肿瘤血管被认为是临床上重要的治疗靶点。1肿瘤血管的异常为靶向这些血管提供了可能，而不会破坏正常的血管系统。2,3肿瘤血管被认为是动态的，无论是通过血管生成形成新血管还是重塑现有血管。4,5肿瘤血管也表达可作为治疗药物选择性靶点的新分子，6,7并且存在结构和功能异常，例如泄漏，这对于药物进入癌细胞或肿瘤的其他细胞成分非常重要。8-10
随着肿瘤血管靶向治疗的前景越来越大，对肿瘤血管的细胞结构和功能的深入了解变得更加重要，因为这些信息是解释抗血管生成药物作用的关键。肿瘤血管的内皮细胞在组织、细胞和分子水平上都进行了研究，10-17但对肿瘤血管周细胞的结构和功能知之甚少。18-22
周细胞，也称为Rouget细胞、内皮周细胞或壁细胞，是位于毛细血管和毛细血管后微静脉基底膜内的外膜细胞。23由于周细胞具有多种细胞质过程、独特的细胞骨架元素和内皮细胞的包膜，因此通常被认为是收缩性细胞，能够稳定血管壁并参与微循环中血流的调节。24-26周细胞也可能影响内皮细胞的通透性、增殖、存活、迁移和成熟。27-29缺乏血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）或其受体（PDGF受体-β，PDGFR-β）的小鼠胚胎的血管在动物妊娠晚期死亡之前没有周细胞或血管平滑肌细胞，并发生微动脉瘤和血管渗漏。30，31
周细胞最初是通过其独特的形状和位置来识别的，但现在最常见的是通过分子标记物来识别，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、非肌肌球蛋白、原肌球蛋白，结蛋白、巢蛋白、PDGFR-β、氨肽酶A、氨肽蛋白酶N（CD13）、硫酸酯类或高分子量黑色素瘤相关抗原（NG2）.18,26,31-36这些标记物的表达因血管类型而异。正常毛细血管周细胞通常表达结蛋白，但不表达α-SMA，而正常静脉周细胞表达这两种分子。26标记的表达在不同的器官和病理条件下也可能不同。18,34,35,37由于没有一种常用的标记可以确定地识别所有周细胞，因此当细胞改变标记蛋白的表达时，在病理状态下（如癌症）识别周细胞可能会出现问题。18,34,37
对于肿瘤周细胞标记物表达的变异性知之甚少，因为大多数研究使用单一标记物，通常是α-SMA或结蛋白，并将缺乏免疫反应等同于周细胞缺乏。21,22,38,39已发表的报告表明，不同肿瘤血管周细胞覆盖范围广泛18,20几乎没有。21,22,40其中一些差异可能是由肿瘤周细胞标记物表达的差异所解释的。然而，其他原因可能是用于识别周细胞的标记物的差异或切片厚度的差异，薄组织切片中缺少周细胞的部分覆盖。
确定周细胞是否是肿瘤血管的一致特征的一个原因是通过引导新生血管与内皮芽的结合来探索周细胞是否参与血管生成。41,42另一个原因是为了研究周细胞的缺失会使肿瘤血管对血管内皮生长因子（VEGF）的退出敏感的说法。21
在本研究中，我们比较了由两种标记物α-SMA和结蛋白的免疫反应测定的肿瘤血管周细胞覆盖量与正常血管周细胞的覆盖量。我们还质疑肿瘤中周细胞与内皮细胞的关系是否与正常组织中的不同，并检查周细胞与血管内皮芽的关系。我们比较了小鼠的三种肿瘤：RIP-Tag2小鼠的自发性胰腺肿瘤、植入MCa-IV小鼠乳腺癌和Lewis肺癌。周细胞和内皮细胞在100μm厚的免疫组织化学染色切片中共同定位，并通过共焦显微镜进行检查。已经报告了对这项工作的初步描述。43
材料和方法
肿瘤的动物和制备
在C57BL/6背景的RIP-Tag2转基因小鼠中研究自发性胰岛细胞肿瘤。在这些小鼠中，SV40病毒T抗原的表达由大鼠胰岛素启动子驱动。44通过聚合酶链反应对尾部DNA进行基因分型，确定表达病毒癌基因的小鼠，并在小鼠10周龄时研究肿瘤。44植入MCa-IV小鼠乳腺癌9和Lewis肺癌（American Type Culture Collection，Rockville，MD）分别在同基因雄性C3H和C57BL/6小鼠（25至30g体重）中进行研究。10在背部皮肤下植入两毫米大小的肿瘤块，10至20天后，当肿瘤直径达到8至12毫米时，对其进行检查。小鼠被安置在旧金山加利福尼亚大学动物护理设施的屏障条件下。所有的实验程序都得到了加州大学旧金山分校动物研究委员会的批准。
血管凝集素染色与灌注固定
