低氧诱导因子α途径在骨骼发育过程中将血管生成与骨生成耦合

成骨细胞中缺乏Vhl的小鼠HIFα上调。

为了研究HIFα在体内骨发育中的作用，我们建立了基因小鼠模型，用于调控成骨细胞中HIFα的水平。在第一个模型中，我们通过破坏成骨细胞中HIFα的表达，产生了小鼠沃尔表达由骨钙素（OC）启动子（OC-Cre）驱动的Cre重组酶的小鼠(7)与纯合小鼠杂交，获得loxP侧翼（floxed）沃尔等位基因（以下简称对照）(8)获得缺乏的老鼠沃尔（以下简称Δ沃尔)因此HIFα在成骨细胞中过度表达。为了确定沃尔在成骨细胞中缺失，我们使用从选定组织中分离的DNA进行等位基因特异性PCR。这些结果表明，Cre介导的沃尔等位基因（Δ弗洛克斯)仅发生在骨组织中（图​（图2A）。2A） ●●●●。股骨远端固定切片免疫组化显示，Δ沃尔鼠标（图​（图2B）。2B） ●●●●。在体外，感染腺病毒Cre以删除漂浮物后，成骨细胞中HIFα途径的激活也被证明沃尔等位基因。细胞质和细胞核中的pVHL水平均被消除，这与核部分中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达增加有关（图​（图2C）。2C） ●●●●。这些变化伴随着HIF靶基因mRNA表达的增加维格夫和葡萄糖转运蛋白1（图​（图2D）。2D） ●●●●。所有3人的转录本表达维格夫异构体(维格夫₁₂₀,维格夫₁₆₄，以及维格夫₁₈₈)在以下方面也受到了同样的监管沃尔删除（补充图1；本文的在线补充资料；doi:10.1172/JCI31581DS1）。

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图2

成骨细胞特异性、Cre介导的缺失沃尔.

(A类)aΔ中选定组织中Cre介导重组的PCR分析沃尔鼠标。重组等位基因（Δ弗洛克斯)仅存在于骨组织中。(B类)6周龄对照组和Δ组股骨远端的代表性组织切片沃尔用方法中所述的针对pVHL（左）、HIF-1α（中）或HIF-2α（右）的抗体染色后的小鼠。切片用苏木精复染。红色箭头表示成骨细胞中的阳性染色和黑色箭头表示阴性染色。原始放大倍数，×400。(C类和D类)汇合单层沃尔用Ad-GFP或Ad-CreM1（100 MOI）感染漂浮的原代成骨细胞48小时。(C类)分别提取细胞质和细胞核中的蛋白质，并用抗pVHL、HIF-1α和HIF-2α抗体进行免疫印迹分析。TBP和α-微管蛋白的免疫印迹分别用作核蛋白和细胞质蛋白的负荷对照。TBP、TATA盒-结合蛋白。(D类)腺病毒感染48小时后，从成骨细胞融合单层中提取总mRNA，并对其进行基因表达沃尔,维格夫，以及葡萄糖转运蛋白1通过实时定量PCR检测。白色条表示Ad-GFP感染；黑色条表示Ad-CreM1感染*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.

