真核细胞必须正确控制线粒体的数量、形态、位置和分布，以实现其特殊功能(1). 线粒体分裂是这种控制的主要过程，因为线粒体不能产生从头开始除了保持线粒体的数量和形态外，最近的研究报告称线粒体分裂在凋亡细胞死亡中起着重要作用(2). 线粒体分裂器最初被描述为线粒体分裂（MD）环，在年观察到分裂线粒体赤道区的一对电子致密沉积物氰化汞透射电子显微镜(三)由质体或叶绿体分裂的质体分裂环的发现而引发(4). 在其他藻类、黏菌和高等植物中也发现了类似的结构(5,6). 人类最近研究中的电子显微照片(7)和酵母(8)在线粒体收缩位点显示出电子致密结构，尽管没有提到它们代表MD环。目前完全不知道哪些分子负责MD环的形成。
线粒体和叶绿体分裂涉及两种自组装GTPase。第一种是FtsZ，是一种细菌细胞视觉蛋白，通过内共生作用被转移到线粒体和质体分裂(9). 叶绿体或质体FtsZ可以在大多数光合真核生物中找到，而线粒体FtsZ只保留在相对原始的真核生物中(10–13). FtsZ在质体或叶绿体的分裂部位形成环状或带状(9)和线粒体(10,11)从内膜内部。第二个GTPase是动力相关蛋白（DRP）。DRP参与线粒体分裂首次在芽殖酵母中报道为Dnm1(14)，后来被发现广泛存在于各种各样的真核生物中。DRPs在线粒体分裂中的必要性和作用可能是普遍的，因为所有DRPs的作用方式都类似，DRPs积聚在线粒体尖端或收缩部位的细胞溶质侧。然而，一些证据表明，与FtsZ不同，DRP仅在线粒体分裂的晚期才需要(15–17)表明自由贸易区和DRP具有不同的作用(16). DRPs参与叶绿体分裂的研究进展(18,19)进一步强化了叶绿体/质体和线粒体分裂采用基本相似的机制的观点，包括FtsZ、PD/MD环和动力蛋白(16,19). 然而，毫无疑问，涉及的分子更多，细胞器分裂机制的动力学和调控需要阐明。在发芽酵母中酿酒酵母，外膜蛋白Fis1(20,21)和两个WD40重复序列蛋白Mdv1(21–23)和Caf4(24)与依赖Dnm1的线粒体裂变途径有关。Fis1通过Mdv1或Caf4介导Dnm1定位到线粒体表面(21,23,24). 他们的互动模式仍有待讨论，还建议Mdv1和Caf4发挥额外或独特的作用(24–27). 在其他生物体中未发现Mdv1或Caf4的同源基因，而在人类中发现了强大的Fis1同源基因(7,28)和植物(29).
虽然隔离是了解分子机制如何组装的直接方法，但线粒体分裂机制的隔离从未实现，大概是因为它被认为是一种动态和时间结构，与其他细胞成分相比，所涉及的数量被认为太低了。关于这个问题，C.梅罗莱提供了一个理想的实验系统，因为这种藻类在直径1-2μm的小细胞中有一个线粒体和一个叶绿体。此外，细胞和细胞器的分裂可以同步进行。事实上，叶绿体分裂机制的分离和分析只在这种藻类中进行过探索(30,31).