用肌肉注射氯胺酮（87 mg/kg）和木聚嗪（13 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在一些动物中，异硫氰酸荧光素（FITC）标记番茄将凝集素（100μg/100μl 0.9%NaCl；Vector Laboratories，Burlingame，CA）注入股静脉，并让其循环3分钟，然后灌注固定剂。10迅速打开胸部，在120mmHg的压力下用固定剂[4%多聚甲醛在0.1mol/L磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的溶液，pH 7.4]从18号套管通过左心室的切口插入主动脉，灌注血管系统3分钟。10固定剂之前没有用盐水冲洗。右心房被切开，为固定剂提供了一条逃生路线。切除后，将组织保存在4°C的固定液中，直到进行免疫组织化学处理。
免疫组织化学和成像
标本用PBS冲洗数次，包埋在10%琼脂糖中，用振动棒切割或用30%蔗糖渗透过夜，冷冻，然后用冷冻器切割。在室温下，将100μm厚的切片在抗小鼠CD31（PECAM-1，克隆MEC 13.3大鼠单克隆，1:500；加利福尼亚州圣地亚哥Pharmingen）抗体与抗α-SMA（Cy3-结合小鼠单克隆，克隆1A4，1:1000；密苏里州圣路易斯Sigma Chemical Co.）的混合物中培养12至15小时，用于内皮细胞鉴定或抗结蛋白抗体（兔多克隆1:2000；DAKO公司，Carpindia，CA）用于周细胞鉴定。用含有0.01%硫柳汞（作为抗菌剂）和0.3%Triton X-100的PBS稀释抗体，以提高100μm切片的渗透性。用PBS多次冲洗后，在室温下用标记有FITC或Cy5用于CD31染色或Cy3用于结蛋白染色的山羊抗鼠或山羊抗兔二级抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch的抗体）将标本培养6小时。在Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）安装后，使用蔡司Axiophot荧光显微镜和蔡司LSM 410激光扫描共焦显微镜对标本进行检查。共焦图像存储为数字文件，使用Photoshop（Adobe，Mountain View，CA）查看，并打印在富士象形文字3000彩色打印机上（富士照片胶片公司，纽约州埃尔姆斯福德）。
透射电子显微镜
通过血管灌注0.5%戊二醛和1%多聚甲醛将肿瘤固定在0.075mol/L二甲氨基甲酸钠缓冲液（pH 7.4）中，取出肿瘤，在二甲氨基乙酸缓冲液中的2.5%戊二醛中浸泡至少2小时，并包埋在10%琼脂糖中。10用可控震源切割厚度为100μm的截面。从切片上切下直径约为1×3 mm的试样，用OsO处理4和乙酸铀酰，脱水，嵌入环氧树脂中。45用甲苯胺蓝对0.5μm厚的切片进行光镜染色，用柠檬酸铅对50-100nm厚的切片染色，并用蔡司EM-10电子显微镜进行检查。
形态测量
血管的形态测量是根据四个标本100μm厚切片的图像进行的(n个=4只小鼠）。避免了坏死区域。切片进行CD31和α-SMA免疫反应双重染色。使用配备FITC和Cy3单双滤光片的蔡司Axiopot显微镜和低光三芯片CoolCam CCD相机（SciMeasure Analytical Systems，佐治亚州亚特兰大）观看实时视频图像或拍摄数字图像。测量是使用我们实验室为此目的开发的图像分析软件进行的。45测定每个标本中50条血管周细胞覆盖的血管比例。如果血管周长周围可见α-SMA或结蛋白免疫反应，则认为周细胞存在。在同一标本中测定内皮芽的数量、长度和周细胞覆盖率。萌芽被鉴定为锥形CD31-免疫反应性突起，从血管主轴向外延伸并突然终止。对于每个样本中血管上识别的所有芽（每个样本中每50条血管分析10至27个芽），测量CD31-免疫反应性内皮细胞链的长度（芽长度）和周围的α-SMA免疫反应性周细胞袖（周细胞袖长度）。此外，对于FITC-凝集素染色的每个样本中的10个芽体内(n个每种肿瘤=2只小鼠），测量凝集素染色管腔的长度（管腔长度）和相关的CD31-免疫反应性内皮细胞链。通过测量α-SMA免疫活性细胞覆盖CD31-阳性血管周长的比例，在每个标本的15条适当横切面的血管上测定周细胞覆盖范围。数值表示为平均值±SEM（SEM）。通过方差分析和Bonferroni/Dunn检验来评估平均值之间差异的显著性(P（P）< 0.05).
