美国国家科学院院刊。2007年5月1日；104(18): 7438–7443.
Akt1控制乳腺癌进展体内
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王晨光同学
癌症生物学和
†美国宾夕法尼亚州费城第十南街233号托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心肿瘤医学中心，邮编：19107；
雅各布·特纳
‡伦巴第综合癌症中心，乔治敦大学医学中心，研究楼，3970 Reservoir Road NW，Washington，DC 20057；和
罗伯特·拉塞尔
‡伦巴第综合癌症中心，乔治敦大学医学中心，研究楼，3970 Reservoir Road NW，Washington，DC 20057；和
苏塞特·穆勒
‡伦巴第综合癌症中心，乔治敦大学医学中心，研究楼，3970 Reservoir Road NW，Washington，DC 20057；和
约翰·奥杰福
‡伦巴第综合癌症中心，乔治敦大学医学中心，研究楼，3970 Reservoir Road NW，Washington，DC 20057；和
威廉·S·陈
§伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，M/C 669，伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰900号，邮编：60607
尼西姆·海伊
§伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，M/C 669，伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰900号，邮编：60607
理查德·佩塞尔
癌症生物学和
†美国宾夕法尼亚州费城第十南街233号托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心肿瘤医学中心，邮编：19107；
癌症生物学和
†美国宾夕法尼亚州费城第十南街233号托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心肿瘤医学中心，邮编：19107；
‡伦巴第综合癌症中心，乔治敦大学医学中心，研究楼，3970 Reservoir Road NW，Washington，DC 20057；和
§伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系，M/C 669，伊利诺伊州芝加哥市南阿什兰900号，邮编：60607
由宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学Craig B.Thompson编辑，2007年2月27日批准
作者贡献：X.Ju、C.W.、S.L.和R.G.P.设计的研究；X.Ju、S.K.、C.W.、M.L.、X.Jiao、S.L.、J.Z.、J.T.、R.G.R.、S.C.M.、J.O.和W.S.C.进行了研究；M.P.L.和N.H.提供了新的试剂/分析工具；R.G.P.写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
