基因表达是一个高度调控的过程，经常需要转录因子和染色质重塑酶之间的协调功能。这些酶分为两类：水解ATP并改变核小体结构的依赖于ATP的重塑剂和翻译后共价修饰特定组蛋白残基的组蛋白修饰剂。骨骼肌分化的激活受组织特异性转录因子的基本螺旋-环-螺旋家族成员（包括MyoD、Myf5、Mrf4和肌生成素）以及与基本螺旋-循环-螺旋蛋白协同作用的转录调节因子Mef2家族成员的调节(8,34,43). 大量染色质重塑酶已被证明对肌源性基因表达有积极和消极的影响。这些包括组蛋白乙酰转移酶；类型I、II；和III组蛋白脱乙酰酶；组蛋白赖氨酸甲基转移酶；和ATP依赖性重塑酶SWI/SNF家族成员(17,47,50). 肌发生过程中不同类别的染色质重塑酶之间的关系在很大程度上尚未探索。
蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）是一类额外的酶，可在骨骼肌分化过程中与组蛋白修饰和基因调节相关。该家族有9个成员（Prmt1至Prmt9），其中6个成员已被证明产生不对称（I型）或对称（II型）二甲基精氨酸，并通过底物蛋白的精氨酸甲基化影响一系列细胞过程(6,50). 特别值得注意的是，Prmt4酶，也称为Carm1，与骨骼肌分化和通过组蛋白H3和H4的甲基化控制雌激素介导的基因激活有关(5,9,12,53). Prmt4作为多蛋白复合物的一部分在雌激素诱导的启动子中发挥作用，该复合物还包含SWI/SNF染色质重塑复合物的Brg1-ATP酶(53). 另一个家族成员Prmt5也被分离出来作为含有Brg1的酶复合物的一部分，尽管在这种情况下，该复合物与生长控制和肿瘤抑制相关基因的转录抑制有关(41,42). 其他研究表明，Prmt5是细胞周期蛋白E的阻遏物(21,44). Prmt5还与延伸因子Spt5相关并甲基化，该因子降低了该蛋白对RNA聚合酶II的亲和力，阻碍了转录延伸(30). 因此，Prmt5通过组蛋白和转录机制成分的对称精氨酸甲基化对基因表达产生负面影响。受Prmt5和Brg1之间的关联以及Prmt4参与肌原基因的转录调控这一事实的提示，我们试图确定Prmt6是否有助于骨骼肌分化。
先前的工作描述了组成性表达Prmt5反义载体的NIH 3T3基细胞系，从而导致Prmt5mRNA和蛋白质水平显著降低(41). 成纤维细胞异位表达MyoD诱导肌源性分化(13)；近20年来，该系统被广泛用于研究骨骼肌基因调控的机制(50). 使用该系统，我们确定含有降低水平Prmt5的细胞在引入MyoD后未能激活肌源性基因表达。对导致肌生成素位点激活的事件进行详细检查，发现组蛋白3精氨酸8（H3R8）的Prmt5依赖二甲基化SWI/SNF-ATPase Brg1的相互作用、位点的染色质重塑以及导致基因激活的所有后续事件都需要。我们还证明了Prmt5与从成人骨骼肌组织中分离的活化卫星细胞中的肌生成素启动子相互作用，这进一步支持了以下结论：Prmt4在肌生成基因激活中发挥作用，并且是诱导骨骼肌分化所必需的。因此，我们确定组蛋白甲基转移酶是组织分化过程中ATP依赖的染色质重塑酶功能所必需的。
材料和方法
细胞培养。
