美国病理学杂志。2002年6月；160(6): 2181–2190.
Wilms肿瘤中的基因表达——后肾间充质-上皮转化的最早期阶段
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李志明
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
郭美荣
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡哥伦比亚大学，纽约，纽约
阿兰·博尔祖克
来自癌症遗传学研究所，*病理学系，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
查尔斯·鲍威尔
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺科医学部和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
魏敏儿（Michelle Wei）
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
Harshwardhan M.Thaker先生
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
理查德·弗里德曼
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
乌尔夫·克莱因
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
本杰明·泰科
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
来自癌症遗传学研究所，*病理科，†医学部，§肺内科和综合癌症中心，‡纽约哥伦比亚大学
摘要
威尔姆斯瘤（WT）被认为是癌症中阻止细胞分化的原型，但之前的研究依赖于选定的标记物。我们现在使用寡核苷酸微阵列对WT中的基因表达进行了无偏见的调查。统计标准确定了357个基因在WT和胎儿肾脏之间的差异表达。该组包含与Stuart及其同事使用的微阵列上的基因的124个匹配项（Stuart RO、Bush KT、Nigam SK:大鼠肾脏发育和成熟过程中全球基因表达模式的变化。美国国家科学院院刊2001，98:5649–5654），以建立发育中大鼠肾脏中具有阶段特异性表达的基因。两个数据集之间的映射显示，WTs系统性地过度表达对应于后肾发育最早阶段的基因，而欠表达对应于后期阶段的基因。与胎儿肾脏、异种肿瘤和正常组织相比，自动聚类确定了一组较小的27个基因在WT中高表达。这个特征集富含编码转录因子的基因。其中四个，PAX2,眼睛A1,HBF2型，以及霍克斯11在后肾早期发育中，对细胞生存和增殖至关重要，而其他的，包括SIX1系列,MOX1型，以及SALL2公司，预计将在此阶段采取行动。SIX1和SALL2蛋白在正常人胎儿肾脏的浓缩间质中表达，但在其他发育阶段的细胞中缺失（SIX1）或减少（SALL2）。这些数据表明，WT中的胚芽已经发展到间质-上皮转变的承诺阶段，在分化过程中部分停止。WT-signature集合也包含Wnt受体FZD7型，肿瘤抗原PRAME公司，印记基因北北大西洋和转移相关转录因子E1AF公司.
威尔姆斯瘤（WT）是一种常见的儿科恶性肿瘤，它概括了生长中的胎儿肾脏的肾原区的组织学，长期以来一直被视为人类肿瘤分化失败的原型。2,3某些发育调控基因已经在这些肿瘤中进行了检测。其中值得注意的是PAX2对肾脏发育至关重要，4-6以WT表示，7,8和工作任务1对肾脏发育至关重要的肿瘤抑制因子，9并且可能在PAX2.10-14
为了更全面地了解WT中的基因表达，我们使用寡核苷酸微阵列进行了一项无偏见的调查。我们试图首先确定WT和对照胎肾之间差异表达的一大组基因，其次，确定WT中相对于其他对照组织高度表达的一小部分和更特异的基因子集，包括组织学无关的癌症类型。第一次筛查的结果从统计学上证实了先前基于组织学和所选基因分析的观点，即WT中的细胞在胎儿肾脏发育的早期阶段被阻止。WT特征基因较小子集的一致性强调了对肾脏形成至关重要的基因在WT中的高表达，这些基因在间质-上皮转变的最早阶段起作用。
材料和方法
组织
WT是哥伦比亚大学婴儿医院切除的一系列未经选择的原发性非综合征肿瘤。所有WT都不是变性的。这些肿瘤、对照胎儿组织（16-22周妊娠）、原发性Burkitt淋巴瘤（BLs）和肺腺癌的冷冻保存样本来自哥伦比亚大学癌症中心组织库。BL细胞系来自美国型培养物收集中心（马里兰州罗克维尔）。
微阵列和探针
HG-U95A基因芯片（Affymetrix，Santa Clara，CA）查询了约10000个基因（12000个探针集），用于所有分析。cRNA探针是按照Affymetrix的建议合成的。简单地说，使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）分两步分离总RNA，然后使用RNeasy（Qiagen，Valencia，CA）纯化。使用含有T7 RNA聚合酶起始位点的polydT寡核苷酸和上标选择系统试剂盒（Invitrogen），从5μg总RNA中生成双标记cDNA。用苯酚/氯仿提取cDNA。生物素化cRNA由在体外使用生物阵列高产RNA转录标签系统进行转录（Enzo，Farmingdale，NY）。使用RNeasy纯化cRNA。根据Affymetrix方案将cRNA片段化，并将15μg生物素化的cRNA与U95A微阵列杂交（Affymetrix）。扫描后，使用Affymetrix GeneChip 4.0版软件确定每个基因的表达值。