在这项研究中，我们开发了一种纯化线粒体分裂机制至少部分的程序C.梅罗莱揭示了其组成和亚细胞定位，并分析了其生化特性。
结果
器官分裂蛋白质的纯化。
先前的研究结果表明，抑制核DNA合成会使叶绿体和线粒体的有序分裂分离C.梅罗莱表明细胞器的分裂受细胞周期检查点的控制(32,33). 根据S/G期间线粒体收缩的观察2虽然在进入M期之前，最后的分离被抑制，但在M期中，一种与动力学相关的蛋白Dnm1特异性地积累，否则会分散在细胞质中(34). 作为线粒体分裂机制的一部分，为了纯化M期积累的Dnm1，我们开发了一种使用细胞周期停滞细胞的生物化学分级程序。用洗涤剂溶解细胞，并通过几步差速离心和碘克沙醇密度离心进行分离，然后进行氯化钠提取。用庚硫代葡萄糖苷进一步提取残余颗粒。
Dnm1在35%和20%碘xanol颗粒（35P和20P）的不溶性部分中得到富集，这是仅在使用M滞留细胞时才存在的两种主要蛋白质之一(A类，开放箭头），随后通过免疫印迹确认（数据未显示）。另一种主要蛋白质，≈100 kDa(A类，箭头），进行飞行时间质谱分析。肽质量指纹图确定该蛋白质由185C加元在中C.梅罗莱基因组。在S/G中2-富集了两种蛋白质(A类，箭头和箭头），并被鉴定为CMR185C和Dnm2（参与叶绿体分裂的另一种动力相关蛋白）(19)分别通过质谱和免疫印迹（数据未显示）。推导出的CMR185C蛋白783-aa序列的主要特征是在中心区域有一个假定的线圈结构域，在羧基末端有7个WD40重复单元(B类). 虽然CMR185C的N末端区域与Mdv1或Caf4的N末端区几乎没有同源性，但在酵母的Mdvl和Caf4中也可以看到类似的结构域排列[支持信息（SI）图6]. CMR185C与Mdv1、CMR185C与Caf4、Mdv1-Caf4之间的总序列同源性分别为18.0%、19.2%和32.7%。
细胞器分裂蛋白的分离和鉴定。(A类)所有组分用10%SDS/PAGE分离，并用高灵敏度CBB染色。每组三条车道从左到右分别对应于未经抑制（DMSO-处理）、S/G2-抑制（喜树碱处理）和M-抑制（奥扎林处理）细胞的分数。除（S）组分外，每条通道中含有起始细胞裂解液中约8 mg蛋白质的总指示组分，其中只有1/20的组分被装载。细胞裂解液在40%碘克沙醇层理上离心，得到可溶性部分（S）的顶层、底部颗粒（40P）和界面的中间层，然后在35%碘克沙诺层理上进行离心，得到底部颗粒（35P），在20%碘克沙酚层理上分离，得到底部球粒（20P）和上层（20U）。随后用1 M NaCl（NaCl）和2%庚基硫代葡萄糖苷（HTG）进一步提取颗粒35P和20P，得到浓缩细胞器分裂蛋白的不溶性颗粒（P）。填充箭头表示Dnm2，开放箭头表示Dnm 1。箭头表示经过质谱分析的波段。分子量标记（m）显示在左侧。(B类)CMR185C Mda1的预测域体系结构。从中箭头所示的带中A类，一种蛋白质经质谱鉴定为由185C加元在中C.梅罗莱基因组；这种蛋白质后来被命名为Mda1。(C类)CMR185C亲和纯化抗体的特性。C.梅罗莱使用针对CMR185C重组N末端区域（1–297）的抗体分离总蛋白并进行免疫印迹。(D类)蛋白质在整个细胞周期和停滞期的表达。在同步化开始后的指定时间（小时）采集等量培养细胞，并对Dnm1、α-微管蛋白（αTub）和Mda1进行免疫印迹。细胞也被喜树碱（Cpt）阻遏在S/G2M相或与稻瘟灵（Orz）混合。
CMR185C Mda1的亚细胞定位。