丝氨酸苏氨酸激酶阿克特1与细胞代谢、存活和生长的控制有关。在这里，无处不在的阿克特基因家族，Akt1公司，在鼠标中演示了对Akt1公司ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生。Akt1缺乏延迟肿瘤生长和减少肺转移，与磷酸化水平降低相关Akt1公司靶点为结节性硬化症2（TSC2），Ser-939。Akt1公司-缺陷乳腺上皮瘤细胞（MEC）的大小和增殖能力降低，细胞周期蛋白D1和p27降低知识产权1丰富多彩。Akt1公司缺陷消除了三维培养中肿瘤诱导的MEC极化变化，并恢复了肿瘤诱导的磷酸化ezrin–radidin–moesin蛋白的重定位。Akt1公司增加MEC跨内皮细胞屏障的迁移，增强迁移方向的持续性。无偏见的蛋白质组分析证明Akt1公司通过诱导CXCL16和MIP1γ的表达和分泌，通过旁分泌信号介导MEC迁移。Akt1公司控制由ErbB2诱导的MEC极性、迁移方向性和乳腺癌的发病体内。
关键词：细胞周期蛋白D1、ErbB2
细胞存活癌蛋白Akt1公司，也称为蛋白激酶B（PKB），在人类癌症中经常被过度激活。Akt1公司在存在三磷酸肌醇磷脂（PI-3,4,5-P）的情况下补充到质膜。Akt1公司在外部信号通过阻止细胞色素促进细胞存活的能力中起着核心作用c（c）线粒体释放(1——三)通过增加己糖激酶与线粒体的结合来维持线粒体膜的完整性(4). 在哺乳动物细胞中，激活生长因子和致癌基因刺激Akt1激酶活性以促进抗凋亡信号(4). 三个具有高序列同源性的独立基因编码Akt/PKB公司(Akt1/PKB公司α，Akt2/PKBβ,Akt3/PKB公司γ). 底物特异性阿克特亚型是相似的，尽管Akt1公司是大多数组织中表达的主要亚型。Akt1激酶通过肿瘤抑制基因的缺失和突变在人类癌症中发生组成性激活PTEN公司，通过扩增Akt1公司基因或通过PI3激酶催化亚单位的扩增(5——7)。
乳腺癌中常见的ErbB2/ErbB3受体激活可诱导PI3K和Akt1激酶活性(8,9). 这个错误B2在高达30%的人类乳腺癌中，癌基因被扩增，并且与化疗药物的不良预后相关。ErbB2诱导AKT1活性、细胞生长和治疗抵抗(10). ErbB2的激活是人类乳腺癌的早期事件，高达80%的原发性导管癌中Erb B2过表达就地损伤(11). MCF10A细胞的基质培养(12)和原代小鼠乳腺上皮细胞(13)允许对调控上皮细胞极性和管腔形成的遗传事件及其在致癌信号中的作用进行分子分析。
Akt1在保守的Ser残基磷酸化结节性硬化症（TSC）基因2，破坏TSC1/TSC2复合物，从而释放mTOR（雷帕霉素靶点）并激活S6激酶(14,15). Tsc2调节肌动蛋白动力学，诱导皮层F-肌动蛋白分布并调节RhoA活性(16). 关键下游转录靶点的子集，包括叉头配体1（FKHR-L1）、MDM2、BAD、亨廷顿和arfaptin2，被Akt磷酸化(17). Akt1激酶诱导的促增殖和促生存效应是通过调节caspase 9、IκB激酶α、Bad和GSK3β/cyclin D1信号通路的诱导来实现的（参考文献综述）。17和18). 的作用Akt1公司主要通过在培养的细胞中使用表达系统来检测迁移和侵袭。激活Akt1公司促进人胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的细胞侵袭性(19——21)但抑制MDAMB231细胞的迁移(22). 这些研究检查了体内Akt1，使用删除的鼠标Akt1公司基因。
结果
检查Akt1公司在ErbB2诱导的乳腺上皮细胞肿瘤发生中Akt1公司将该基因与靶向乳腺上皮表达ErbB2癌基因（MMTV-ErbB2-8142）的小鼠杂交。表达以下两种等位基因的小鼠Akt1公司获得性乳腺肿瘤，平均肿瘤发病年龄（T50）≈210天。小鼠同时删除Akt1公司等位基因罕见肿瘤(A类). 删除单个Akt1公司等位基因使肿瘤发生率降低约100天。MMTV-ErbB2转基因荷瘤小鼠肺部检测到肿瘤细胞的血源性扩散( B类和C类). 这些小鼠出现多发性肺肿瘤栓塞。观察到肿瘤细胞通过基底膜迁移，提示肺转移(B类). 乳腺癌的细胞学特征与Akt1公司野生型和Akt1公司淘汰动物[支持信息（SI）图6A类]. 