数据分析
两个软件包，GeneSpring（Silicon Genetics，Redwood City，CA）和Genes at Work，利用序列直方图的结构模式定位分析、SPLASH、算法、，15,16用于分析基因芯片数据。使用GeneSpring的过滤函数进行简单的统计和表达值截断。GeneTree函数用于非监督聚类，该函数是GeneSprin中的一种分层聚类工具，根据基因表达模式的关联程度创建基因的树状图。使用genes at Work的模式发现算法对初始差异表达基因集进行监督聚类，15如前所述。17对于使用GeneSpring（集合A和B的派生）进行的初始筛选，只分析了在基因芯片数据中对WT和胎儿肾脏发出一致Affymetrix存在调用的基因（六个样本中至少有五个样本发出存在调用）。用于派生较小的WT特征基因集的Genes at Work算法接受所有数据，包括Affymetrix缺勤呼叫。在WT特征基因中，特定探针组发出缺失呼叫的组织样本总是控制组织，这些探针组的绝对信号非常低。然而，不同组织中缺失调用的总百分比（微阵列上的所有基因）之间没有显著差异。
北方印迹法
使用Trizol试剂（Invitrogen）制备的WT和胎肾总RNA在含甲醛的琼脂糖凝胶上溶解，并转移到Nytran膜（Schleicher和Schuell，Keene，NH）。Northern印迹探针是使用基因特异性引物通过逆转录聚合酶链反应制备的部分cDNA。杂交是在42°C的ULTRAhyb缓冲液（Ambion，Austin，TX）中进行的。通过将膜在0.1%十二烷基硫酸钠/0.1×标准柠檬酸盐溶液中煮沸10分钟来剥离探针，或者让探针在不剥离的情况下腐烂。
免疫组织化学
将WT和胎儿肾脏切片在两次二甲苯变化中脱蜡，每次5分钟。部分通过分级乙醇进行水合。在1 mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中，通过在微波炉中以最大功率煮沸载玻片8分钟，然后以较低功率煮沸15分钟来执行抗原回收。用蛋清和5%脱脂奶在含有0.5%牛血清白蛋白和0.1%NaN的1×Tris缓冲盐水（TBS）中两步孵育10至20分钟以阻断内源性生物素三分别是。在生物素的两个阻断步骤之间，用0.3%过氧化氢和0.1%NaN处理载玻片三阻断内源性过氧化物酶活性。将载玻片在含有0.1%吐温-20（TBS-T）的1×TBS缓冲液中清洗三次，然后在加湿室中与5%的封闭血清孵育30分钟。在三次TBS-T清洗后，将载玻片与针对SIX1（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）、PAX2/8（Santa-Cruz）或SALL2（CeMines，Evergreen，CO）的多克隆抗肽抗体在室温下杂交过夜。在TBS-T中清洗后，将载玻片与生物素化二级抗体（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）在室温下孵育30至40分钟。抗原-抗体复合物由Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories）和显色底物二氨基联苯胺（DAKO，Carpintia，CA）开发。切片用苏木精复染。
结果
WTs与胎儿肾脏差异表达的基因
肾脏发生是一个持续的过程，随着泌尿系统的分支和肾脏的生长，输尿管芽的分支与上覆的后肾间质相互诱导作用反复发生。3,14因此，发育中期胎儿肾脏是完全分化、分化和未分化细胞的复合物，整个胎儿肾脏的基因表达是这些细胞的平均值。WT更均匀，但这些肿瘤也可能包含多种细胞类型，分为芽生细胞、上皮细胞和基质细胞。尽管存在这种异质性，我们推论出初始WT与全胎肾比较有助于消除大量平均表达在这两个来源之间没有差异的基因，并确定差异表达的基因集。通过这种比较发现在WT中过表达的基因可能反映了每个细胞的病理性过表达，或者在WT中数字上过表达的细胞类型中的分期适当表达。这两种类型的净过表达都可能是有趣的，后一类可能是关于WT中原始出现的芽生细胞分化能力受阻的阶段的信息。
因此，我们首先使用来自六个散发（非综合征）WT的cRNA探针进行微阵列分析，并将六个妊娠中期（16至22周）胎儿肾脏作为对照组。我们使用简单的统计和表达值标准来选择一组初始差异表达基因（图1）这产生了一组357个差异表达的基因，由396个寡核苷酸探针表示。使用GeneSpring的GeneTree功能进行聚类得出两个分支，其中168个基因在WT中的表达高于胎儿肾脏（集合A），189个基因则在胎儿肾脏中的表达多于WT（集合B）。为了验证微阵列数据的准确性，我们对WT和胎儿肾脏的总RNA进行了Northern印迹，并将该印迹与6个显示不同表达模式的基因的cDNA探针先后杂交。每个基因的Northern印迹结果与微阵列数据关联良好（图2）.