讨论
通过使用共焦显微镜分析CD31、α-SMA和结蛋白免疫组化染色的三种不同类型小鼠肿瘤血管的三维结构，我们发现周细胞存在多种不同的异常。与相应正常血管上的细胞不同，肿瘤血管周细胞在毛细血管上均匀表达α-SMA，与内皮细胞松散结合，胞质突起投射到肿瘤实质中，并在内皮芽周围形成一个长于芽自身的套筒。这些异常如图10所示.
比较胰腺小动脉、毛细血管和小静脉上正常外膜（内皮周或壁）细胞与肿瘤血管上异常周细胞的示意图，这些细胞代表RIP-Tag2肿瘤、MCa-IV乳腺癌和Lewis肺癌中发现的细胞。小动脉平滑肌细胞形状均匀，周向排列，紧密堆积，和内皮紧密结合。毛细血管周细胞沿血管纵向排列，有长而薄的突起，紧贴内皮细胞，仅覆盖血管表面的一小部分。小静脉周细胞形状不规则，与内皮细胞紧密结合，覆盖了大部分血管表面。相比之下，我们检测的肿瘤周细胞(1)与内皮细胞松散相关(2)具有远离血管壁的过程(三)在某些情况下覆盖其他周细胞，以及(4)伴随内皮芽，甚至延伸到芽端以外。
α-SMA和Desmin作为周细胞的分子标记
我们发现胰腺正常毛细血管周细胞具有结蛋白免疫反应性，但缺乏α-SMA，而小动脉平滑肌细胞和小静脉周细胞对两者都具有免疫反应性。这一发现与已知的肠系膜微血管床相吻合。26相反，我们检查的三种肿瘤中，97%以上的血管（包括毛细血管大小的血管）周细胞丰富，具有α-SMA和结蛋白免疫反应性。表达α-SMA和结蛋白的周细胞包裹着各种大小、形状和形态的肿瘤血管。肿瘤血管没有被归类为小动脉、毛细血管或小静脉，因为它们没有使这种分类有意义的结构特征和层次。
α-SMA和结蛋白的一致共定位表明，两者都是我们检测的肿瘤周细胞的一致标记物。多形性胶质母细胞瘤中也存在丰富的α-SMA阳性周细胞，20但据报道，其他类型的肿瘤具有不同比例的α-SMA阳性周细胞。18,19,22也有报道称，某些肿瘤的周细胞很少或没有α-SMA阳性。21卵巢癌周细胞均匀表达α-SMA和NG2，但一些肿瘤周细胞表达NG2的比例大于α-SMA，18,19表明α-SMA免疫反应的缺乏并不一定意味着周细胞的缺乏。
组织制备方法也会影响肿瘤血管周细胞的表观数量。我们对100μm切片的三维共聚焦图像的研究表明，尽管有周细胞的血管发生率很高，但平均30%至50%的内皮表面没有周细胞覆盖。据报道，某些人类肿瘤的常规组织切片中周细胞丰富，20,46但在薄的组织学切片中，未覆盖的区域可能被误解为缺乏周细胞的血管。
本研究中检测到的肿瘤血管周细胞的丰度与之前的一些研究中所报道的不同，可以部分解释为使用结蛋白和α-SMA作为免疫组织化学标记物，并结合100μm厚的组织切片。肿瘤之间的差异也可能是一个因素。
RIP-Tag2肿瘤血管系统中α-SMA阳性周细胞的均匀存在加强了血管与这些肿瘤中显著的血管外红细胞（血湖）集合之间的区别。10一些人认为这种红细胞集合是肿瘤细胞系血管通道的例子。47然而，RIP-Tag2肿瘤中的血管由内皮细胞和周细胞组成，而这些肿瘤中的血湖仅由肿瘤细胞排列。10尽管它们看起来很像，但血湖似乎并没有与血流相连，也不是血液流动的通道。10因此，血湖中的红细胞是停滞的。