删除两者Akt1公司等位基因减少了肺转移。在ErbB2/阿克特−/−虽然肿瘤大小与ErbB2相似，但发生乳腺肿瘤和肺转移的小鼠未被确认/阿克特+/+老鼠(P（P）< 0.05) (C类). ErbB2中发生的肿瘤转移/阿克特+/+小鼠继续表达ErbB2癌基因(D类). 缺失其中一种或两种的小鼠的血管密度增加Akt1公司等位基因(E类). Akt总丰度不变；然而，Akt1于年被废除Akt1公司−/−肿瘤。因为Akt1公司TSC2的磷酸化与细胞生长增加有关果蝇属(15,33)，我们检测了TSC2在Akt1公司小鼠乳腺肿瘤中的Ser-939。在年发生的乳腺肿瘤中Akt1公司−/−小鼠，Tsc2和Rb磷酸化显著降低( F–H（飞行高度）)。
A类第1节-缺陷小鼠对ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生具有抵抗力。(A类)小鼠无ErbB2诱导的乳腺肿瘤的百分比如下所示Akt1公司+/+,Akt1公司+/负极、和Akt1公司−/−转基因小鼠。(B类)年ErbB2乳腺肿瘤血行播散后肿瘤细胞迁移（星号）至肺实质的组织病理学Akt1公司+/+鼠标。(插入)穿透基底膜的迁移性肿瘤细胞的高倍放大。乳腺肿瘤的相似组织学特征Akt1公司野生型和Akt1公司显示敲除小鼠（S1A）。(C类)30只单独的小鼠的肺转移，其中乳腺肿瘤已生长到类似的大小。(D类)ErbB2/ART的肺部肿瘤转移+/+老鼠。ErbB2（棕色）标记转移性肿瘤细胞。(E类)免疫组织化学染色[von Willebrand]作为血管内皮的标记物(SI图6B类). DAPI染色鉴定细胞核。数据为肿瘤不同区域的平均值±SEM（血管/mm2). (F类)每种Akt1基因型小鼠MMTV-ErbB2乳腺肿瘤的蛋白质印迹分析(G公司和H（H）)用密度计定量(D类)。
以更高的分辨率检查分子机制Akt1公司贡献给错误B2-诱导肿瘤发生和生长，细胞系来源于由错误B2在任何一种情况下Akt1公司+/+或Akt1公司−/−老鼠(A类). 衍生出六个品系，每个基因型有三个品系。来自这些动物的乳腺上皮细胞的形态学显示Akt1公司−/−单元格(A类). Western blot分析证实了Akt1公司中的基因Akt1公司−/−小鼠及其表达错误B2转基因(B类). 在细胞悬浮液中Akt1公司−/−细胞直径减少>10%(C类) (P（P）= 0.002).Akt1公司缺乏使基底细胞增殖率降低50%（通过MTT分析评估）(P（P）< 0.05) (D类). EGF和胰岛素使乳腺上皮性肿瘤细胞（MEC）的增殖比Akt1公司−/−MEC公司(D类)。Akt1公司−/−细胞株显示p21丰度降低CIP1级，第27页知识产权1和细胞周期蛋白D1(E类)与调查结果一致AKT1型诱导细胞周期蛋白D1(24)并减少p21CIP1级(9)在培养细胞中。
Akt1降低了Akt1缺陷型乳腺肿瘤细胞的细胞增殖和细胞大小。(A类)MMTV-ErbB2转基因小鼠MEC细胞系的细胞形态学Akt1公司+/+或Akt1公司−/−基因型。(B–D类)蛋白质印迹(B类)，蜂窝直径(C类)和细胞增殖(D类)MEC对生长因子（FGF）的反应，比较F12与10%FBS（5μg/ml胰岛素/10 ng/ml EGF）和F12与生长因子缺失（木炭剥离）培养基。(E类)细胞周期控制蛋白的Western blot分析。GDI是一种蛋白质负荷控制。(F类)蛋白质印迹分析Akt1公司−/−用表达GFP或Akt1的病毒载体转导MEC，并伴有相位对比度和荧光图像。(G公司和H（H）)Ki67评估细胞增殖(G公司)和BrdU染色，通过FACS分析定量(H（H）)。
