切片中，肌肉纤维未发现CHIK病毒抗原阳性(图3A–E). 此外，我们没有发现浸润细胞和内皮细胞的任何标记。CHIK病毒抗原也可以在2号患者的肌肉活检切片中观察到，尽管数量较低(图3F). 鉴于2号患者的活检是在CHIK病复发期进行的，可以预测，卫星细胞在病毒感染的初始阶段之后仍会受到CHIK病毒的复制。

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1号和2号患者肌肉活检切片中CHIK病毒抗原的免疫细胞化学检测。

在石蜡包埋切片（间接免疫荧光和免疫过氧化物酶）上检测CHIK病毒抗原A–D：在患者#1的肌肉活检切片中检测CHIK病毒（免疫过氧化物酶(图1A：AEC作为基底；图B、C、D:DAB作为基底）。免疫反应性在位于肌管外围的梭形弯曲细胞上检测到，可以是每个显微视野（A、D）的多个细胞，也可以是每个视野（B、C）的单个细胞。在带中央核（C，箭头）的肌纤维周围检测到一些免疫反应细胞（箭头）。E–F：使用免疫荧光技术检测#1（E）和#2（F）患者肌肉活检切片中的CHIK病毒。尽管#1号患者的肌肉活检显示大量细胞呈免疫反应性（E），但根据免疫过氧化物酶技术（immunoperoxidase technique）评估，在肌管外围，#2号患者（F）的肌肉活检切片中可以检测到非常罕见的免疫反应性细胞。G： 用作主要抗体的西尼罗河病毒（IS-98-ST1 srtrain）（来自患者#1的肌肉切片）；未见染色；抗黄热病病毒或登革热1型病毒的血清也获得了类似的结果（数据未显示）。G、 H：非感染患者（G）或HTLV-1感染的肌炎综合征患者的切片[11]（H） 用作对照；未检测到明显的免疫反应。一： CHIK病毒抗原（绿色染色；HMAFs抗CHIK病毒#1）和层粘连蛋白（红色染色；兔抗层粘连素多克隆抗体）的免疫荧光双重标记。注意CHIK病毒免疫反应细胞位于基底层下方。（放大倍数：×300（A、C、D、E、F）；×400（B）；×420（I）；×100（G，H））。

我们通过将腹水用作黄热病、西尼罗河或登革热1型病毒的对照，进一步检查了标记的特异性[8]，[10]。未检测到免疫反应细胞（数据未显示）。此外，在三个不同的未感染对照个体的活检样本中未发现信号(图2G，数据未显示）和来自HTLV-1感染的肌炎综合征患者[11]用抗CHIK病毒HMAF作为一级抗体(图2H).

体外研究

为了检测CHIK病毒是否对人类卫星细胞表现出特殊的嗜性，我们进行了一项在体外方法，根据实验室开发的先前模型（Ozden等人，2005）。用2005-2006年留尼汪疫情期间获得的低侵袭性CHIK病毒株接种分化或未分化为肌管的人类原代肌肉细胞培养物[8]感染多重性从低到高（1或10）。在24小时p.i.时，卫星细胞培养物被两种菌株感染(图4A，以及未示出的数据）。病毒抗原也可以使用针对α病毒核衣壳保守区域的单克隆抗体通过免疫荧光检测[9]信号主要位于内质网样结构(图4B). 在模拟感染的培养物上或在具有不相关抗体的CHIK病毒感染的培养物上未检测到信号（数据未显示）。有趣的是，在分化的肌管培养物上，使用抗CHIK病毒HMAF或核衣壳单克隆抗体，未观察到免疫反应（数据未显示和图4D). 在24小时和36小时p.i.时，其他两名供体的肌肉细胞也获得了类似的结果(图4E，F). 在48小时p.i.时，大约100%的细胞受到感染，无论是病毒分离物还是供体（参见图4C). 在所有病例中，在24至72小时p.i.之间观察到强烈的细胞病变效应，在感染后96小时，几乎所有感染细胞都已死亡（数据未显示）。斑块滴定法的病毒产量分析表明，病毒产量达到3至6 106感染后24小时的FFU/mL降至4–9.5 105感染后72小时的FFU/mL，与细胞死亡平行(图4G).