成骨细胞中Vhl的丢失增加了长骨体积。

Δ沃尔小鼠按预期的孟德尔比率出生，其大小和重量与对照鼠相似。与野生型对照组相比，长骨的μCT显示突变股骨的骨体积显著和渐进性增加（图​（图3，三、A和B）。为了定量评估骨转换，从Δ沃尔小鼠和3周龄的对照同窝鼠，此时小鼠的骨骼建模非常活跃(7). 与μCT结果一致，骨体积显著增加(P（P）= 0.014; 图​图3C），三C） 而小梁分离大大减少(P（P）= 0.008; 图​图3D）三D） 单位Δ沃尔老鼠。然而，此时成骨细胞的数量（补充图2A）和骨形成率（图2A​（图3E）三E） 与对照组相比升高，表明Δ沃尔老鼠可能出现得更早。为了研究这种可能性，对7日龄Δ的股骨进行了组织形态计量学分析沃尔和对照小鼠。此时，与对照组相比，双钙黄绿素标记显示突变小鼠的骨形成速度加快（图​（图3F）。三F） ●●●●。此外，成骨细胞数量在7天龄时显著增加沃尔小鼠与对照组的比较(P（P）= 0.039; 图​图3G）。三G） ●●●●。因此，这些结果表明，骨骼建模在Δ沃尔早在7天大的小鼠。排除小梁骨体积大幅增加掩盖了成骨细胞绝对数量增加的可能性沃尔小鼠，我们测量了Δ中每个组织面积的成骨细胞数量沃尔和对照组小鼠分别为3周龄（补充图2B）和6周龄（数据未显示）。每个组织面积计算的成骨细胞数在Δ沃尔骨头。作为成骨细胞活性的额外测量，我们测定了Δ沃尔和对照小鼠。这些结果表明沃尔突变体（补充图2C）。综上所述，这些数据表明骨骼建模在Δ中增加沃尔小鼠在出生后的第一周内，但在出生后发育的后期似乎有所下降。

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图3

中断沃尔成骨细胞中长骨体积增加。

(A类)Δ的股骨代表性μCT图像沃尔对照组小鼠为3周龄、6周龄和12周龄。比例尺：5.0 mm(B类)6周龄Δ的代表性股骨横截面沃尔和对照小鼠。比例尺：1.0 mm(C类–E类)对Δ沃尔方法中描述的3周龄小鼠和对照组。骨小梁体积的比较(C类)，小梁分离(D类)和每个成骨细胞的成骨率(E类)控制中（白色条；n个=6）和Δ沃尔小鼠（黑条；n个=7）。数据表示平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. (F类)七日龄小鼠在处死前用连续剂量的钙黄绿素标记。来自对照组和Δ的股骨远端代表性钙调素标记切片沃尔展示的是老鼠。原始放大倍数，×400。(克)在7日龄Δ的股骨远端进行成骨细胞数量的定量组织形态计量学测量沃尔（黑色条；n个=3）和对照小鼠（白色条；n个= 3). 数据表示平均值±SEM*P（P）< 0.05.

从理论上讲，突变动物的骨积累增加可能是由于骨吸收缺陷所致，这可能与破骨细胞的数量和活性减少有关。然而，在3周时，以每骨表面数量或每总组织面积数量表示的破骨细胞数量与对照组没有显著差异（补充图3，A和B）。此外，骨保护素（OPG）是一种破骨细胞抑制细胞因子，其血清水平在突变体中同样不受影响（补充图3C）。因此，这些数据表明沃尔突变体主要来源于早期成骨细胞数量和活性的增加。事实上，破骨细胞衍生的抗酒石酸酸性磷酸酶5b型（TRAP 5b）的血清水平在6周龄时略有下降沃尔小鼠（补充图3D）。这些结果表明，成熟Δ沃尔小鼠，至少在一定程度上解释了出生后骨骼获取的逐渐增加。

成骨细胞中HIFα的过度表达并不影响颅骨的形成。

如上所述，颅骨扁平骨形成的机制（膜内骨化）不同于长骨形成的机理（软骨内骨化）。令人惊讶的是，老鼠缺少沃尔颅骨形态无明显变化。大体μCT和组织学分析显示，对照组和Δ沃尔鼠标（图​（图4A）。4A） ●●●●。定量组织形态分析显示骨体积（图​（图4B）4B） 和成骨细胞数量（图​（图4C）4C） 在Δ中沃尔小鼠与对照组无显著差异。缺乏效果沃尔颅骨突变不是由于颅骨切除不全所致沃尔该组织中的基因（图​（图2A）。2A） ●●●●。因此，这些结果表明，HIFα在小鼠成骨细胞中的过度表达似乎优先促进软骨内过程形成的骨的获取。

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图4

损失沃尔成骨细胞不改变颅骨。

(A类)12周龄Δ颅骨的典型μCT图像沃尔和控制老鼠（顶部）。比例尺：2.0 mm。下图显示6周龄对照和Δ沃尔老鼠。原始放大倍数，×100。(B类和C类)对6周龄Δ的颅骨切片进行骨体积和成骨细胞数量的定量组织形态计量学测量沃尔（黑色条；n个=3）和对照小鼠（白色条；n个= 3). 数据表示平均值±SEM。