这个Akt1公司−/−用逆转录病毒表达载体转导MEC，该表达载体编码两种活性成分AKT1型（mAKT）或野生型Akt1公司（cAKT）通过内部核糖体进入位点连接到GFP融合蛋白。Western blot分析显示mAKT和cAKT的表达水平相似(F类). 的表达式AKT1型通过GFP表达鉴定，恢复了Akt1缺陷的形态学变化(F类和SI图7). Ki67染色从30.5%减少到3.8%，BrdU摄取从26.7%减少到6.9%Akt1公司−/−MEC公司( G公司和H（H）). 细胞粘附Akt1公司−/−细胞数量比Akt1公司+/+每个时间点的单元格(A类)。Akt1公司缺乏使细胞迁移减少3.5倍(B类). 细胞迁移的定量显示Akt1公司−/−24小时时的细胞(C类)。
阿克特1缺乏减少细胞迁移和迁移方向。(A类)通过OD550评估ErbB2 MEC在2和6小时时的细胞粘附。(B类和C类)ErbB2 MEC跨井迁移分析(B类)以及在所示时间点通过ErbB2 MECs的损伤测定确定的细胞迁移(C类)。
为了确定内源性Akt1在MEC粘附、极性和形态中的作用，对关键细胞骨架成分进行了分析(A类). 通过F-肌动蛋白罗丹明-阴茎肽染色评估应激纤维。Akt1公司野生型细胞直径较大，皮质F-actin增加。在Akt1公司-MEC缺乏，应力纤维形态在整个细胞中扩散(A类). 帕西林是一种68-kDa对接蛋白，与局灶黏附复合体的成分相关，是在延展跛足的基础上进行局灶黏着分解所必需的(34). paxillin功能的扰动抑制了局部黏附周转，导致极性丧失和方向迁移，Y118的突变分析表明该残基参与调节肌动蛋白动力学(35,36). 在Akt1公司+/+MEC，paxillin分布在细胞核和细胞质中，并与酪氨酸磷酸化paxilin（Y118）在皮质和向心分布中共定位(B类). 在阿克特1−/−MECs酪氨酸磷酸化的帕西林在全身和细胞外周的局部接触处被观察到(B类)。
Akt1公司在3D基质凝胶中调节乳腺腺泡的形成和细胞极性。(A类)将来自转基因小鼠ErbB2肿瘤的乳腺上皮细胞固定，并对其进行F-actin（指骨样蛋白）和DAPI染色。(B类)帕西林的分布和酪氨酸磷酸化帕西林（Y-118）的向心分布。(C类)从每个ErbB2窝友中分离出的MECAkt1公司显示的基因型在重组基底膜上进行25天的3D培养。将菌落固定并用苏木精和伊红染色以显示组织学。培养25天时，对细胞进行DAPI（蓝色）、hDlg（红色）和第页-埃兹林-根素-莫斯因(第页-ERM）（绿色）。(D类)示意图表示Akt1和ErbB2癌基因在乳腺上皮细胞极性和腺泡发育中的作用。
为了进一步研究Akt1公司在细胞形态发生方面，进行了三维MEC培养(37). 众所周知，上皮细胞具有独特的组织学特征，包括极化形态和特殊的细胞-细胞接触。ErbB2/Akt1公司+/+和ErbB2/Akt1公司−/−细胞在基质胶中生长(37). ezrin–radidin–moesin（ERM）复合物将粘附分子与丝状肌动蛋白联系起来，参与细胞迁移过程中的细胞骨架重塑。ErbB2转化扰乱了非转化MEC中hDLg（人盘大）和磷酸化ERM的分布(C类). 删除阿克特1废除了ErbB2介导的MEC极性变化(C类和SI图9). 因此，在阿克特−/−MEC，hDLg抗体呈横向和基础分布。磷酸化ERM的抗体染色分布在腺泡内的质膜下方。这些研究表明Akt1公司三维培养中肿瘤诱导的MEC极性变化(D类)。
Akt1公司缺陷降低了迁移方向性（PMD）的距离、速度和持续性( A–D). 确定Akt1公司涉及到细胞内或细胞外（paracine）信号Akt1公司+/+MEC已添加到ErbB2/Akt1公司−/−MEC公司(A类). ErbB2的介质/Akt1公司+/+MEC修复了ErbB2迁移中的缺陷/Akt1公司−/−单元格( A类和B类). 来自ErbB2的媒体/Akt1公司−/−MEC没有减少ErbB2的迁移/Akt1公司+/+细胞。ErbB2的介质/Akt1公司+/+MEC挽救了ErbB2细胞速度的缺陷/Akt1公司−/−MEC公司(C类). 同样，将AKT1重新引入Akt1公司−/−MEC挽救了迁移缺陷(E类)。