细胞保存在补充有10%小牛血清和2 mM的Dulbecco改良Eagle's培养基中我-谷氨酰胺。Prmt5反义株在2.5μg/ml嘌呤霉素存在下保持不变，因为反义载体编码嘌呤菌素抗性基因(41). 如前所述分化细胞(15,18)除了pBABE-MyoD逆转录病毒构建物被修改为包含一个抗囊虫素基因，而不是一个抗嘌呤霉素基因。简单地说，将循环细胞分裂，使它们在24小时后融合75%。当时，用编码MyoD逆转录病毒的逆转录病毒感染30小时。随后，使用分化培养基（Dulbecco改良的Eagle’s培养基，含有2%马血清，2 mM我-向细胞中添加谷氨酰胺、5μg/ml速溶素、2μg/ml嘌呤霉素和10μg/ml胰岛素），并在指定时间采集样品。来自NIH 3T3细胞和反义细胞系的对照样品被模拟感染，并接受分化方案，被指定为“模拟分化”
前面描述了在没有四环素的情况下，B22细胞表达SWI/SNF-ATP酶亚单位BRG1的标记的显性阴性版本(14). 循环细胞在四环素存在或不存在下生长3天，24小时后分裂至50%至60%汇合，然后进行上述分化方案。
mRNA分析。
使用Trizol（Invitrogen）从模拟或MyoD分化的样本中分离RNA，并如前所述进行逆转录(16). 使用含有0.1μg特异性引物和SYBR绿色的QIAGEN HotStarTaq Master Mix试剂盒（QIAGENT）扩增cDNA。使用前面描述的程序和引物进行逆转录PCR（RT-PCR）和实时PCR(10,39,51). 肌营养不良蛋白引物集为5′-AAG TTT GGA AAG CAA CAC ATA-3′和5′-GTTT CAG GGC ATG AAC TCT TG-3′。Prmt5引物为5′-GAT GGC GGC GAT GGC A-3′和5′-CTG TGT GTG TAG TCG G-3′。所有数据集均为三个或三个以上独立实验的平均值±标准差。
荧光激活细胞分选（FACS）。
如上所述分化或模拟分化细胞，并按前述方法固定(29). 用流式细胞术测定碘化丙锭掺入量，以确定细胞周期各阶段的细胞百分比。
蛋白质提取物、蛋白质分析和抗体。
如前所述，生成了全细胞提取物(18,20). 对于Western分析，使用100μg每种提取物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移到硝化纤维素。先前描述了协同免疫沉淀程序(16,39). 用于染色质免疫沉淀（ChIP）的抗体包括针对Prmt5和二甲基化H3R8的多克隆兔抗血清(41,42)，轴承1(14)、标志表位和MyoD(16). 西方分析还使用了针对Prmt5/JBP1/Skb1Hs（目录号611538；BD Biosciences）和MyoD（目录号554130和554099；BD生物科学）的商业抗体。
炸薯条。
如前所述，通过修改Upstate协议执行ChIP(46). 从组织中分离的培养细胞或细胞核（见下文）在1%甲醛中交联，并在含有1%SDS、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 8.1的缓冲液中溶解。样品在冰上孵育，DNA通过超声波剪切得到平均长度为500 bp。在含有蛋白酶抑制剂（1 mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml胃蛋白酶抑制素A）的免疫沉淀缓冲液（0.01%SDS、1.1%triton-X100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris、pH 8.1、167 mM NaCl）中，将总计100μg的声波DNA稀释10倍，并用50%蛋白A珠浆（Amersham）进行预处理在4℃下培养至少1 h。将清除的裂解物与上述抗体在4℃培养4 h或过夜。