为了表征CMR185C的细胞功能，提出了多克隆抗体。亲和纯化的抗体和抗血清特异性识别来自C.梅罗莱总蛋白质(C类)与纯化组分中带的大小大致一致。同步培养的总蛋白免疫印迹显示，Dnm1在整个细胞分裂过程中没有变化，而α-微管蛋白从S期到M期增加(D类)如报告所示(34). CMR185C特异性地出现在分裂细胞和S/G阻滞的细胞中2和M相(D类). 为了确定CMR185C的亚细胞定位，在细胞分裂的几个阶段进行免疫荧光(，详见SI图7). 在早期，CMR185C在一定程度上集中在线粒体周围(A类)然后在线粒体上形成中间带(B类)当从另一个角度观察处于类似阶段的细胞时，它看起来就像沿着线粒体表面的一个拱(H（H）). 在线粒体和叶绿体开始伸长的下一阶段，CMR185C在线粒体的赤道区域形成了一个明显的封闭环或带( C类和D类). CMR185C的中环也收缩，以便随着线粒体收缩的进展而聚焦(E类). 线粒体分裂完成后，CMR185C病灶附着在分裂线粒体的一侧，并逐渐消失( F类和G公司). 基于这些观察结果，我们将该蛋白命名为Mda1（线粒体分裂装置1）。为了揭示Mda1和Dnm1之间的空间关系，同时对这两种蛋白进行免疫染色。如报告所示(16)，Dnm1在线粒体分裂之前和早期，即Mda1开始形成内侧环或带时，被发现为遍布细胞质的多个斑块( 我和J型). 随着线粒体收缩的进行，一些Dnm1斑块“附着”在Mda1带上(K（K）). 在划分的后期，Mda1和Dnm1几乎在同一个焦点上积累(我). 接下来，我们比较了Mda1与FtsZ的环形成顺序和位置，FtsZ存在于矩阵中，可能参与划分平面的放置(16). 在大多数情况下，在最早的阶段，我们可以观察FtsZ环，而无需持续观察Mda1环(M（M）)然而，很少出现相反的情况。两个环总是在线粒体的同一平面上形成( N个和O（运行）)，而它们的定位并没有完全重叠，它们各自的强度也没有相关性。在线粒体分裂的最后阶段，当Mda1形成单个焦点时，FtsZ环分裂成两个(P（P）). 免疫电镜观察Mda1的超微结构定位。五个连续切片中的每一个都包含线粒体外表面Mda1定位的部分，这表明Mda1在尚未收缩的线粒体周围的带状定位( A类和E类). 在线粒体分裂的中期和末期，在分裂位点MD环的电子密度图像上或周围检测到Mda1定位( B–D).
Mda1和线粒体、Dnm1或FtsZ1的免疫荧光。(A–H)线粒体（红色）和Mda1（绿色）固定和免疫染色的细胞图像对齐(A–G)根据细胞周期进展的预测顺序。(H（H）)从另一个角度观察的细胞，被认为与B类.固定细胞和免疫染色细胞的图像垂直对齐Mda1（绿色）和Dnm1（红色）(I–L型)或FtsZ1（红色）(M–P公司)根据细胞周期进展的预测顺序(N个)和(O（运行）)他们都来自几乎相同的舞台，从不同的角度展现了自己的观点。PC，相位对比图像；线粒体图像，用抗CmEF-Tu（mt）抗体染色。（比例尺：1μm）独立荧光图像和其他细胞如所示SI图7.
Mda1的免疫电子显微镜。用抗Mda1兔抗体和10 nm金颗粒结合二级抗体标记超薄切片，并在透射电子显微镜下观察。(A类)显示线粒体分裂早期整个细胞的五个连续切片之一。(B类)横切面分裂线粒体和切割的MD环挤压收缩部位的电子致密图像。(C类)显示线粒体分裂最后阶段细胞的切片。(D类)放大三倍C类，显示收缩MD环周围的Mda1信号(E类)上的五个面板左侧是显示线粒体周围Mda1带定位的五个连续切片的图像，其中一个位于A类. The赖特端面板显示了五个叠加的左侧图像中的信号。N、 细胞核；m、 线粒体；mb，微体；cp，叶绿体。[比例尺：200 nm(A类和B类)和500纳米(C类).]