Akt1公司控制MEC中迁移因子的分泌。(A类和B类)在天然上清液或与来自Akt1公司+/+MEC公司(B类). (B–D类)分析错误B2-在本地或异源条件培养基存在下的MEC迁移活动，可量化移动的距离(B类)，细胞速度(C类)，或PMD(D类)（针对n个>6小时内20个细胞）。细胞迁移距离、速度和PMD（D/T）显示为平均值±SEMn个>3个单独的实验。(E类)细胞迁移Akt1公司−/−用编码GFP、mAKT1或cAKT1的pBABE载体转导MEC。(F类)蛋白质组分析显示ErbB2 MEC培养基中分泌的细胞因子和生长因子相对丰富（3天，n个>3个单独的实验）。细胞因子和生长因子蛋白在Akt1公司−/−或Akt1公司+/+MEC公司。通过ELISA和RT-PCR测定分泌配体受体的分泌蛋白丰度。(G公司和H（H）)通过跨阱迁移实验确定由细胞因子阵列鉴定的迁移和抗迁移分泌蛋白的功能意义。通过使用免疫中和抗体（α）或添加配体进行检测(H（H）). 数据显示为平均值±SEMn个>3博伊登室分析。
鉴定由Akt1公司这可能有助于迁移方向性，部署了小鼠细胞因子抗体阵列。大多数细胞因子和生长因子在Akt1公司+/+和Akt1公司−/−机械工程师(SI图8). 在蛋白质子集（CXCL-16、MIP1γ、IGFBP-3、VEGFA1、SDF1A/CXCL12）的丰度方面观察到显著的2倍差异(F类和SI表1). 上清液的RIA证实了蛋白质丰度的变化。这些研究表明CXCL-16和MIP1γ减少>90%，IGFBP-3增加8倍(F类)英寸Akt1公司−/−麦加。来自Akt1公司+/+与。Akt1公司−/−MEC显示MIP1γ和SDF-1受体的相对丰度（CCRI，CXCR4）也相应减少(F类). 添加CXCL-16免疫中和抗体降低ErbB2/阿克特+/+MEC迁移>60%(G公司). 添加生理浓度的CXCL-16促进ErbB2的迁移/Akt1公司−/−MEC增加1.5倍。ErbB2中MIP1γ增加/阿克特1+/+细胞。添加MIP1γ免疫中和抗体减少ErbB2的迁移/Akt1公司+/+MEC增长42%(P（P）< 0.001). 向ErbB2中添加MIP1γ/Akt1公司−/−细胞迁移率提高250%(P（P）< 0.001). 如预期，在ErbB2中添加MIP1γ抗体/Akt1公司+/+细胞减少了博伊登腔的迁移。SDF-1抑制ErbB2/Akt1的迁移+/+MEC但对ErbB2的迁移没有影响/Akt1公司−/−细胞。总的来说，这些研究与CXCL-16和MIP1γ丰度降低在卵巢癌细胞迁移表型降低中的作用是一致的Akt1公司−/−MEC公司。
讨论
这些研究表明Akt1公司ErbB2诱导的肿瘤进展体内.错误B2/Akt1公司−/−MEC对胰岛素的反应表现为细胞增殖减少，集落形成减少。细胞生长特性的这些改变与关键细胞周期调节因子cyclin D1和p21的表达减少有关CIP1级，这与之前的研究结果一致Akt1公司增强p21CIP1级稳定性(58)并通过IKKα/β-catenin信号通路诱导细胞周期蛋白D1表达(24). 细胞周期蛋白D1是ErbB2诱导MEC生长所必需的，细胞周期蛋白D_1丰度的降低可能是ErbB_2增殖反应降低的原因之一/Akt1公司−/−MEC在这里观察到。ErbB2丰度增加和磷酸化Akt1公司都与人类乳腺癌预后不良有关(59)。
