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分子生物学细胞。2007年6月；18(6): 2305–2312.
数字对象标识：10.1091/桶。E07-01-0073号
预防性维修识别码：项目经理1877086
PMID：17429076

非肌肉肌球蛋白II-B消融和突变小鼠的细胞粘附丧失导致脑积水

马雪飞,通讯作者 鲍建军,和罗伯特·阿德斯坦
保罗·福舍尔，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

由于脑积水，胚胎发育期间小鼠非肌肉肌球蛋白（NM）II-B的消融导致脑室显著扩大和脑组织破坏。我们已经确定了一种短暂的网状结构，这种结构存在于发育过程中小鼠椎管内细胞的顶端边缘。该结构仅包含NM的II-B亚型，还包含β-连环蛋白和N-钙粘蛋白，与细胞粘附的作用一致。小鼠中NM II-B的消融或NM II-B替换为突变体（R709C）数量减少、运动增强的NM II/B会导致网状结构崩溃和细胞粘附丧失。这使得潜在的神经上皮细胞侵入椎管并阻碍脑脊液的流动。NM II-B消融小鼠中枢神经系统的这些缺陷似乎是脑积水的原因。有趣的是，通过增加运动受损NM II-B的表达，可以恢复椎管网状结构和开放性，这也可以挽救脑积水。然而，突变亚型不能完全拯救神经元细胞迁移。这些研究表明，NM II-B的支架特性在细胞粘附中发挥重要作用，从而在小鼠大脑发育过程中预防脑积水。

简介

每1000名活产婴儿中，先天性脑积水影响1至3人。这种异常的结果可能是毁灭性的，因为未经治疗的严重脑积水会破坏脑组织，从而导致智力低下。当脑脊液（CSF）循环受阻导致心室腔内压力升高时，或者当CSF的产生增加或吸收减少时，就会发生脑积水。该缺陷可能伴有Sylvius导水管阻塞，连接第三和第四脑室的狭窄通道（非沟通性脑积水），或正常导水管（沟通性脑水肿）。大多数交通性脑积水的发病机制尚不清楚（有关综述，请参阅Perez-Figares公司等。, 2001;工作人员等。, 2004).

非肌肉肌球蛋白（NM）II是主要的细胞骨架运动蛋白之一，在细胞迁移中起重要作用(斯维茨基纳等。, 1997;妈妈等。, 2004;Even-Ram公司等。, 2007;文森特·蒙扎纳雷斯等。, 2007)，细胞-细胞粘附(康迪等。, 2004;Shewan村等。, 2005;詹诺内等。, 2007)、和细胞分裂(De Lozanne和Spudich，1987年;塔克达等。, 2003;包等。, 2005). NM II的分子结构是一个六聚体，由一对肌球蛋白重链（200kDa）和两对轻链（20kDa和17KDa）组成。在哺乳动物中，已鉴定出非肌肉肌球蛋白重链（NMHC）的三种亚型，即NMHC II-A、II-B和II-C，它们由三种不同的基因编码，我的9,我的10、和我的14在人类中。NMHC在氨基酸方面具有60-80%的相同性，但它们在运动活性方面存在显著差异(戈洛姆等。, 2004;基姆等。, 2005). 一般来说，这三种亚型在脊椎动物中普遍表达，在细胞水平上具有重叠和不同的表达模式。与NMHC II-A和II-C相比，NMHC II-B在大脑中富集，尤其是在神经细胞中。NMHC II-B（B）消融小鼠−/B类−)死于胚胎发育后期，即胚胎期（E）14.5天到出生后第0天（P），心脏和大脑出现异常(图利奥等。, 1997;图利奥等。, 2001). 全部B−/B类−小鼠出现严重的进行性脑积水，伴有脑室表面破裂和大脑结构畸变。先天性脑积水的病因尚不清楚。