纯化蛋白质的分解。
为了表征纯化蛋白的生物化学性质并评估其完整性，进一步提取了NaCl处理后的35P和20P的组合部分。通过增加200万公吨GTP而非GDP，Dnm1的很大一部分从M-滞留分数中释放出来(GDP和GTP）。然后将剩余的Mda1和少量的Dnm1溶解在含有1 M Tris·HCl和5%庚硫代葡萄糖苷的缓冲液中(，TrH）。在S/G中2-滞留部分，Mda1也被溶解，而Dnm2的大部分仍然不溶(、TrH和P）。
线粒体分裂机器的拆卸。两条车道的集合是S/G的分数2-逮捕和逮捕。颗粒35P和20P英寸将其与2 mM GDP（GDP）、2 mM GTP（GTP）、2%庚硫苷（HTG）和1 M Tris·HCl加5%庚硫甙（TrH）组合并随后提取。提取物和颗粒（P）的蛋白质通过10%SDS/PAGE进行解析。分子量标记（m）显示在右侧。填充箭头表示Dnm2；打开的箭头表示Dnm1。箭头表示Mda1。
Mda1的磷酸化。
S/G中的Mda12-在SDS/PAGE中，滞留组分和M-滞留组分的分子大小似乎略有不同。由于磷酸化是与细胞周期相关的最有力的修饰之一，我们将磷酸酶处理与低双丙烯酰胺凝胶电泳相结合，有效分离磷酸化和非磷酸化肽。正如预期的那样，M期阻滞中Mda1的带被磷酸酶处理降低到S/G水平2-逮捕(A类). 在测试条件下，磷酸酶处理不会影响Mda1和Dnm1的分解。Mda1和Dnm1在S/G中的亚细胞定位2-或M-逮捕也被检查过。在M阻滞细胞中，Dnm1和Mda1主要定位于同一病灶，而在S/G2-滞留细胞Mda1形成条带，Dnm1分散在细胞质中(B类).
Mda1的磷酸化。(A类)M期阻滞或S/G的纯化蛋白2-使用（+）或不使用（−）λ-蛋白磷酸酶（λ-PPase）处理停搏，进行低双丙烯酰胺凝胶电泳，并用抗Dnm1或抗Mda1进行免疫印迹。(B类)M期阻滞或S/G期细胞2-分别用抗Dnm1和抗Mda1抗体进行免疫染色，并用Alexa Fluor 555或Alexa Fluro 488结合二级抗体进行检测。（比例尺：2μm）(C类)各种状态下含Mda1大分子的窄范围差密度离心。在磷酸酶和/或GTP存在下孵育M停搏细胞的部分纯化部分，然后通过差密度离心分离，并通过SDS/PAGE分析。每条车道都含有通过一定浓度碘克山诺（%）的颗粒，如上所示。Cont，在对照缓冲液中孵育+PPs，在λ-PPase存在下培养+GTP，在GTP存在下孵化；Mda1型-第页，天然磷酸化Mda1带；Mda1，Mda1脱磷带在体外.
为了研究Mda1的磷酸化如何影响分裂装置的特性，将M阻滞细胞的纯化部分在存在或不存在磷酸酶和/或GTP的情况下培养，并通过窄范围差密度离心分离(C类). 在任何条件下，上部组分都含有背景较高的蛋白质，并且被认为无法有效地分解或聚集(C类，向上）。在没有磷酸酶和GTP的情况下，Mda1和Dnm1主要分布在F38中，而通过磷酸酶处理，它们急剧转移到F40(C类，续和+PP）。通过GTP添加，Dnm1大量释放，Mda1出现在F34中，而在磷酸酶存在下部分转移到较重的组分(C类、+GTP和+PP+GTP）。
材料和方法
细胞制备。
按照说明进行细胞培养、药物治疗和固定(21)稍作修改。有关详细信息，请参阅SI文本.