添加蛋白A珠以从细胞裂解物中沉淀免疫复合物，并在4°C下培养1 h。通过离心法收集珠子，然后按照前面所述进行清洗(46)，并使用1%SDS从珠中洗脱免疫复合物。反向交叉链，用Qiaquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化DNA。免疫沉淀DNA的PCR扩增分析(16)或使用Quantitect SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR（QPCR）。引物如前所述(16,39). 如前所述，进行了染色质再沉积（re-ChIP）实验(36,39). QPCR数据是三个独立实验的平均值±标准差。
区域环境评估。
限制性内切酶可及性分析（REAA）和改良型连接介导PCR检测方法如前所述(16,39). 数据是三个独立实验的平均±标准偏差。
从小鼠骨骼肌中分离卫星细胞和肌纤维。
从4至6周龄C57/BL6小鼠的上后肢解剖骨骼肌，并将其切碎至约1mm3然后在添加1 mM CaCl的磷酸盐缓冲盐水中使用87.5 U/ml II型胶原酶（Invitrogen）消化组织2并在37°C下搅拌培养1小时(3,11). 通过细胞过滤器过滤从成熟肌纤维中分离卫星细胞（70um；Becton Dickinson目录号352350）(40). 通过流式材料富集卫星细胞，而未通过过滤器的材料富集肌纤维。如上所述，取等分试样分离RNA。在整个过程中，卫星和肌纤维制剂都放在冰上。分离的级分通过离心分离成丸，并重悬于7体积的裂解缓冲液（10mM HEPES-KOH（pH 7.3）、10mM KCl、5mM MgCl2，0.5 mM二硫苏糖醇，0.2 mM苯甲基磺酰氟，3μg/ml细胞松弛素B，10μg/ml亮肽）。样品均化并用杵A浸泡以释放细胞核，然后样品在冰上培养30分钟。用Hoechst 33258染料在光学显微镜下检查细胞核的释放和完整性，然后离心样品以去除细胞碎片。将细胞核重新悬浮在2.5体积的10 STM缓冲液（5 mM MgCl）中2，10 mM三乙醇胺，pH 7.5，5 mM氯化镁2，10%蔗糖，10μg/ml亮氨酸肽），随后2体积的2 M蔗糖-10 mM Tris-HCl-5 mM MgCl2在超离心管（Beckman目录号344057）中，750μl 2 M蔗糖-10 mM Tris HCl-5 mM MgCl2对混合物进行校准，并用上述核混合物覆盖。样品在116140×克将上清液抽吸并丢弃，将颗粒重新悬浮在500μl含有0.1%NP-40的裂解缓冲液中。在室温下与2%甲醛交联后，在13500×克，将颗粒在液氮中冷冻，将样品储存在−80°C下或立即解冻，再悬浮在上述裂解缓冲液中，并进行超声处理。
结果
在Prmt5水平降低的细胞中，骨骼肌基因的转录显著受损。
肌源性转录因子和染色质重塑酶之间的合作是正确调节肌肉特异性基因转录所必需的。为了探讨Prmt5精氨酸甲基转移酶在骨骼肌分化中的功能，我们利用了两个独立衍生的表达Prmt5反义载体的NIH3T3细胞系。这些细胞系先前被证明显著降低了这种蛋白及其相应mRNA的水平(41).
体外骨骼肌分化是通过感染编码MyoD的逆转录病毒的对照系和反义系（c15和c12细胞）而启动的(15,38)感染30 h后，向细胞中添加低血清分化培养基，让细胞分化36 h。模拟感染的对照样品也放置在分化培养基中，称为模拟分化。Western分析表明，这两个克隆中存在的反义载体降低了模拟和MyoD分化的c15和c12细胞中Prmt5的数量（图。).