为了建立人类疾病的小鼠模型，我们培育了在NMHC II-B运动域携带点突变的敲除小鼠(妈妈等。, 2004). 我们通过将Arg709突变为Cys来做到这一点，从而复制了一个先前已证明在人类中发生的NMHC II-a突变(希思等。, 2001). 有趣的是，NMHC II-C中的同源残基也被证明发生了突变，尽管在这种情况下，是丝氨酸残基(多诺迪等。, 2004). 在之前的报告中，我们描述了从R709C突变体肌球蛋白II-B衍生的重肌球蛋白（HMM）的运动活性(基姆等。, 2005). 我们发现，与野生型HMM II-B相比，突变体只有30%的肌动蛋白激活的Mg-ATP酶活性。R709C HMM II-B对肌动蛋白也表现出很高的亲和力，在体外运动试验中无法推动肌动蛋白丝。

在产生II-B突变小鼠的过程中，我们发现突变等位基因中编码新霉素抗性的盒的存在导致纯合子（B中国/B类中国)小鼠（其中C代表R-to-C突变，N代表新霉素耐药盒）。这些小鼠存活到P20，它们的特征是三组不同神经元的异常迁移(妈妈等。, 2004). 与B类似−/B类−小鼠也出现了严重的脑积水，但比B组更为缓慢−/B类−老鼠。为了了解NMHC II-B消融小鼠和突变小鼠脑积水的潜在原因，我们对B−/B类−小鼠和R709C突变小鼠。本研究的目的是确定NM II-B的哪些特性在小鼠大脑发育中是重要的。这些研究还应有助于阐明人类先天性脑积水的原因。

材料和方法

NMHC II-B R709C突变小鼠

B的生成中国/B类中国和BC/B类C在前一篇文章中描述了老鼠(妈妈等。, 2004). B类中国/B类中国小鼠保持在129/Sv和C57BL/6的混合背景中。生成BC/B类C小鼠，通过穿过B去除漂浮的新霉素抗性盒+/B类中国带有BALB/C CMV-Cre小鼠的小鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）。根据国家心脏、肺和血液研究所动物护理和使用委员会的规定，所有程序均采用经批准的动物方案进行。

组织学和免疫荧光染色

将胚胎收集在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并直接浸泡在pH 7.4的4%多聚甲醛PBS中过夜。通过Histoserv（Germantown，MD）制备厚度为5μm的石蜡切片，用于苏木精和伊红（H&E）或免疫荧光染色。本研究中使用了以下初级抗体：针对NMHC II-A（1:1000）、II-B（1:3000）和II-C（1:1000）的多克隆抗体；菲利普斯等。, 1995;巴克斯顿等。, 2003); 抗N-钙粘蛋白（1:200；佐米德实验室，加利福尼亚州南旧金山）、β-连环蛋白（1:2000；佐米特实验室）、丝氨酸-19磷酸调节肌球蛋白轻链（pMLC20）（1:100；细胞信号技术，丹佛，MA）、非典型蛋白激酶C（aPKC）λ（1:100，BD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥）、，和肌球蛋白轻链激酶（1:1000；西格玛阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）。使用的荧光二级抗体为Alexa 488山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）或Alexa 594山羊抗小鼠IgG（1:250；Invitrogen，Carlsbad，CA）。这些图像是使用SP共聚焦显微镜（德国威兹拉莱卡）收集的。在所有情况下，如果可能的话，都会在室友之间进行比较。对于每个实验中的每个基因型，我们分析了至少五只小鼠。

结果

B型脑积水中国/B类中国和B−/B类−老鼠

为了研究NMHC II-B的作用及其与脑积水病因的关系，我们选择了两个小鼠模型。先前分析NMHC II-B消融小鼠（B−/B类−小鼠）和在II-B（B）运动域点突变的低形态小鼠中国/B类中国小鼠）表明，这两个品系在胚胎发育期间都会出现脑积水(图利奥等。, 2001;妈妈等。, 2004). 然而，B中国/B类中国小白鼠脑积水的发展比小白鼠慢−/B类−而对脑室和周围脑组织的破坏和变形较小。图1显示了B的矢状面和冠状面中国/B类中国小鼠大脑在E14.5显示脑室轻度扩张(图1b） 在P0时，脑室和Sylvius导水管扩张增加(图1、d和f）。如前所述，B−/B类−早在E12.5时，小鼠的脑室就明显扩大，并且脑室严重破裂和变形（参见图9在里面Tullio公司等。, 2001).