分馏程序和电泳。
细胞在2300×克在室温下清洗10分钟，用基础缓冲液（50 mM Hepes-KOH/200 mM NaCl/2 mM MgSO4/1 mM EGTA-Na/1 mM DTT/10%wt/vol甘油，pH 7.1），悬浮在浓度约为10 mg蛋白质/ml的裂解缓冲液（含有5%wt/vol-Triton X-100/2%wt/vol-胆酸钠/蛋白酶抑制剂混合物的基本缓冲液）中。用液氮冷冻细胞悬浮液，并在−80°C下保存。溶解液在冰上解冻。然后，添加DNase I，使最终浓度达到200μg/ml，并将混合物在冰上培养30分钟。从这一点开始，在冰上或4°C下，在1.5 ml微型离心管中，使用固定角度转子进行离心操作。以1000×克去除细胞碎片。保存上清液，将颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中，并再次以1000×克，并将上清液合并。然后将上清液分层于含有40%碘克沙醇、2%Triton X-100和0.5%胆酸钠的基础缓冲液上，在30000×克5分钟后，改变角转子的侧面，然后再次离心，在界面形成上层上清液（S）、底层颗粒（40P）和中间层。中间层悬浮于基底缓冲液中，分层于含有35%碘克沙醇的基底缓冲液上，以30000×克形成底部颗粒（35P）和上层。上层悬浮，分层于含有20%碘xanol的基础缓冲液上，以30000×克以形成底部颗粒（20P）和上层（20U）。将颗粒35P和20P悬浮在含有1 M NaCl、2%Triton X-100和0.5%胆酸钠的基础缓冲液中30 min，然后在30000×克用基础缓冲液清洗粒剂10分钟，将其悬浮在基础缓冲液中2%的庚硫代葡萄糖苷中，孵育30分钟，然后在30000×克为了进行分解分析，将35P和20P组分组合并依次用1 M NaCl、2 mM GDP在37°C下萃取30 min、2 mM-GTP在37°C下萃取30分钟、2%庚硫代葡萄糖苷，最后用1 M Tris·HCl（pH 7.4）加5%庚硫基葡萄糖苷萃取，并在30000×克每个提取步骤持续10分钟。对于SDS/PAGE，用三氯乙酸沉淀提取物，然后用丙酮冲洗，并在含有50 mM DTT、8 M尿素和1 mM EDTA的SDS样品缓冲液中溶解颗粒。电泳后，用高灵敏度考马斯亮蓝（CBB）、GelCode蓝色染色试剂或帝国蛋白染色（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）对凝胶进行染色。蛋白质条带通过免疫印迹或飞行时间质谱鉴定（日本茨城岛津生物技术公司）。对于低双丙烯酰胺凝胶电泳，使用99:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比率。对于磷酸酶处理，样品在含有4000单位/mlλ-蛋白磷酸酶（λ-PPase）（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）和2 mM MnCl的基础缓冲液中培养2在30°C下保持30分钟。
对于窄范围差密度离心，我们在含有1%TritonX-100的基础缓冲液中使用从42%到32%的碘xanol浓度每2%一步。如上所述，制备了M-停搏细胞的部分纯化部分，而铺垫用的是42%而不是40%的碘克沙醇。用基础缓冲液冲洗垫层上的合成层两次，并将其悬浮在含有2 mM MnCl的基础缓冲液中21 mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物，并在有或无4000单位/mlλ-蛋白磷酸酶λ-PPase和/或5 mM GTP的情况下在30°C下培养30分钟。然后将样品装载在含有一定浓度碘克山诺的层上，并在30000×克5分钟后，改变角度转子的侧面，然后再次离心。收集所得颗粒（F42至F32），而悬浮界面层，并使用较低浓度的碘xanol进行下一步。最后的上半部分用16%碘克沙醇（Up）造粒。用1 M氯化钠和2%庚硫代葡萄糖苷（如上所述）清洗所有颗粒，并通过SDS/PAGE进行分析。
抗体、免疫荧光、免疫印迹和电子显微镜。
为了制备抗CMR185C兔抗血清，我们使用了一种细菌重组蛋白，其氨基酸残基为CMR185C蛋白预测的783-aa序列的1到297个氨基酸残基，N端带有6个组氨酸标签，用于免疫和亲和纯化。为了制备抗CMR185C小鼠抗血清，使用N端带有6个组氨酸标签的总蛋白细菌重组物进行免疫。通过常规方法进行免疫荧光和免疫印迹。在电子显微镜下，使用快速冷冻的丙酮固定细胞。有关详细信息，请参阅SI文本.