WTs基因表达分析策略。对于包含在集合a或集合B中的基因，我们首先需要一个值P（P）通过X平方检验，WT和对照胎儿肾脏之间的差异表达<0.001。我们还要求至少三个样本（WT或胎儿肾脏）中相对于实验平均值的标准化表达值大于1.5。
通过与Northern印迹法的比较验证基因芯片数据。左侧：将单个Northern印迹与cDNA探针连续杂交，以获得指示基因。正确的：基因芯片表达数据（归一化为实验平均值）以相同的样本顺序显示。Northern凝胶的EtBr、溴化乙锭染色显示28S和18S核糖体RNA。
接下来，我们在Stuart及其同事之前使用的RG-U34A Affymetrix微阵列上，将我们最初的差异表达基因集映射到所有基因1在大鼠肾脏正常发育的研究中。这些作者质疑了从出生后13天（dpc）到成年这七个连续发展阶段的整个大鼠肾脏中的基因表达。虽然发育中的肾脏在每个阶段都是不同类型细胞的混合体，但在早期阶段，分化程度较低的细胞群占主导地位。斯图尔特及其同事1使用统计标准建立了五个具有特征时间表达模式的基因簇（第1组到第5组）。在他们的分类中，第1组基因在检测的最早阶段即13dpc高度表达，即输尿管芽首次接触后肾间质的阶段，此后表达下降。其他组的基因在进行性后期表达达到峰值：例如，第2组基因在17 dpc和19 dpc之间达到最高表达，而第4组基因仅在出生时高表达（21 dpc），而第5组基因只在完全成熟的成人肾脏中高表达。1我们使用了遗传计算机组（GCG）软件包中实现的FASTA搜索算法，18,19查询U34A基因芯片上所有基因的数据库，其中包含我们初始集合中357个差异表达基因中的每一个。在这357个基因中，124个符合严格的标准(E类得分≤40分；Z轴-在U34A基因芯片上显示的大鼠基因中，得分>800，有来自基因注释检查的正形学证据。其中，81个基因属于第1组至第5组，而其余基因未被Stuart及其同事检测到1由于在发育过程中变化很大，所以没有分配给组。我们A组中的基因（WTs高）绝大多数落入第1组（45个基因中的42个；93%；图3A)，而B组中的基因（WT低）主要属于第2组到第5组（36个基因中的34个；94%；图3A). 这些基因的表达在不同的WT病例和胎儿肾脏对照中通常是一致的，如图3B所示.
WTs基因表达与大鼠肾脏正常发育的相关性。答：当前研究中确定的基因与Stuart及其同事确定的基因对应。1在WT中比在整个胎儿肾脏中更高表达的基因主要定位于Stuart及其同事的最早群体，1然而，WT中表达水平低于胎儿肾脏的基因映射到后一组。B类：图形表示（GeneTree函数，GeneSpring）显示了多个基因和多个样本之间相对过表达或欠表达的一致性。基因沿着x个轴线；WT和胎儿肾脏样本显示在年轴。基因表达自动以红色编码，红色表示高表达，蓝色表示低表达。灰色表示Affymetrix缺勤电话。第1组匹配物在WT中几乎都高表达，而第4组匹配物几乎都在胎儿肾脏中高表达。颜色范围设置为1=正常，6=最大。
接下来，我们利用公共数据库查阅序列信息和相关科学文献，根据已知或预测功能对差异表达基因进行分类(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 我们对集合A和集合B中的每个基因进行了注释，并将它们分为与Stuart及其同事使用的相似的类别。1这表明，参与DNA合成或代谢（包括修复）、细胞周期调节和RNA代谢的基因在A组中的比例大大高于其他基因，而参与其他几种功能的基因在B组中的数量则高于其他基因（图4; 补充数据中的基因身份，http://icg.cpmc.columbia.edu/tycko/data/). DNA合成或代谢以及细胞周期调控方面的结果证实了一种直观的预期，即增殖的肿瘤细胞应过度表达这些类别的基因，而RNA代谢的数据则不太直观。但对于这三个类别，我们的数据与斯图尔特及其同事的数据非常接近，1他发现参与DNA合成或代谢、细胞周期调节和RNA代谢的基因在后肾发育的早期阶段过度表达。总的来说，来自无偏见筛查的这些数据证实了这一概念，该概念以前基于组织学和选定标记物，即WT中的细胞平均在后肾发育早期的相应点停止分化。