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CHIK病毒感染培养的人类肌肉卫星细胞。

如前所述，从股四头肌（手术废料）中分离出人类肌肉卫星细胞[12]; 它们生长在盖玻片上，一旦分化为mytube或不分化为myTube，就会感染两种不同的CHIK病毒分离物[8]（隔离05-115和06-049）或单独车辆。在感染实验中，肌肉细胞（卫星和肌管）在37°C的培养基中暴露2小时，培养基中含有1%的FCS至CHIK病毒分离物06-049和05-115的约1至10 pfu/细胞。将培养物在补充有2%胎牛血清的Ham’s F-10培养基中保存24、36、48和72小时（根据实验）。免疫细胞化学分析如图2丙酮固定后，通过间接免疫荧光或免疫过氧化物酶。A： 通过免疫荧光检测CHIK病毒感染（m.o.i.10）后生长24小时的卫星细胞上的CHIK病毒抗原。HMAF抗CHIK病毒#1；（放大倍数：×250）。B： 使用抗α病毒核衣壳的单克隆抗体，通过免疫荧光检测CHIK病毒感染（m.o.i.10）后生长24小时的卫星细胞上的CHIKV抗原[9]（放大倍数：×1000）。C： 通过免疫荧光检测CHIK病毒感染（m.o.i.10）后生长48小时的卫星细胞上的CHIK病毒抗原。HMAF抗CHIK病毒#1；（放大倍数：×400）。D： CHIK病毒感染（m.o.i.10）后24小时，未出现肌管感染，使用HMAF抗CHIK病毒作为主要抗体。（放大倍数：×200）。E和F：通过免疫过氧化物酶检测CHIK病毒感染（m.o.i.10）后生长36小时的卫星细胞（来自两个不同供体）上的CHIK病毒抗原。HMAF抗CHIK病毒#1；（放大倍数：×200（E），×400（F））。G： CHIK病毒感染后24和72小时，供体#1的卫星细胞产生病毒。如前所述，通过菌斑滴定法对培养的蚊子细胞进行病毒产量分析[8]并表示为UFF/mL。

讨论

在拉留尼旺爆发前所未有的大规模CHIK病毒后[3]，[4]，[13]2005年，本研究首次报道了与人类CHIK病毒感染相关的肌炎的解剖病理学。尽管少数（患者#1）或大量（患者#2）浸润细胞的表达模式没有特异性，并且与柯萨奇病毒等病毒性肌炎的诊断一致[14]，这些结果构成了对人类肌肉卫星细胞选择性病毒感染的首次观察。肌肉卫星细胞是肌原性前体细胞，以静止细胞的形式存在于成熟骨骼肌中[15]它们位于肌纤维的基底层之下，通过细胞融合为生长中的肌纤维提供肌核。它们被认为是负责产后肌肉生长和修复的主要细胞类型，如果不是唯一的话[16]由于在急性危象发生三到四个月后观察到CHIK病毒感染细胞，我们假设前体细胞感染可能会对患者的长期肌肉生理产生病理后果。与此相一致，卫星细胞的敏感性可能对人类CHIK病毒感染的生理病理学至关重要，病毒可能在肌肉组织上持续存在，导致复发性肌痛。这些观察的另一个结论是，患者#2的切片显示出比患者#1更多的浸润细胞（主要是巨噬细胞和T细胞），但卫星细胞对CHIK病毒抗原的免疫反应更少。由于2号患者对应于疾病的更慢性阶段，可以假设一些CHIK病毒感染的卫星细胞可以通过直接的细胞病变效应或免疫反应被清除。

人类CHIK病毒感染的发病机制尚不清楚。在最近的一项研究中，发现拉留尼旺爆发的CHIK病毒分离物感染在体外人上皮细胞和内皮细胞、原代成纤维细胞，以及在较低程度上由单核细胞衍生的巨噬细胞，但不是原代淋巴细胞和单核细胞，也不是单核细胞派生的树突状细胞[17]肌肉细胞被认为是α病毒感染的靶细胞[18]，[19]，[20]，[21]，[22]在鲑鱼和鲑鱼被甲型病毒（如睡眠病病毒）感染期间，已观察到肌肉坏死[22]据报道，马亚罗病毒可诱发人类肌痛和动物模型肌肉坏死[23]除这些改变外，还报道了肌肉甲病毒感染，如罗斯河病毒在小鼠模型中的感染[20]，[24]感染并导致肌纤维变性的盖塔病毒[18]，或感染小鼠肌肉培养物的Semliki森林病毒[25]然而，这些研究要么是在动物模型上进行的，要么只是基于对人类的临床观察，而病毒感染的细胞靶点要么没有在肌肉内确定，要么被确定为肌肉纤维和/或浸润细胞。

我们基于CHIK病毒感染人类卫星细胞的实验模型可能有助于深入了解作为CHIK病毒附着因子或受体的细胞表面分子的调控表达。事实上，已经有报道称，在发育过程中差异表达Sindbis病毒受体的小鼠脑细胞上，存在对α病毒受体的这种调节[26].

CHIK病毒选择性感染参与肌肉修复的祖细胞的能力，为我们理解通过坏死、肌肉再生缺陷以及病毒库在复发性危象中的作用导致的致病性肌病的长期演变提供了新的关键。在这种情况下，进一步观察，尤其是对患有复发性肌痛危象的患者进行观察，将提供有关肌肉内慢性感染和坏死/再生过程的宝贵数据，并有助于评估CHIK病毒感染患者持续感染肌肉细胞的相关性。

致谢

H.Khun和M.-C.Cumont的技术援助得到了认可。K.Mamchaoui（巴黎肌肉研究所人类细胞平台）因其在制备原代肌肉细胞方面的帮助而受到认可。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：P.V.A.是法国研究部的接受者。这项工作得到了法国心脏病协会、皮耶雷特·玛丽·居里大学、国家科学研究中心、欧洲委员会ANR/MIME、INSERM、MYORES卓越网络（第六届FP；合同511978）和“基孔肯亚”康复跨学科计划的支持巴斯德研究所。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