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B型脑积水的证据中国/B类中国老鼠。小鼠胚胎脑切片的H&E染色。（a和b）b的矢状截面+/B类+（a） 和B中国/B类中国（b） E14.5的大脑显示脑室轻度扩张（b）和面部神经元异常突起（b，箭头）进入b的第四脑室中国/B类中国老鼠。（c–f）B冠状断面+/B类+（c和e）和B中国/B类中国P0时（d和f）大脑显示脑室和B区Sylvius（AQ）导水管显著扩张中国/B类中国小鼠与B相比较+/B类+鼠标。LV，侧脑室；3V，第三脑室。

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脑桥B区神经元异常迁移C/B类C老鼠。B组脑矢状面切片的H&E染色图像+/B类+和BC/B类CE16.5小鼠。（a和b）在b中+/B类+小鼠，尽管一些脑桥神经元仍位于迁移轨迹（a，箭头），但其中许多已到达最终目的地（b，箭头）。（c和d）在B中C/B类C在E16.5小鼠中，许多脑桥神经元沿着它们的迁移路径聚集在靠近它们产生的地方（c，箭头），而没有一个脑桥神经元到达它们的目的地（d，箭头）。

确定两个B的CNS中最早的异常变化−/B类−和B中国/B类中国我们从E11.5开始分析了小鼠大脑和脊髓的连续切片。图2显示了B椎管的横截面+/B类+，B中国/B类中国、和B−/B类−E11.5和12.5的小鼠。注意，与B相反+/B类+和B中国/B类中国小鼠在E11.5，B椎管−/B类−老鼠很窄，部分受阻(图2c） ●●●●。此外，到E12.5时，B中的运河几乎完全被淹没−/B类−老鼠(图2f） ，并且在B的这个阶段已经部分阻塞中国/B类中国小鼠，那里有神经上皮细胞伸入管内(图2e） ●●●●。图3显示了B椎管的横截面中国/B类中国E14.5处的鼠标与B相比+/B类+室友。此时，B的椎管中国/B类中国小鼠被神经上皮细胞完全阻塞，如低功率(图3b） 以及椎管的放大横截面(图3d） ●●●●。如所示图1与椎管内的发现不同，目前没有证据表明脑室阻塞。因此，中枢神经系统中最早的变化似乎与脑积水的发生直接相关，是从B的E11.5开始的椎管阻塞−/B类−小鼠和E12.5用于B中国/B类中国老鼠。

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B椎管阻塞−/B类−和B中国/B类中国老鼠。小鼠胚胎脊髓横截面H&E染色图像。（a–c）在E11.5处，B椎管+/B类+和B中国/B类中国小鼠心室表面（a和b）完好无损，而b椎管的心室表面−/B类−小鼠被侵入神经管的神经上皮细胞破坏（c）。（d–f）在E12.5处，B+/B类+运河保留专利（d），B中国/B类中国椎管被突起的神经上皮细胞部分阻断（e），B−/B类−椎管几乎完全阻塞（f）。

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B椎管完全阻塞中国/B类中国老鼠。E14.5小鼠脊髓横截面H&E染色图像。B椎管中国/B类中国小鼠完全阻塞（b）；相比之下，B的椎管+/B类+室友是专利（a）。c和d显示B的放大图像+/B类+和B中国/B类中国小鼠。