WT和胎儿肾脏之间差异表达的基因功能类别。这些类别包括：1、DNA合成或代谢（包括修复）；2细胞周期调控（包括有丝分裂纺锤体）；三、RNA代谢（不包括转录因子）；4转录调控（包括转录因子）；5，细胞信号；第6页蛋白质代谢非蛋白水解；第6页蛋白质代谢；7小分子代谢（酶）；8，小分子运输；9细胞外基质、粘附和血清蛋白；10细胞内贩运；11，能量代谢；12，细胞骨架（不包括有丝分裂纺锤体）；13，抗氧化应激保护；14，未知函数。
野生型特征基因的衍生
为了获得一组较小的基因，以提供关于WT表型的更精确信息，我们试图筛选出那些高度表达的基因，这些基因是细胞增殖的非特异性结果。为此，我们添加了来自异源（组织学无关）高度增殖肿瘤类型BL的微阵列数据。我们从四个原发BL和四个BL细胞系中获得了数据。为了消除初始WT/胎儿肾脏筛查后可能持续存在的任何具有非特异性内务管理功能的基因，我们还添加了异源正常对照组织：四名健康人的外周血白细胞和六名妊娠中期胎儿心脏。根据差异表达基因（集合A和集合B）在这些不同组织中的表达情况，对初始的差异表达基因集进行自动非监督聚类（GeneSpring的GeneTree功能），得出了明确区分每种肿瘤和正常组织的模式（图5A）.
WT特征基因的衍生。答：357个基因的非监督聚类（GeneSpring的GeneTree功能），这些基因最初被确定为WT和胎儿肾脏之间的差异表达。许多高WT/低胎肾基因在BL中也很高。颜色范围正常=1，最大=6。包括所有数据，缺勤电话用纯蓝色表示。B类：野生型标记基因。在使用GeneSpring的GeneTree功能进行聚类后，这里显示了SPLASH识别的27个最核心的基因(第1列和2两个探头都能识别吗CRABP2型). 这些基因的身份如表1所示组织有：腺癌、肺腺癌（六种原发肿瘤）；BL，Burkitt淋巴瘤（四种原发肿瘤和四种细胞系）；FHt，妊娠中期胎儿心脏（6个样本）；Wbc，正常外周血（四份样本）；FKi，妊娠中期胎儿肾脏（6个样本A类和分界线下相同的六个样品B类，线上方还有三个胎儿肾脏）；CDN，分化型囊性肾母细胞瘤（1例）；WT，（六个WTA类和分界线以下相同的六个WTB类，线路上方有六个额外的WT）。工作基因用于分析的组织有带括号的; 腺癌不包括在WT特征基因的推导中。C组中的基因通过SPLASH仅使用以下样本中的数据进行鉴定：A类。额外的WT和胎儿肾脏位于分界线之上，因此验证了特征集。分化型囊性肾母细胞瘤显示出不同的基因表达模式。因为数据是针对所有组织的标准化数据，仅显示WT和胎儿肾脏样本(顶部)强调了它们之间的差异，同时将这些样品与异源组织一起展示突出了它们的紧密亲和力。颜色范围设置为1=正常，6=最大(顶部)2=正常，10=最大(底部).抄送：HOX-、FZD-、EYA-和SIX-家族基因的差异表达。微阵列数据被标准化为实验平均值。每个条形代表单个样本的值。BL，Burkitt淋巴瘤（8例）；FHt，胎儿心脏（6个样本）；Wbc，外周血白细胞（四个样本）；FKi，胎儿肾脏（9个样本）；WT，Wilms肿瘤（12个样本）。这个垂直破折号提示单例分化囊性肾母细胞瘤。
更重要的是，从GeneTree显示中可以明显看出，a组（WT高）中的大量基因实际上在初级BL和BL细胞系中高度表达（图5A）事实上，对包含WT和BL同时较高的基因的簇的组成进行检查表明，它们包含DNA合成/修复和细胞周期类别中的所有基因，以及已知的其他细胞增殖标记基因。几个例子是Ki67抗原、CDK2、细胞周期蛋白B、Ku80 DNA结合蛋白和几个驱动蛋白基因。这证实了人们的期望，即这些基因中的大多数将是细胞增殖的非特异性标记。A组中较小比例的基因在胎儿心脏和/或外周血白细胞中高度表达，但正如预期的那样，这些对照组织倾向于表达B组的基因（图5A）.