肿瘤进展过程中周细胞的变化
胰岛细胞肿瘤在RIP-Tag2小鼠中异步发生。44每只小鼠体内存在多个肿瘤，这些肿瘤处于不同的发展阶段。RIP-Tag2模型的这一特点导致我们观察到周细胞群在肿瘤进展过程中的异质性丢失。在肿瘤发生过程中，具有毛细血管表型（结蛋白阳性和α-SMA阴性）的周细胞被具有微静脉表型的周细胞所取代或转化为具有微血管表型（结蛋白阳性和β-SMA阳性）的周周细胞，尽管在RIP-Tag2肿瘤中毛细血管仍然占主导地位。较小肿瘤中缺乏α-SMA阳性周细胞也可能反映了同一小鼠中较大肿瘤的抗血管生成作用，表现为肿瘤块抑制肿瘤生长。48MCa-IV癌和Lewis肺癌有大小血管混合，但α-SMA和结蛋白免疫反应在所有血管上共存，无论其大小。因此，周细胞表型的改变不仅仅是肿瘤发展过程中血管扩张的反映。与这些观察结果一致，肝窦上的α-SMA阳性Ito细胞（被认为相当于周细胞）数量在转移性肝癌中增加。49
在肿瘤发生过程中，组织微环境的改变，包括细胞外基质和可溶性因子，可能有助于肿瘤周细胞的表型转化。在含有转化生长因子-β1的培养基中，人脑毛细血管周细胞开始表达α-SMA。50同样，视网膜毛细血管周细胞表达α-SMA在体外但不是体内.26
肿瘤周细胞的形态异常
我们检查的肿瘤周细胞与小静脉周细胞有一些共同特征，但在形态上与小动脉平滑肌细胞有很大不同。尽管如此，肿瘤血管周细胞的结构异常清楚地将其与小静脉周细胞和正常微循环任何部分的外膜细胞区分开来（图10）.
我们观察到的一个异常是肿瘤血管上的周细胞与内皮细胞松散结合，两种细胞的某些区域之间有很大的间隔。周细胞还具有深入肿瘤实质的细胞质突起，这是正常血管所没有的特征。一些共焦图像给人的印象是周细胞在肿瘤内活动。已发表的超微结构观察提供了周细胞在病理条件下被激活的额外线索。发炎血管上的周细胞可能会变形虫样、丰满且有丝分裂活跃。51,52
另一个异常是肿瘤中毛细血管周细胞的覆盖量。我们检查的三个肿瘤中的几乎所有血管都被周细胞覆盖。然而，覆盖范围从RIP-Tag2肿瘤和Lewis肺癌的平均～50%到MCa-IV乳腺癌的高达80%不等。同样，据报道，人类小脑血管母细胞瘤血管周细胞覆盖率为69%。46肿瘤的这些值高于大多数正常毛细血管的值，其中周细胞覆盖量（以内皮表面的比例表示）在心肌中估计为11%，在骨骼肌中估计为21%，在大脑中估计为22-30%，在视网膜中估计为41%。53相反，肿瘤的数值与正常小静脉的数值更吻合，估计骨骼肌的数值为81%。53
此外，在我们检查的三个肿瘤中，基底膜与周细胞和内皮细胞有异常疏松的结合，在某些区域是多层的或延伸到周细胞之外的肿瘤实质中（未发表的观察结果）。这些肿瘤血管上的基底膜是连续的，除了分散的不连续性小于几微米。
周细胞与内皮细胞的异常关系可能改变周细胞对内皮细胞的影响，并导致肿瘤血管的渗漏9,10并解释了肿瘤血管对VEGF退出的敏感性。21