脊髓管内神经上皮细胞顶端边缘的网状结构

为了了解这些小鼠脑积水的潜在原因，我们使用NMHC II-A、II-B和II-C抗体检查了脊髓。图4使用共焦免疫荧光显微镜研究所有三种NM II亚型以及N-钙粘蛋白在B组脊髓中的定位+/B类+和B中国/B类中国E12.5小鼠。图4b显示，与脊髓的其他区域相比，NMHC II-b在椎管周围的神经上皮层（支架）中富集。或者，如中所示图4c、 与周围区域相比，神经管（支架）周围的神经上皮细胞中NMHC II-c含量较少。NMHC II-A在血管系统中比在神经细胞中更丰富(图4a、 箭头）。用高倍镜检查椎管内的神经上皮细胞表明，NMHC II-B是这些细胞顶端边缘唯一存在的NMHC II亚型，因为它们显示为黄色(图4e、 箭头），当用NMHC II-B（绿色）和N-钙粘蛋白（红色）抗体探测时，表明存在这两种蛋白质。值得注意的是，N-钙粘蛋白和NMHC II-B在神经上皮层的顶端边缘比细胞-细胞边界更富集(图4e；另请参见图5，f–o）。相反，当相同的细胞用NMHC II-A抗体染色时(图4、a和d）或II-C(图4、c和f）以及N-钙粘蛋白，管壁细胞呈红色，表明钙粘蛋白单独存在。图4，g–i，表示B椎管的截面中国/B类中国E12.5小鼠。这些小组证实NMHC II-B是椎管内细胞中唯一的NMHC II亚型。它们还表明，在B中中国/B类中国含有少量NMHC II-B突变型的小鼠，其心尖粘附结构变得不连续，并且下面的神经上皮细胞已伸入管内（*英寸图4，g–i）。

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E12.5处小鼠脊髓横截面的免疫荧光共焦图像。（a–c，d–f中放大）NMHC II-a（a和d，绿色）、II-B（B和e，绿色）和II-c（c和f，绿色）抗体与B中N-钙粘蛋白（a–f，红色）抗体的结合+/B类+小鼠显示只有NMHC II-B与N-钙粘蛋白（B和e，黄色）一起在发育中的小鼠椎管的心室表面（B和e，箭头）显著染色。NMHC II-A主要染色血管系统（A和d，绿色，箭头），NMHC II-C染色神经细胞，但不染色顶端边界（C和f，绿色）。白色括号描绘了神经上皮细胞（见正文）。（g–i）非甲烷碳氢化合物II-A、II-B和II-C在B中的分布中国/B类中国脊髓进一步证实了NMHC II-B（h）而非II-A（g）和II-C（i）在心室表面顶缘的主要表达。白色星号表示神经上皮细胞在B型椎管内异常突出中国/B类中国鼠标。

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在E8.5到E14.5之间的椎管内细胞边界处暂时存在网状结构。E8.5和E14.5之间代表性脊髓的（a–e）H&e染色横截面显示神经上皮细胞层（括号）的变化。E14.5显示，椎管由单层分化的室管膜细胞排列。（f–j）椎管内神经上皮细胞的免疫荧光共聚焦图像（用c中的虚线框表示），并对N-钙粘蛋白进行染色，显示出网状粘附结构，在E9.5和E12.5（g–i）之间的顶端边界最明显。这种结构在E8.5处不明显，在E14.5（f和j）处显著减少。（k–t）NMHC II-B（k–o）和β-catenin（p–t）染色的椎管内神经上皮细胞的免疫荧光共聚焦图像显示，椎管顶端边缘的染色模式类似于N-钙粘蛋白。

接下来，我们将注意力转移到位于发育中椎管神经上皮细胞顶端边缘的网状结构上。为了研究这种结构形成的时间进程，我们分析了E8.5和E14.5之间的野生型脊髓。图5显示了通过光和免疫荧光显微镜检查的切片。前者显示了在此期间椎管周围神经上皮细胞层的变化(图5，a–d，括号）。后几节显示脊髓神经上皮细胞顶端边缘存在网状结构，这是暂时的，在E8.5和E9.5之间生成，到E14.5时消失。注意，NM II-B和黏附蛋白N-钙粘蛋白和β-连环蛋白的这种结构都得到了丰富。值得注意的是，在大脑和脊髓发育的这段时期，许多神经上皮细胞延伸到心室边缘，我们描述的网状结构出现在所有这些细胞的顶部边缘。