ΔVhl小鼠长骨体积增加与血管生成和Vegf生成增加相关。

尸检时，我们注意到沃尔与对照骨相比，突变体的血液灌注更丰富（图​（图5A），5A） ，建议删除沃尔可能影响骨发育过程中的血管生成。直接评估沃尔我们进行了对比增强μCT成像。微丝灌注骨血管系统的μCT成像显示Δ中血管系统密度显著增加沃尔早在7天龄时，随着年龄的增长，血管数量逐渐增加（图​（图5B）。5B） ●●●●。定量分析表明，血管表面和体积均在Δ中增加沃尔小鼠相对于对照组（图​（图5，5、C和D）。这些观察结果表明沃尔随着成骨细胞中HIFα的上调，促进骨血管形成的血管生成因子的产生增加。与这个想法一致，2个HIF靶基因的表达，维格夫（图​（图5E）5E） 和磷酸甘油酸激酶(Pgk公司)（补充图4A），在Δ的小梁骨中上调沃尔股骨。血清VEGF水平在Δ沃尔ELISA测定的小鼠（补充图4B）表明，HIFα介导的VEGF上调仅在骨骼局部发生。

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图5

Δ长骨血管生成增加沃尔老鼠。

(A类)Δ后肢照片沃尔和对照小鼠。(B类)7日龄和3周龄Δ微丝灌注股骨血管的典型μCT图像沃尔和对照小鼠。比例尺：1.0 mm(C类和D类)微过滤器灌注Δ对股骨内血管表面和体积的形态学分析沃尔（黑色条；n个=3）和控制（白色条；n个=3）小鼠。数据表示平均值±SEM**P（P）< 0.01. (E类)原位杂交分析维格夫3日龄对照组和对照组组织切片上的mRNA沃尔变异股骨。原始放大倍数，×40。(F类–我)体外血管生成试验。从对照和Δ沃尔E17.5胎儿，在α-MEM中培养14天。使用方法中描述的抗CD31抗体进行检测。显示了具有代表性的图像。原始放大倍数，×25。(F类)对照跖骨几乎没有可检测到的内皮细胞发芽。(克)用重组VEGF（10 ng/ml）治疗的对照跖骨中出现大量内皮细胞发芽。(H（H）)Δ处大量内皮细胞萌芽沃尔用小鼠对照IgG（100 ng/ml）治疗后，跖骨保持完整。(我)内皮细胞在Δ中发芽的特异性抑制沃尔使用VEGF-中和抗体（100 ng/ml）的跖骨。数据代表了3个独立实验。

为了进一步研究VEGF在Δ沃尔我们使用E17.5小鼠跖骨的外植体进行了血管生成检测。对照组跖骨显示出少量内皮细胞发芽（图​（图5F），5F） 经重组血管内皮生长因子治疗后，其显著增强（图​（图5G）。5G） ●●●●。相比之下，内皮细胞从Δ沃尔跖骨比对照组大得多，用VEGF-中和抗体预孵育后，跖骨几乎消失了（图​（图5I），5一） ，但不带控制IgG（图​（图5H）。5H） ●●●●。这一发现表明VEGF在Δ的长骨中上调沃尔并有助于增加骨组织中的血管生成。