根据这些观察结果，我们确信我们选择了一种有用的对照组织组合。因此，我们在Genes at Work软件包中使用了监督学习算法，16根据WT和这些控制组织之间的表达差异对所有基因进行排序。最高的30个探头组Z轴-分数（概率测量）包括29个基因，1个基因(CRABP2型)由两个不同的探针组识别。当在一系列扩大的WT和胎儿肾脏（额外6个WT和3个胎儿肾脏）中检测这组基因时，与对照组织相比，29个基因中除2个基因外，其余基因在额外WT中的表达均显著高于对照组织。得到的27个WT特征基因，我们称之为集合C，如图5B所示并在表1中列出。除了在其他WT中对这些基因进行了阳性验证外，作为进一步的特异性测试，我们在一例相关但不同类型的儿童肾肿瘤，即囊性分化肾母细胞瘤的微阵列数据中检测了它们的表达。该病例显示了一种独特的基因表达模式，其中9个C组基因沉默，其他几个仅在低水平上检测到（图5B）.
表1。
| 图5b | 探头组 | 基因产物 | 符号 | GenBank（基因银行） |
|---|
| 1 | 1057_吨 | 维甲酸结合蛋白II | CRABP2型 | M97815型 |
| 2 | 41783_安 | 维甲酸结合蛋白II | CRABP2型 | M97815型 |
| 三 | 36010_吨 | Mox1同源结构域蛋白 | MOX1型 | U10492型 |
| 4 | 39051_吨 | 神经生成素α和神经生成素β | 北北大西洋 | U31767号机组 |
| 5 | 37605_安 | 前α1 II型胶原蛋白 | COL2A1公司 | L10347号 |
| 6 | 1058_吨 | 画笔-1；Was家族蛋白 | 废物3 | 69790系列 |
| 7 | 40292_安 | DBCCR1；IB3089A；维甲酸诱导物 | DBCCR1数据库 | AF027734型 |
| 8 | 33222_吨 | 卷发-7 | FZD7型 | AB017365号 |
| 9 | 37567_吨 | 锌指蛋白，Hsal2；KIAA0360型 | SALL2公司 | X98834型 |
| 10 | 37809_安 | 同源框基因；HOXA9型 | HOXA9型 | U41813型 |
| 11 | 33248_吨 | EST匹配HOXA11 | HOXA11型 | H94842电话 |
| 12 | 38184_吨 | Pax2配对盒蛋白 | PAX2 | M89470型 |
| 13 | 38952_s_at（地址） | Alpha-2 IV型胶原蛋白 | COL4A2系列 | M33653号 |
| 14 | 35396_安 | 透明质酸合成酶 | HAS2型 | U54804型 |
| 15 | 37073_吨 | EYA1C：眼睛缺失同源物1 | 眼睛A1 | AJ000098型 |
| 16 | 38749_安 | G蛋白偶联受体GPR39 | 39加仑 | AI936826型 |
| 17 | 40358_吨 | DNA-结合蛋白GLI3 | GLI3公司 | M57609型 |
| 18 | 35200_吨 | HMGI-C高迁移率组因子 | HMGIC公司 | X92518型 |
| 19 | 37283_安 | MGCR基因，功能未知的蛋白质 | MGCR1，MN1 | X82209型 |
| 20 | 37630_吨 | 类索蛋白基因；尤尼金Hs.82223 | （未分配） | 电话049176 |
| 21 | 38853_安 | HE6；七跨膜域受体 | HE6 | X81892型 |
| 22 | 38545_安 | 抑制素β，B亚单位 | INHBB公司 | M31682型 |
| 23 | 40004_吨 | SIX1蛋白；同源框蛋白 | SIX1系列 | X91868型 |
| 24 | 41395_安 | 角蛋白硫酸盐Gal-6-磺基转移酶 | CHST1号机组 | AB003791号 |
| 25 | 31946秒 | HBF-2叉头家族转录因子 | HBF2型 | X74143型 |
| 26 | 2084秒 | E1A-F；Ets-家族转录因子 | E1AF公司 | D12765号 |
| 27 | 157_安 | PRAME-1肿瘤抗原 | PRAME公司 | U65011型 |
| 28 | 41764_安 | EST类似于APOCI | APOCI公司 | AA976838型 |