图6图a–c显示了野生型小鼠椎管周围网状结构的放大图，该网状结构在E11.5处进行NM II-B（绿色）、β-catenin（红色）免疫染色。NM II-B对该杂岩结构的重要性通过B中网状结构的崩塌来体现−/B类−E11.5小鼠(图6，将h和i与g进行比较）。在B中中国/B类中国小鼠，结构在E11.5时开始分解(图6f） ，E12.5几乎消失(图6e） ●●●●。图6f（箭头）所示为神经上皮细胞突入B椎管的早期示例中国/B类中国鼠标。这表明细胞与细胞之间的粘附在这一区域已经减弱，尽管总体结构仍然存在。图6h表明，NMHC II-B的丢失不仅导致椎管顶端边缘网状结构的塌陷，还导致椎管内顶端结构的不连续。这种结构的破坏使下层神经上皮细胞侵入椎管并阻碍脑脊液的流动。

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椎管内神经上皮细胞的免疫荧光共聚焦图像，B中NMHC II-B（绿色）和β-连环蛋白（红色）染色+/B类+，B−/B类−、和B中国/B类中国老鼠。（a–c）B中的网状细胞粘附结构+/B类+E11.5椎管。NMHC II-B（a，绿色）和β-连环蛋白（B，红色）存在于结构中，并在顶端边界共定位（c，黄色）。（d–f）B中断裂的粘附结构中国/B类中国小鼠（e）与B中发现的正常结构进行比较+/B类+E12.5（d）处的一窝。在E11.5处，粘附结构保持在B中中国/B类中国小鼠（f），但个别神经上皮细胞开始伸出黏附复合体（f，箭头）。（g–i）B衬里的破坏粘附结构−/B类−E11.5（h和i）椎管与B椎管的比较+/B类+运河（g）。粘合结构在B的某些区域（h）中完全不连续或在其他区域（i）中崩溃−/B类−E11.5小鼠。

增加运动损伤突变型非肌肌球蛋白II-B抢救脑积水

然后，我们询问增加内源性突变体NM II-B（R709C）的表达对II-B突变体（B）中野生型水平的影响C/B类C)老鼠。如前所述，我们将B中R709C II-B肌球蛋白的数量增加到野生型水平C/B类C通过交叉B从靶向等位基因中去除新霉素抗性盒后的小鼠+/B类中国CMV-Cre转基因小鼠(妈妈等。, 2004).

有趣的是，增加R709C突变体NMHC II-B在B细胞中的表达C/B类C小鼠恢复了完整的脊髓心室表面。图7b表示b的椎管C/B类C老鼠没有障碍物，并且图7d、f和h表明，位于椎管内细胞顶端边缘的网状结构已经恢复。这一发现表明网状结构的丢失和细胞粘附的减少不仅仅是由于NMHC II-B的突变，而是因为NMHC II-B减少了75%。重要的是，在B中没有观察到脑积水的证据C/B类C直到E16.5小鼠死于心脏缺陷时。这些结果进一步支持了B椎管阻塞的观点−/B类−和B中国/B类中国小鼠在胚胎发育过程中会导致脑积水的发生。

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B椎管内完整心室表面的修复C/B类C老鼠。（a和b）b的脊髓横截面+/B类+（a） 和BC/B类C（b） H&E染色的小鼠显示b区的椎管通畅、通畅+/B类+和BC/B类CE14.5小鼠。（c–h）来自B的E11.5脊髓的免疫荧光共焦图像+/B类+和BC/B类Cβ-catenin（c和d，红色）、NMHC II-B（e和f，绿色）和N-cadherin（g和h，红色）染色的小鼠。突变体NMHC II-B以及粘附分子β-catenin和N-cadherin正常定位，网状结构恢复到B椎管内细胞的顶端边缘C/B类C小鼠（d、f和h）。