成骨细胞HIFα的上调与血管生成无关，但不会改变成骨细胞的增殖和凋亡。

上述结果表明，Δ沃尔小鼠部分是通过对血管生成的细胞自主作用而发生的。为了研究HIFα过度表达对独立于血管生成的成骨细胞性能的可能细胞（成骨细胞）自主作用，我们测定了HIFα过表达对成骨细胞增殖、存活和分化的影响沃尔使用腺病毒驱动的Cre。删除沃尔以这种方式导致HIF-1α和HIF-2α的预期上调（图​（图2C）2C） 但使用BrdU-流式细胞术评估，对增殖和凋亡没有显著影响（图​（图6，6、A和B）和膜联蛋白V染色细胞（图​（图6，6、C和D）。接下来，我们通过在含抗坏血酸的培养基中培养细胞并染色碱性磷酸酶（ALP）和von Kossa来评估骨矿物质沉积，从而确定HIFα上调对成骨细胞分化的影响。中断沃尔与感染GFP病毒的对照细胞相比，对ALP的表达没有明显影响，钙化结节的形成略有增加（图​（图6，6，E–G）。此外，runt相关转录因子2的表达(运行2)和OC公司，早期和晚期成骨细胞分化的标记物在沃尔-缺陷细胞（图​（图6H）。6H） ●●●●。这些结果表明沃尔成骨细胞中HIFα的上调对体外成骨细胞性能的影响最小，进一步表明体内成骨细胞HIFα过度表达主要通过细胞自主作用促进血管生成来促进骨形成。

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图6

删除沃尔体外培养的原代成骨细胞不影响成骨细胞的增殖和凋亡。

合流沃尔用腺-GFP或腺-CreM1（100MOI）感染漂浮的原代成骨细胞单层。沃尔感染48小时后通过实时PCR检测感染成骨细胞的mRNA表达，以评估缺失效率。按照方法进行细胞增殖、凋亡和分化分析。(A类和B类)用流式细胞术检测BrdU掺入对细胞增殖的影响。(C类和D类)采用annexin V–PE染色，流式细胞术检测细胞凋亡。(E类)细胞在成骨培养基中培养7和14天后，通过ALP（左）和von Kossa染色（右）检测矿化结节的形成。(F类和克)在中观察到的ALP和von Kossa染色的密度分析E类使用NIH ImageJ 1.36b。数据表示平均值±SEM(H（H）)测量沃尔,Hif1a型，runt-related转录因子2(运行2)、和OC公司在成骨诱导第14天通过定量实时PCR进行mRNA表达**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.

骨骼表型、组织学分析和原位杂交。

使用μCT（μCT20；SCANCO Medical）扫描完整的右股骨，以评估骨量、密度、几何形状和小梁微结构。根据这些数据计算的参数包括股骨远端干骺端的小梁厚度、数量、分离和连通性，以及中段骨干的皮质厚度和横截面积。动态骨形成速率通过在牺牲前2天和6天连续注射2次剂量的钙黄绿素（8mg/10ml无菌盐水）来测量，所述钙黄绿素总共递送0.25ml。解剖小鼠股骨和颅骨，用10%的福尔马林缓冲液固定，用8%的钠脱钙₂EDTA，石蜡包埋，用标准方法进行H&E染色。对于免疫组织化学，抗原检索是通过在10 mM柠檬酸钠（pH 6.0）中煮沸5分钟来进行的。用HIF-1α（C-19；Santa Cruz Biotechnology Inc.）、HIF-2α（Novus Biologicals）和pVHL（BD Biosciences-Pharmingen）抗体培养切片。使用互补基因进行原位杂交³⁵如前所述的S标记核糖探针(9).

血管成像。

骨内血管用μCT成像。按照上述方法制备试样(40). 简单地说，动物被安乐死后，胸腔被打开，下腔静脉被切断。用0.9%的含肝素钠的生理盐水（100 U/ml）在约100 mmHg的压力下通过插入左心室的针头冲洗血管。然后用10%中性缓冲福尔马林对试样进行压力固定。使用肝素化盐水从血管中冲洗福尔马林，并向血管注射含有铬酸铅的不透射线硅橡胶化合物（Microfil MV-122；Flow Tech）。样品在4°C下储存过夜，用于对比剂聚合。从标本上解剖小鼠股骨，并在10%中性缓冲福尔马林中浸泡4天，以确保组织完全固定。随后在甲酸溶液Cal-Ex II（Fischer Scientific）中对组织进行48小时的处理，以脱钙骨骼并促进从周围组织对股骨血管进行图像阈值化。使用高分辨率（16μm各向同性体素大小）μCT成像系统（μCT40；SCANCO Medical）获得图像。根据阈值2D断层图像的视觉解释，最初选择了306个阈值。评估组织形态计量学参数，包括血管体积、连通性、数量、厚度、分离度和各向异性程度。