这些研究确定了Akt1公司调节乳腺癌转移。这个Akt1公司-缺陷细胞表现出传播较少的表型，迁移减少，通过Akt1的重新引入或来自Akt1公司+/+MEC公司。细胞扩散以双相方式与细胞运动相关，黏附不足、黏附过度和黏附复合体重塑失败也与流动性降低有关(43). 同样，要么不足，要么过度活跃Akt1公司损害乳腺上皮细胞的迁移(10,44). 迁移方向性的减少Akt1公司−/−MEC与粘液菌作为Akt1公司和巴基斯坦-的空突变体粘液菌无法朝向化学引诱剂(36,45). Akt1共有位点200-kDa块茎蛋白TSC2的磷酸化（Ser 939）(15,46)，在ErbB2中增加/Akt1公司+/+乳腺肿瘤。ErbB2/Akt1公司+/+MEC显示皮质F-actin增加，外周焦点接触增加，使人想起游离Tsc2相对丰度增加，RhoA活性增强的细胞(16). 与增强RhoA的作用一致，ErbB2中的辅菲林磷酸化增强/Akt1公司+/+肿瘤（数据未显示）。总之，这些研究与Akt1介导的Tsc2磷酸化促进细胞迁移的作用一致。与其中Tsc2的丰度通过激活Akt1的突变而降低的培养细胞形成对比(47)，Tsc2丰度不会因Akt1的激活而降低体内可能与Akt1的前转移表型有关体内。
Akt1公司-诱导分泌因子修复了细胞迁移缺陷Akt1公司-缺乏细胞。主要负性抑制剂Akt1公司降低内皮细胞的趋化性(48). 促迁移因子（MIP1γ，CXCL-16）分泌减少或迁移抑制因子产生增加可能导致阿克特−/−麦加。ErbB2中CXCL-16丰度降低/阿克特−/−MEC公司。CXCL-16是一种膜锚定趋化因子，克隆为HIV-辅受体Bonzo的CXC趋化因子配体(49)，兼具趋化因子和粘附分子的功能(50). 基质金属蛋白酶，包括ADAM10和ADAM17(51)，通过在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的膜旁区域脱落产生可溶性CXCL-16(52,53). CXCL-16在动脉粥样硬化、类风湿关节炎和脑脊髓炎中的表达改变(54)在结肠癌中被诱导(51,55)和肿瘤相关巨噬细胞(56). Akt1诱导主动脉平滑肌细胞CXCL-16表达(57)，CXCL-16通过Akt激活下游信号(57)。
Akt1诱导的MEC大小，与Akt1公司/Akt2公司-基因敲除小鼠(38)PTEN和Akt的黑腹果蝇(39——42). 在这里，Akt1公司调节基底极性的丧失和对致癌刺激产生的管腔雕刻。包括ErbB2在内的致癌信号通过阻断Matrigel中生长的MCF10A细胞的凋亡诱导管腔填满(60). ErbB2在调节管腔充盈中起主导作用，激活PI3-激酶/Akt1和MAP激酶途径(37). 在MCF10A细胞中，ERK而不是PI3-激酶/Akt控制ErbB2诱导的管腔填充(60). 我们的体内研究表明，Akt1丰度的降低降低了ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生的死亡率。Akt1公司通过在3D培养中肿瘤诱导的乳腺上皮细胞紊乱中发挥关键作用，有助于肿瘤诱导的肿瘤生长。Akt1的生理水平促进和降低阿克特1减少ErbB2介导的乳腺肿瘤转移体内。
材料和方法
转基因小鼠、化学品和试剂。
托马斯·杰斐逊大学伦理委员会批准了转基因小鼠的实验程序。Akt1公司−/−老鼠(23)将其回交到朋友病毒B型毒株中，然后与朋友病毒B类型毒株中的MMTV-ErbB2杂交。从乳腺肿瘤中分离出小鼠乳腺上皮细胞培养物，并按所述进行保存(13)每种基因型至少有三个品系在25代后进行分析。Ki67和BrdU阳性细胞的荧光活化细胞分选(24)以及逆转录病毒表达载体编码野生型Akt1（cAKT）或组成活性Akt1公司（mAKT1）在载体pBABE IRES GFP中的表达在参考文献中进行了描述。25。
粘附性测定和F-肌动蛋白染色。
粘附性分析(25)如参考文献所述，进行阴茎倍体染色。25和26使用贝克曼-库尔特（佛罗里达州迈阿密）的Multisizer Z3仪器评估细胞直径。
Western Blot分析。