WT标志基因的同源性
对于直接参与DNA复制和修复以及细胞周期控制的一般功能的基因，集合C被耗尽，但对于编码转录因子的基因，它被富集。根据基因组测序，用于转录因子的人类编码序列的比例估计为6%。20在A组中，12%的基因编码已知的转录因子，但C组中41%的基因（27个中的11个）属于这一类（图5B和表1). 如下文详细讨论的，集合C中的11个转录因子基因中的许多基因作为发育标记具有信息性。其中四个基因，第2页,眼睛A1,HBF2型，以及HOXA11型之前已经证明对小鼠和/或人类的后肾发育至关重要。5,6,21-25C组中的第五个基因，SALL2公司，之前未涉及肾脏发育，但与SALL1公司，编码一种Spalt家族转录因子，对小鼠和人类的正常肾脏发育至关重要。26,27C组中的一些其他转录因子基因也可能在肾脏发育中发挥作用，如下所述，其中两个，移动电话1和SIX1系列已知在PAX/EYA途径中起作用。
集合C中不编码转录因子的其他基因也可能参与后肾的形成。Wnt-家族蛋白（包括Wnt-4）的信号传导对于后肾间质的上皮转化至关重要。28这是通过Wnt配体与一个或多个Frizzled家族受体的相互作用实现的FZD7型集合C中的（Frizzled-7）基因是该功能的候选基因。有趣的是，Wnt信号对鸡Spalt家族蛋白cSal1的正确表达至关重要。29C组中的其他基因具有未知功能。其中之一，neuronatin(北北大西洋)受基因组印记影响，因此它仅由父系等位基因表达。30该基因编码一种蛋白脂质，在各种胎儿组织中产生丰富的mRNA，但在神经元和其他细胞类型的分化中沉默。30,31
这个FZD7型基因，比如HOXA11型,SIX1系列，以及眼睛A1，属于一个多成员的家族，因此我们询问微阵列数据是否可以在这些基因家族中提供一些特异性指示。使用Hu95A阵列上的选定基因在一种或多种组织类型中发出一致的存在呼叫，可以比较HOXA11型和HOXA9与HOX7,SIX1与SIX3和六个9,EYA1与EYA3和眼睛A4，以及FZD6与FZD7（图5C）这些比较证实了霍克斯11,HOXA9型,SIX1系列,眼睛A1，以及FZD7型在WT中。
许多C组基因在胎儿肾脏中以可检测的水平转录，而在异源对照中很少检测到（图5B）这证实了胎儿肾脏和WT之间应该有密切关系的直觉。然而，C组中的三个基因，E1AF公司,PRAME公司，以及APOCI公司与其他基因不同的是，它们在WT中高水平表达，但在正常胎儿肾脏中检测不到。这些基因不太可能在肾脏发育中发挥作用，而更可能因肿瘤转化而过度表达.E1AF编码Ets-家族转录因子，该转录因子在几种类型的转移性肿瘤细胞系中过度表达，32,33和PRAME公司编码在黑色素瘤和急性白血病中高度表达的细胞表面抗原。34,35 APOCI公司产生血清载脂蛋白。尽管在BL中不表达，但这些基因经常在其他肿瘤类型中表达，正如我们从一系列肺腺癌的微阵列数据中看到的高信号所证实的那样（图5B），并通过查询Unigene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene网站). 一些腺癌也表达SIX1系列（见讨论）。
SIX1和SALL2蛋白在胎儿肾脏和WT中的分布
与整个胎儿肾脏相比，WT中特定基因的相对过表达可能反映了在每个细胞的基础上表达的一致差异，或者WT中某一特定类型细胞的数量更丰富，这可能是胎儿肾脏中的小细胞群。因为我们怀疑C组中的大多数基因属于后一类，所以我们评估了SIX1和SALL2蛋白在WT和正常胎儿肾脏切片中的组织分布。对于SIX1，胎儿肾脏中的表达对凝集的间质具有高度特异性，可见其紧贴输尿管芽支尖端（图6A）这些细胞接收到来自输尿管芽上皮的诱导信号并对其作出反应，但尚未表现出向上皮结构的形态转化。根据之前的研究，8,36识别PAX2和PAX8的对照抗体也能使这些细胞染色，但与输尿管芽上皮和发育中肾皮质深层分化上皮结构的反应更强烈（图6A）在免疫组织化学检查的两个WT中，SIX1蛋白仅在芽细胞元件中检测到（图7B）与SIX1一样，SALL2蛋白强烈标记着凝聚的间质，但在分化上皮结构中的低强度和较少细胞中也可检测到它（图6C）这些发现，以及集合C中其他几个基因的已发表发育信息表明，对于这些基因中的许多来说，它们在WT中的过度表达反映了在特定发育阶段停滞的肿瘤细胞的数量优势。因此，集合C的组成可用于建立WT细胞分化失败的工作模型（图7）.