胎鼠跖骨血管生成试验。

按照前面讨论的既定方法进行该分析(41). 简单地说，从定时妊娠小鼠中取出E17.5胚胎，并解剖跖骨。将分离的跖骨培养在24孔组织培养板中，在150μlα-MEM中加入10%的热灭活FBS和1%的青霉素/链霉素，培养72小时。然后更换250微升新鲜培养基，跖骨培养14天，每3天更换一次培养基。然后在室温下将外植体固定在福尔马林锌中15分钟，然后使用针对小鼠CD31的大鼠多克隆抗血清（BD Biosciences-Pharmingen）对CD31进行染色。六倍培养，每个完整实验至少重复两次。

原代成骨细胞分离培养、缺氧实验和腺病毒感染。

通过在1.8 mg/ml I型胶原酶（沃辛顿生化公司）溶液中连续消化，从新生小鼠颅骨分离成骨细胞。在37°C下，在持续搅拌下，将Calvaria在10 ml消化溶液中消化15分钟。然后收集消化液，再重复消化4次。将含有成骨细胞的消化液3-5混合在一起。离心后，获得成骨细胞，并在37°C的含10%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM中培养，培养箱中提供5%CO₂为了检测实验性缺氧的影响，细胞在培养过程中的不同时间在缺氧条件下（2%氧气）培养，或在常压条件下（21%氧气）维持。将低氧细胞中测得的所有终点与在常压条件下保存的细胞中的终点进行比较。在大多数实验中，单层成骨细胞感染了对照腺病毒（Ad-GFP）或Cre重组酶病毒M1（Ad-CreM1）（Vector Laboratories），MOI为100。48小时后采集成骨细胞。从感染的成骨细胞中提取总mRNA，通过实时PCR进行缺失验证，并提取蛋白质进行免疫印迹。将剩余的细胞重新放置在100 mm组织培养板上，并进行增殖和凋亡试验，或放置在6孔板上进行矿化试验。

体外成骨细胞增殖和凋亡。

将小鼠原代成骨细胞放置在密度为10的100 mm板上⁶细胞/平板，在添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM中培养24小时。然后将细胞在含有1%FBS的α-MEM中饥饿12小时，然后用10%FBS替换α-MEMs中的细胞，并再培养12小时。为了进行增殖试验，在收获前2小时将BrdU（10μM）添加到培养基中。按照制造商的说明，用荧光抗BrdU抗体和7-氨基放线菌素D对细胞进行染色（BD Biosciences）。对于凋亡测定，添加膜联蛋白V–PE（BD Biosciences）和7-AAD进行染色。通过FACSCalibur（BD）分析成骨细胞，收集20000例事件。

ALP和von Kossa染色。

成骨细胞被镀在密度为10的6孔板上⁵细胞/孔，在α-MEM中培养，直至融合。然后将培养基改为成骨培养基，向α-MEM中添加β-甘油磷酸（10 mM）和抗坏血酸（50μg/ml）。然后培养成骨细胞14天，每3天更换一次培养基。以萘酚AS-MX磷酸盐（Sigma-Aldrich）为底物，以固红TR盐为偶联剂，对细胞中ALP活性进行组织化学染色。将3%硝酸银溶液加入福尔马林固定细胞并将细胞暴露于紫外线下进行Von-Kossa染色。黑色结节的形成证明了钙的沉积。使用NIH ImageJ 1.36b（http://rsb.info.NIH.gov/ij/）对ALP和von Kossa染色进行密度分析。