先前的工作表明，与野生型NM II-B HMM相比，带有R709C突变的杆状病毒表达的HMM II-B仅具有30%的肌动蛋白激活的Mg-ATPase活性，并且它以稳定的复合体与肌动蛋白结合。与野生型HMM II-B不同，在体外运动试验中，这种肌球蛋白不能推动肌动蛋白丝(基姆等。, 2005). 这表明，通过增加突变NM II-B的数量来恢复椎管内神经上皮细胞的完整性，更多地依赖于NM II-B的结构特性，而不是其运动活性。由于NM II的运动活性是由20kDa调节性肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化调节的，因此检测B细胞中轻链磷酸化的状态是有意义的+/B类+和BC/B类C在脊髓管边缘的细胞中的小鼠。使用MLC20丝氨酸-19磷酸化特异性抗体在这些细胞中没有检测到MLC20丝氨酸-19磷酸化的证据(图8a） ，尽管有证据表明附近血管中存在丝氨酸-19磷酸化（箭头所示）。这些发现支持这样一种观点，即尽管NM II-B是维持椎管顶端边缘细胞-细胞粘附所必需的，但其运动不需要激活。

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aPKCλ和NMHC II-B在脊髓心室表面的定位。脊髓aPKCλ（c）和NMHC II-B（d）染色的免疫荧光共聚焦图像显示，两者在B段椎管壁的心室表面富集+/B类+E11.5小鼠。在b中未检测到显著的pMLC20（a，top）或肌球蛋白轻链激酶（b，MLCK）+/B类+小鼠心室表面。B中未检测到pMLC20C/B类C心室表面（a，底部）。在脊髓的血管系统中检测到pMLC20和MLCK（a和b，箭头所示）。

最近的一份报告今井等。(2006)结果表明，在发育中的小鼠大脑中有条件地消融aPKCλ导致脑室内壁神经上皮细胞的粘附连接丢失。因此，我们使用aPKCλ抗体来分析E12.5脊髓中是否存在这种激酶。如所示图8c、 aPKCλ在脊髓内神经上皮细胞的顶端边缘富集，类似于NMHC II-B(图8d） ●●●●。在E11.5处获得了类似的结果。相反，肌球蛋白轻链激酶在这些细胞中不存在，尽管它在附近的血管系统中表达(图8b、 箭头）。

突变肌球蛋白II不能完全挽救受损的神经元迁移

野生型R709C突变体NM II-B在B中的表达C/B类C小鼠挽救了B区的细胞-细胞粘附缺陷和脑积水−/B类−和B中国/B类中国老鼠。接下来我们检查了是否在B区发现其他脑缺陷中国/B类中国B区突变体NM II-B的表达增加也拯救了面部和脑桥神经元迁移受损的小鼠C/B类C老鼠。因为BC/B类C小鼠死于心脏缺陷E16.5，我们无法观察小脑颗粒细胞的迁移，这也在低形态B中受损中国/B类中国老鼠(妈妈等。, 2004).图9显示了野生型和B型发育中后脑的H&E染色矢状截面C/B类CE16.5小鼠。图中显示了B区的脑桥神经元C/B类C迁移过程中被捕的老鼠。迁移方向是从左到右（中的箭头图9、a和c）以及许多BC/B类C神经元在侧矢状切面左下角的位置表明其迁移延迟(图9c） ●●●●。图9b和d显示了b的脑桥神经元的内侧矢状切面+/B类+小鼠在E16.5时已到达其最终目的地，而脑桥神经元均未到达其在B区的最终目的地C/B类C鼠标（比较箭头图9、b和d；n＝10）。在面部神经元迁移的情况下，20%的BC/B类C小鼠表现出与B组相似的迁移障碍中国/B类中国老鼠(图1b、 箭头）。