使用抗细胞周期蛋白D1（DCS-6）、p21的抗体进行Western blot分析CIP1级（C-19），第27页知识产权1（M-197）、细胞周期蛋白A（C-19）、TSC2、块茎蛋白（C20）、磷酸化TSC2（加州圣克鲁斯生物技术公司）(27,28)来自Cell Signaling（马萨诸塞州丹弗斯）的Akt1（2H10）和phospho/TSC2（939），ErbB2（PC04）癌基因科学（马萨诸塞诸塞州剑桥），以及来自Sigma（密苏里州圣路易斯）的phosphoroRb（Ser-780）。
乳腺上皮细胞的3D培养、细胞运动和迁移分析。
按照参考文献所述进行3D培养。29对于PMD分析，汇合MEC用于在体外划痕伤口愈合试验，并用视频图像分析伤口(25,30)。
免疫中和抗体直接作用于CXCL-16（MAB53）（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）（500 ng/ml）、SDF1（R&D System）（20μg/m）、MIP1γ（R＆D Systems，5μg/ml）和VEGF（马萨诸塞州斯旺普斯科特美国生物公司）（4 ng/ml）。使用的配体如下：500 ng/ml CXCL-16（美国生物）、100 nM SDF1α、0.2 ng/ml VEGF（美国生物学）、0.1μg/ml IGFBP-3浓度（研发系统）和10 ng/ml MIPγ（美国生物学。
实时PCR、微血管分析和ELISA。
实时PCR(31)参考文献中描述了血管性血友病微血管免疫染色的模式和密度。32对于ELISA，细胞接种在80%的汇合处，24小时后将生长培养基更换为基本培养基，用PBS洗涤后含有0.12%的BSA。48小时后，收集条件培养基上清液并在650×克持续5分钟，并通过0.45-μm膜过滤器过滤。使用用于MIP1γ、IGFBP3（研发系统）和CXCL-16、CXCL-12（Raybiotech，Narcross，GA）的Quantitkine ELISA试剂盒一式三份，在条件培养基中测量分泌的CXCL16、MIP1α、IGFBP2和CXCL12。
统计分析。
各组之间的比较采用双面分析t吨测试。差异P（P）<0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用11.5版SPSS软件进行。数据表示为平均值±SEM。在肿瘤偏移时间的生存分析中，我们使用了标准的对数秩检验。在血管密度、细胞直径、伤口愈合和PMD测定的分析中，通过双侧分析各组之间的比较t吨测试。不同之处在于P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
致谢
我们感谢Dawn Scardino女士和Bernice Sykes为我们准备的手稿。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01CA70896、R01CA75503和R01CA107382（发给R.G.P）的支持；Kimmel癌症中心拨款1P30CA56036-08（发给R.G.P.）和5R01DK48910（发给S.C.M.）；美国癌症学会国际研究基金K01 CA85502和R01 CCA093495（给J.O.）；国立卫生研究院拨款R01CA090764（给新罕布什尔州）；和美国癌症协会伊利诺伊州分部拨款06-40（发给西澳州立大学）。该项目的部分资金由拉尔夫博士和玛丽安·C·福尔克医学研究信托基金和宾夕法尼亚州卫生部拨款（给R.G.P.）提供。
缩写
| MEC公司 | 乳腺上皮性肿瘤细胞 |
| PMD公司 | 迁移方向性的持续性 |
| TSC公司 | 结节性硬化。 |
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