定量实时PCR。

使用TRI从成骨细胞中提取总RNA佐尔制造商推荐的方法（Invitrogen）。使用A260/A280比率分光光度法估计RNA的产量和纯度。使用SuperScript第一链合成系统（Invitrogen）将三微克RNA反向转录成cDNA。使用SYBR GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems）和序列特异性引物对一微升cDNA进行PCR扩增(沃尔，5′-GCCTCTATTTGCCAACATCACA-3′和5′-TCATTCTCTATGTGGCTTT-3′；Hif1a型，5′-GGAGATCTCGCGAAGCAA-3′和5′-GGTGAGCCTCATAACAGAAGCTT-3′；Hif2a型，5′-CAACCTGCAGCCTCATAC-3′和5′-CACACCGTCTTTCTCGAT-3′；维格夫，5′-CACGCTCAGAGAGCACATCA-3′和5′-TCATCTCTCTATGTGCGCTTT-3′；素食120，5′-GCGGATACAACCTCAAAA-3′和5′-CTCGCTTGTCACACTTTTC-3′；素食164，5′-ACAGGACAAAGCCAGAAAACC-3′和5′-GTTAACTCAAGCTGCTCCT-3′；素食188，5′-GCGGATACCAACCACCAA-3′和5′-GAAAAGCTCACAGTGAAGC-3′；葡萄糖转运蛋白1，5′-GGGCATGTGCTTCCAGTATGT-3′和5′-ACGAGGACCGTGAAGAT-3′；运行2，5′-ATGCTCATTCGCCTCAC-3′和5′-CTCCACGTCCATCTTG-3′；OC公司，5′-TCGCTCACTCTCACTCGTCGAC-3′和5′-GGAGCTGCTGTGACATCC-3′；β-肌动蛋白，5′-CCCAGAGAGAGG-3′和5′-GTCCAGAGAGAGATG-3′）。对每个cDNA进行一式三份的PCR反应，取平均值，并标准化为内源性β-肌动蛋白参考转录物。

免疫印迹分析。

在蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）存在下，用细胞裂解缓冲液使细胞单层均匀化，从而获得全细胞裂解液。根据制造商的说明，使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂分离细胞质和细胞核中的蛋白质（Pierce）。用Bradford法测定浓度后，将30微克蛋白质提取物加载到SDS mini-PAGE系统中。电泳后，使用Bio-Rad半干转移系统将蛋白质转移到PVDF膜上。蛋白质转移效率和大小的测定是使用预先沉淀的蛋白质标记来验证的。然后在室温下用5%的干牛奶在Tris-buffered生理盐水吐温-20中封闭膜1小时，然后在4°C下用一级抗体培养过夜。使用HRP结合二级抗体和SuperSignal West Femto最大灵敏度底物（Pierce）检测信号。使用的抗体包括抗pVHL（BD Biosciences-Pharmingen）、抗-HIF-1α（NB100-105；Novus Biologicals）、抗HIF-2α（NB100-122；Novus Biologicales）、抗-TATA盒结合蛋白（抗-TBP）（Abcam）和抗tubulin（Santa Cruz Biotechnology Inc.）。

免疫荧光和共焦显微镜。

如前所述进行免疫荧光分析(42). 简单地说，将原代成骨细胞置于6孔板中经赖氨酸处理的玻璃盖玻片上。在常压或缺氧条件下培养24小时后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，用0.2%Triton X-100渗透2分钟，并在4°C下用抗-HIF-1α（NB100-105；Novus Biologicals）或抗-HIF-2α（NB100-122；Novus Biologicales）培养过夜抗体的稀释度为1:100。清洗后，将盖玻片与Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠或抗兔IgG（H+L）二级抗体（分子探针；Invitrogen）孵育1小时，并用带有DAPI（Vector Laboratories）的VECTASHIELD固定介质固定。荧光定位通过激光扫描显微镜（LSM-510；蔡司）的共焦显微镜进行检测。在每组实验中，使用相同的共焦设置获得图像，在这些设置下未检测到自体荧光。省略初级或次级抗体的对照组未显示染色。使用Adobe Photoshop 7.0软件处理图像。

ELISA法。

根据制造商的建议，使用ELISA检测小鼠血清中的VEGF、OC、OPG和TRAP 5b。使用的ELISA试剂盒包括小鼠VEGF Quantikine ELISA试剂箱（研发系统）、小鼠OC EIA试剂箱（Biomedical Technologies Inc.）、小鼠OPG检测试剂箱（生物医学）和小鼠TRAP检测试剂盒（IDS）。使用平板阅读器（BioTek）测定光密度。

作者感谢Buer Song和Rosa Serra对体外血管生成检测的帮助。这项工作得到了NIH拨款R01 AR049410的支持。