人胎肾和WT中SIX1和SALL2蛋白的免疫组织化学检测。答：用抗SIX1和抗PAX2+8多克隆抗血清制备了妊娠20周的人胎儿肾脏的连续切片。SIX1仅在最早的凝集间充质（后肾基）中表达，可见其直接紧贴于泌尿上皮。PAX2+8检测这两种蛋白在凝集的间质中的表达，在肾脏深层分化上皮结构（S形和逗号形小体）时有强烈信号，8,50以及输尿管芽。36分化上皮细胞中的弱细胞质染色是非特异性的（仅在二级抗体的对照中可见）。B类：SIX1以WT的基本成分表示(星号)但不在上皮区(箭头). 三例WT患者中有三例出现这种模式。在这些相同的病例中，上皮成分被抗PAX2+8强烈染色（未显示）。抄送：抗SALL2多克隆抗血清在浓缩的间充质中发出强烈而均匀的信号，但在分化的上皮结构中，具有核SALL2的细胞的频率也较低，染色也有所减少。输尿管芽衍生物对SALL2呈阴性。分化上皮细胞中的弱细胞质染色是非特异性的。CM，凝聚间质；U、 输尿管芽支；上皮分化；Gl，原始肾小球；Tu，分化的肾小管。
从基因表达谱推断WTs的分化阻滞。显示了正常后肾分化程序的示意图。由许多WT组成的瘤芽在灰色方框，并指出了相关的WT特征基因。这个单根钢筋表示WT中的部分分化停滞双杠表示完整的差异块。圆括号表示低但可检测的表达。UB表示与输尿管芽的诱导性相互作用。
讨论
WT长期以来被认为是癌症中阻止细胞分化的原型，但以前对WT表型的评估依赖于组织学和选定的标记物。目前的数据来自于对约10000个基因的无偏见调查，支持这样一个一般说法，即WT中的细胞在后肾发育的早期阶段分化受阻。从之前的动物模型中的正常肾脏发育研究中获取微阵列数据有助于这一解释。1这强调了使用标准化方法进行基于微阵列的研究以及通过互联网提供原始数据的好处。实验设计的第二个教训可能与其他研究相关，即肿瘤活检与全器官对照样品的直接比较，尽管它依赖于异质细胞群的平均值，但仍然可以产生信息丰富的数据。
我们的C组是通过一种无偏见的方法得出的，该方法确定了WTs中比同源组织胎儿肾脏和组织学无关组织胎儿心脏、外周血和BL中表达更高的基因，这组基因在发育必需基因和后肾阶段特异性标记中显著富集，而在具有更广泛功能的基因中则被耗尽。因此，我们使用了操作术语“WT签名”来描述这一集合。但是，很少有基因是完全组织特异性的，集合C基因的表达并不局限于WT。这个SIX1系列该基因在一些人类乳腺癌和横纹肌肉瘤中高度表达，37,38我们发现SIX1 mRNA以及C组的其他几个基因在几个肺腺癌中高表达。这些基因对正常后肾也没有特异性：Six1 mRNA在发育中的体节中表达，39和埃亚1对肾脏、内耳和颅面骨发育都至关重要。21通过Northern印迹，人类FZD7 mRNA在正常胎儿肾脏和成人骨骼肌中最丰富，但在胎儿肺、成人心脏和胎盘中也可检测到。40然而，在这些多个位点中，这些发育调节因子发挥着相同的功能。埃亚1例如，无论是在后肾还是在耳囊中，冷凝间质的存活都是必需的。21
集合C中比例失调的是PAX通路中的基因，其中包括该集合中27个基因中的4个。PAX-、SIX-、MOX-和EYA家族中的基因在组织生长和分化的共同途径中共同作用。EYA家族蛋白直接与同源域蛋白的SIX家族成员结合，并提供转录协同激活功能。41的表达式Six1型和Eya2号机组是由帕克3在小鼠肌源性干细胞中表达，42与最初在果蝇眼睛发育中描述的遗传相互作用平行，与帕克斯(无眼的)作用于Eya上游(眼睛缺失)反过来又在Six的上游(眼正弦).43,44 帕克3协同作用Eya2号机组诱导肌肉分化，39和Eya2号机组也显示出与Six1型在这个系统中。39 埃亚1是表达式所必需的Six2型（而且可能Six1型)浓缩小鼠肾脏的后肾间质，并表达Six1型表明Eya/6ix异二聚体对Six家族基因有正反馈。21也有证据表明Eya/Six对Pax基因有正反馈作用。45Mox1和Mox2蛋白分别与Pax1和Pax3蛋白直接结合。46 Mox2型对小鼠的肌生成至关重要，47但目前尚不清楚Mox1型对肾脏发育至关重要。
小鼠突变体Pax2（帕克斯）不能发育出正常的肾脏6并为人类单倍体不足障碍肾缺损综合征提供了一个夸张的模型。类似地埃亚1在小鼠生殖系中导致肾脏形态发生缺陷。21,23这些小鼠是另一种人类疾病——臂耳肾综合征（BOR）的严重模型，这是因为眼睛A1单倍体不足，与肾发育不全、内耳缺损和颅面畸形有关。22