下一个重要的步骤将是解决人类肿瘤血管周细胞是否与小鼠肿瘤中观察到的异常相似的问题。然而，回答这个看似简单的问题可能是一个挑战。我们对三种小鼠肿瘤的研究利用了实验肿瘤的许多特性，包括明确的生长条件、宿主的统一年龄和遗传背景、肿瘤发生的多个阶段以及之前没有治疗，同时利用血管灌注等技术优势优化组织保存条件。由于人类肿瘤周细胞的相应研究无法在这样理想的条件下进行，因此人类肿瘤中周细胞的免疫组织化学和形态学特性可能取决于许多变量，包括肿瘤的组织学类型、分级、分期、解剖位置、年龄、治疗史、，和固定条件。不同类型人类癌症血管周细胞覆盖率的异质性是这些变量的表现之一。22未来对人类肿瘤周细胞异常的研究应该考虑到这些问题。
肿瘤中周细胞与内皮芽生相关
在我们检查的所有三个肿瘤中，都发现了来自血管壁的CD31阳性内皮芽。CD31免疫反应性、来源于内皮细胞、管腔不完整和盲端接符合芽状结构的鉴定。因为焦糖乳杆菌血液中循环的凝集素只对芽的近三分之一染色，很可能远端没有管腔。
我们检查的肿瘤中几乎所有的芽都被周细胞的套筒覆盖。套管延伸到大多数内皮细胞芽的末端。周细胞套筒的领先位置可能反映了这些细胞在芽生长和收缩中的作用。54,55周细胞定期伴随生长血管上的内皮芽，似乎参与芽形成的早期阶段，可能决定芽形成的位置，并引导芽的生长。41,42在卵巢中，周细胞是第一批侵入新血管化黄体的细胞，56肿瘤周细胞在血管生成早期增殖。26本研究中的观察结果与报告一致，即周细胞位于肿瘤生长前沿的血管上，血管生成最活跃。18-20,57在其他情况下，在新形成的血管上也发现周细胞。19,41至于周细胞的来源，虽然我们没有评估周细胞迁移，但伴随芽的细胞可能来自母血管的周细胞，或者是招募到芽的α-SMA阳性基质细胞。
如果周细胞在肿瘤血管生长中发挥重要作用，这些细胞将成为抗血管生成治疗的潜在靶点。在这方面，周细胞对PDGFR-β信号的明显依赖性30,31增加了这些酪氨酸激酶受体抑制剂可能干扰肿瘤血管生成的可能性。58
周细胞可能通过分泌碱性成纤维细胞生长因子促进血管生成59,60或血管内皮生长因子。61肿瘤中内皮芽附近表达VEGF的基质细胞62可能确实是周细胞。周细胞也可能与退化的芽有关，并可能在内皮细胞之前发出血管变性和凋亡的信号。63,64
肿瘤周细胞的起源与功能
周细胞或其前体随着血管系统的发育迁移到肿瘤中。对植入肿瘤的研究表明，结蛋白阳性细胞最初聚集在肿瘤和宿主组织的界面，后来聚集在新血管周围。65在一些肿瘤中，大部分基质细胞表达平滑肌蛋白，是潜在的周细胞前体。66我们发现表达α-SMA和结蛋白的细胞在MCa-IV癌和Lewis肺癌的肿瘤-宿主组织界面处大量存在。其中一些细胞与血管密切相关，但其他细胞则不然。
表达α-SMA和结蛋白但与血管无关的基质细胞通常被称为肌成纤维细胞。这些细胞在许多肿瘤中大量存在。67成纤维细胞与肿瘤细胞共培养可分化为肌成纤维细胞。67周细胞的基质（间充质）起源已被充分证明，26肌成纤维细胞也可能参与其中。由于周细胞在某些条件下可能会离开基底膜而成为壁外周细胞，26周细胞和肌成纤维细胞可能是相互转化的。