讨论

NMHC II-B消融和突变小鼠脊髓管阻塞是脑积水的原因

所有B−/B类−和B中国/B类中国小鼠在胚胎发育期间出现脑积水，除脑积水的晚期外，在这些小鼠中未发现Sylvius导水管阻塞。因此，根据目前的分类，这些小鼠发展为沟通性脑积水。尽管脑脊液在脑室中的流动没有受到阻碍，但早在B区E11.5开始，这些小鼠的脊髓管就被神经上皮细胞的侵袭所阻塞−/B类−小鼠和B中的E12.5中国/B类中国小鼠，这是脑积水发育之前。因此，我们认为这种阻塞是B型脑积水发生的原因−/B类−和B中国/B类中国老鼠。这一假设得到了以下方面的支持：首先，椎管阻塞发生在B区中枢神经系统出现任何明显缺陷之前−/B类−和B中国/B类中国老鼠。第二，抢救椎管阻塞预防B区脑积水C/B类C老鼠。B中突变体R709C NM II-B的表达增加C/B类C小鼠恢复了网状顶端结构和正常的细胞-细胞粘附到管壁细胞上。尽管突变型NM II-B的表达增加会导致B细胞的许多其他异常，但这种拯救脑积水的能力仍然存在C/B类C小鼠，包括腹壁闭合和心脏发育缺陷（Ma和Adelstein，未发表的数据）。

神经上皮细胞的细胞-细胞粘附需要非肌肉肌球蛋白II，但不需要激活其运动域

我们发现一个包含肌球蛋白复合物的短暂网状结构支持NM II的结构作用，这与我们使用运动受损肌球蛋白抢救脑积水的能力一致。由于NMHC II-B是椎管内壁神经上皮细胞中唯一存在的亚型，因此这种亚型的消融使这些细胞比其他细胞更容易发生异常，例如气道和肠道内壁上皮细胞，非肌肉肌球蛋白II的所有三种亚型都在这里表达(戈洛姆等。, 2004). 发现一种独特的网状粘附结构，包括NM II-B、N-钙粘蛋白和β-catenin，促使我们假设NM II-B参与维持脊髓管神经上皮细胞顶端边缘的细胞粘附。正如所料，我们还在网状结构中检测到肌动蛋白，并且肌动蛋白模式在两个B中相似+/B类+和BC/B类C小鼠（未发表的数据）。NMHC II-B参与这些细胞之间的细胞粘附也被报道希尔德布兰德（2005）.

为了确定NMHC II的哪些特性在体内对维持这些细胞的细胞粘附起作用，我们使用了NM II-B（R709C）的突变形式，该突变形式已被证明与肌动蛋白具有高亲和力，但在体外运动试验中不能推动肌动蛋白丝(基姆等。, 2005). 用野生型数量的突变肌球蛋白替换NM II-B可恢复正常细胞粘附并预防脑积水。观察到增加肌球蛋白II突变形式的数量可以拯救细胞粘附，这与肌球蛋白的支架特性在这些情况下比其运动活性更重要的观点是一致的。其他人以前的工作支持肌球蛋白II的结构特性在粘液菌(徐等。, 2001). 我们无法检测到NM II-B的显著激活，这进一步证明了肌球蛋白在心尖复合体中的结构作用，反映在神经上皮细胞的心尖边缘MLC20缺乏丝氨酸-19磷酸化。此外，肌球蛋白的激活并不是维持细胞粘附所必需的，据报道它可以破坏癌细胞系中的粘附连接(Sahai和Marshall，2002年).