虽然没有证据表明它在PAX途径中起作用销售1基因，与销售2也是肾脏发育所必需的。27缺乏该基因的小鼠胚胎是人类遗传综合征Townes-Brocks综合征的夸大模型，该综合征与肾发育不全和其他发育异常有关，因为SALL1公司.26 SALL2公司包含在集合C中，但我们的分析没有确定SALL1公司在A组或C组中，尽管该基因已在WT中过度表达。48探测集查询SALL1公司HG-U95A微阵列上显示，数据检查表明，该基因确实在一些但不是所有WT中高度表达（未显示）。这种肿瘤间的变异性解释了C组中缺少该基因。
最理想的情况是，关于WT分化阶段的结论应该基于大量标记。我们的分析确定了一个经过充分研究的标记，PAX2以及几个在正常胎儿肾脏中具有信息表达模式的新基因。埃亚1仅在后肾间充质向上皮-间充质转化的早期表达，如下所示就地发育中小鼠肾脏的杂交。21,49 Pax2（帕克斯）Pax2 mRNA在早期凝聚的间充质中也表达最高，但在小鼠和人类的晚期间充质衍生结构（逗号和S形体）和输尿管芽中也检测到较低水平的Pax2。8,50喜欢埃亚1正如我们所示，SIX1系列，的霍克萨11基因是最早确定的后肾间质的特异性标记。25老鼠Bf2型基因（人类同源基因HBF2型)在后肾的原始基质细胞中表达，24所以这个基因不符合Pax2（帕克斯）,埃亚1,霍克萨11，以及Six1型在这方面，这可能与C组中的基因有关，乙型肝炎病毒2型在不同的WT病例中表现出最大的差异性（图5B）这可能是因为WT可以包含不同比例的间充质干细胞，但两个技术问题，即同一肿瘤不同区域的成分不同，以及缺乏有效的抗HBF2抗体，使我们无法进行测试。
虽然我们关注的是转录因子，但集合C中的许多其他基因可能会影响间质-上皮转换。Wnt途径和frizzled家族受体，如FZD7型，如上所述。后肾发育中的另一个关键信号通路由骨形态发生蛋白（Bmp）家族中的配体介导，需要细胞外基质中的硫酸化糖胺聚糖。51,52糖类硫转移酶基因的存在，CHST1号机组，在集合C中并不令人惊讶。
WT中差分抑制的工作模型，如图7所示，与可用数据一致。在这个模型中，WT来自能够在基质和上皮方向分化的原始间充质细胞。在从固定间质向早期上皮的过渡过程中存在部分分化阻滞。这与大多数WT中丰富的爆基成分的积累一致，该成分表达PAX2,SIX1系列,眼睛A1,SALL2公司，以及HOXA11型原始上皮结构可以由成功通过此阻滞的细胞在WT中形成，但这些通常是少数细胞。钙粘蛋白基因是上皮分化连续阶段的有用标记，钙粘蛋白-11在幼稚和稳定的后肾间质中广泛表达，钙粘素-6和E-钙粘蛋白在相继成熟的上皮结构中表达。53E-cadherin出现在我们的B组（补充数据）中，与我们的模型一致，微阵列数据将WT中这些基因的表达按以下顺序排列：cadherin-11>cadherin-6>E-cadherin（数据未显示）。
我们已经确定的特征基因的功能重要性可能是什么？没有证据表明集合C中的基因作为原癌基因在启动Wilms肿瘤发生中发挥主要作用，但它们可能具有重要的下游功能。特别是，由于其中几个基因的突变导致非肿瘤性后肾间质增殖失败，导致肾发育不全或再生障碍，并且由于额外的集合C基因在这些相同的途径中协同作用，这些基因也可能需要维持细胞存活和WT芽基增殖。
致谢
我们感谢J.Licht和M.Goldberg的深入讨论，感谢A.Saxena对免疫组织化学的建议，感谢G.Cattoretti对免疫组化协议的建议(http://icg.cpmc.columbia.edu/cattoretti/protocol/)和V.Miljkovic的微阵列杂交和数据管理建议。
脚注
向纽约州纽约市圣尼古拉斯大道1150号Berrie Research Pavillion的B.Tycko提出转载请求，邮编：10032。电子邮件：.ude.aibmuloc@21tb
由美国国立卫生研究院（给B.T.）和人类前沿科学项目（给英国）资助。
工具书类
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