值得注意的是，我们最近的发现是NM II-A还可以挽救脑积水和B脊髓细胞粘附缺陷−/B类−当它取代脊髓神经上皮细胞中的内源性NM II-B时（未发表的数据）。挽救B中的这些缺陷−/B类−NM II-A小鼠进一步支持这样的观点，即维持脊髓神经上皮细胞的细胞-细胞粘附并不依赖NMHC II-B的异构体特异性功能，而是依赖II-A和II-B共同的功能，它们的运动特性有显著差异(科瓦茨等。, 2003). 例如，NM II-B的占空比（在与肌动蛋白强烈结合的状态下所花费的动力学循环的一部分）比NM II-a高出一个数量级以上。这与我们的建议一致，即维持神经上皮细胞的细胞间粘附需要NM II的结构特性而不是其运动活性。

此外，我们在这里显示，aPKCλ也与NMHC II-B一起富集在这种粘附结构中。虽然NMHCⅡ-B可能是aPKC∧调节脊髓管内细胞粘附的下游靶点，但在神经元粘附连接处也有其他可能的靶点，如PAR3和Lgl1(山中县等。, 2003;克莱佐维奇等。, 2004;铃木和大野，2006年;瓦西奥金，2006年). 相反，Even-Faitelson和Ravid（2006）有报道称，通过aPKC磷酸化非螺旋尾巴中的NMHC II-B导致前列腺癌细胞系中NMⅡ-B和aPKC的皮质定位。在培养的细胞中都证明了aPKC在细胞-细胞粘附中的需求(铃木等。, 2001,Nunbhakdi-Craig公司等。, 2002)和发育中的小鼠大脑中的神经上皮细胞(真锅等。, 2002). 如上所述，aPKCλ在维持新皮质粘连连接中的重要性通过这种酶的条件性丢失得到了证明，这种酶也会导致脑积水，尽管时间（P3）比我们报道的要晚得多(今井等。, 2006). 这份关于NM II支架特性作用的报告提出了重要而有趣的问题。非运动NM II如何促进粘附结构的生成？NM II和细胞粘附复合物之间的确切关系是什么？这些问题将成为未来体外和体内实验的主题。

桥脑神经元的迁移需要NMHC II-B特异性运动活动

尽管在B细胞中表达了野生型数量的运动增强型R709C突变体NM II-BC/B类C小鼠挽救了脊髓中的细胞粘附，桥脑神经元和面部神经元的迁移异常持续存在。同样，用II-A替换NM II-B也未能修复神经元迁移的缺陷。与负责细胞粘附的肌球蛋白的性质不同，这些神经元细胞的迁移更可能依赖肌球蛋白II-B的运动功能。这也与我们的发现一致，即NM II-B中的MLC20在大脑发育过程中在迁移的脑桥神经元中磷酸化(妈妈等。, 2004).

总之，我们的研究表明，NM II-B在小鼠脑发育过程中对椎管内细胞顶端边缘的细胞粘附起着重要作用。管壁神经上皮细胞的细胞粘附特性更多地取决于NM II-B的结构特性，而不是运动活性。这些发现也揭示了NM II-B在先天性脑积水发病机制中的作用。

致谢

我们感谢卡瓦莫托（Sachiyo Kawamoto）、玛丽·安妮·孔蒂（Mary Anne Conti）和分子心脏病学实验室（Laboratory of Molecular Cardiology）的成员对手稿的宝贵评论。我们感谢斯坦利·拉波波特博士（国家老龄研究所）的有益讨论，感谢审稿人的有力评论。Liu Chengyu博士和Du Yubin博士（国家心脏、肺和血液研究所转基因核心）以及Christian A.Combs博士（NHLBI光学显微镜核心）提供了出色的服务和建议。安托万·史密斯（Antoine Smith）提供了出色的技术援助，凯瑟琳·马格鲁德（Catherine Magruder）的编辑协助也得到了感谢。这项研究得到了NHLBI校内研究部的支持。

使用的缩写：

蛋白激酶C非典型蛋白激酶C
CSF公司脑脊液
E类胚胎期
隐马尔可夫模型重肌球蛋白
MLC20级调节性肌球蛋白轻链
纳米非肌肉肌球蛋白
非甲烷碳氢化合物非肌肉肌球蛋白重链
P（P）产后一天。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07-01-0073)2007年4月11日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会