骨骼肌分化需要Prmt5。NIH 3T3细胞和表达Prmt5反义载体（c15和c12细胞）的两个独立衍生的NIH 3T3细胞系通过异位表达MyoD进行模拟分化或分化。（A） Western blot显示，与亲本NIH 3T3细胞中的Prmt5蛋白水平相比，分化和模拟分化反义细胞中的蛋白水平显著降低。在样品采集前，按照材料和方法中的描述对细胞进行36小时的分化。（B） 在分化后36 h收集的模拟和MyoD分化细胞中，通过RT-PCR监测肌源性靶基因myogenin、desmin和骨骼α-肌动蛋白（Sk.α-actin）的表达以及MyoD的异位表达。（C） 通过实时定量PCR对肌肉特异性基因表达进行定量分析，证实在Prmt5水平降低的细胞中，早期和晚期分化标记显著降低。PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶。
RT-PCR检测Prmt5的减少是否对肌源性靶基因的转录产生影响。如图所示。，MyoD mRNA在每个细胞系中的表达具有可比性，表明每个细胞系都被逆转录病毒感染，并表达同等水平的MyoD。正如预期的那样，早期肌肉标记物肌生成素和晚期基因结蛋白和骨骼α-肌动蛋白都是在与对照细胞中的MyoD分化时诱导的。相反，在MyoD分化的Prmt5反义系中，所有三个标记基因的表达均显著降低。定量实时PCR用于更精确地测量转录物水平的差异（图。). 早期和晚期肌肉特异性转录物的基因激活受损表明，Prmt5在分化过程中的肌源性转录激活中发挥作用。
为了启动骨骼肌分化过程，MyoD促进细胞周期阻滞，包括诱导细胞周期依赖性激酶抑制剂如p21和细胞周期调节因子如视网膜母细胞瘤蛋白(32,54). 因此，细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的活性被下调，细胞周期阻滞得以实现。为了消除Prmt5水平降低时肌源性基因表达缺陷源于异常细胞周期阻滞的可能性，我们在碘化丙啶掺入后进行了FACS分析，以确定细胞是否正常阻滞（表). 在任何评估条件下，对照细胞系和反义细胞系的S期细胞百分比没有差异。循环细胞群包含大约30%的处于S期的细胞。在模拟或MyoD分化细胞中，S期细胞的百分比为12至14%（表)这与永生化成纤维细胞在这些条件下可以实现的细胞周期撤回水平一致(18,45). 这些数据表明，对照系和两个Prmt5反义系在分化后退出细胞周期。RT-PCR分析表明，在与MyoD分化后，p21、cyclin D3、p16和视网膜母细胞瘤蛋白mRNAs在每个细胞系中均被同等上调（数据未显示），进一步证实了这些发现。因此，在Prmt5水平降低时观察到的肌源性基因表达减少并不是由于细胞未能经历细胞周期阻滞。这些数据表明，在这些实验所用的条件下，细胞周期阻滞不需要Prmt5。此外，并非所有MyoD诱导的基因表达都需要Prmt5，因为在MyoD介导的分化过程中上调的细胞周期调节因子在Prmt4水平降低时正常上调。
表1。
| 细胞系 | S相指示电池类型的百分比一
|
|---|
| 自行车 | 模拟差异化 | MyoD分化 |
|---|
| 国家卫生研究院3T3 | 29.7 ± 1.6 | 13.0 ± 3.0 | 13.6 ± 2.1 |
| c15号机组 | 27.4b条 | 10.8 ± 4.5 | 11.8 ± 2.2 |
| c12号机组 | 28.3b条 | 12.4 ± 4.2 | 11.8 ± 0.4 |
在MyoD诱导分化过程中对Prmt5的需求表明，Prmt4可能与MyoD和其他分化调节因子有物理联系。免疫共沉淀实验表明，分化细胞中内源性Prmt5与MyoD相关（图。). 正如预期的那样，在模拟分化细胞或Prmt5反义细胞中未观察到相互作用。额外的实验表明，内源性Prmt5与内源性Brg1相关（图。). 这种关联不依赖于分化，与之前的报告一致，这些报告表明，在肿瘤衍生细胞系中，含有SWI/SNF染色质重塑酶的Brg1亚群与Prmt5相关(41,42).
Prmt5与Brg1和MyoD共免疫沉淀。采集小鼠分化细胞、非分化（时间零点[T0]）MyoD感染细胞或暴露于分化条件下36 h的MyoD受感染细胞，并用所示抗体进行联合免疫沉淀实验。（A） 使用10%的输入样品通过蛋白质印迹检测指示的蛋白质。（B） 模拟和分化样品的全细胞提取物与Prmt5抗体（目录号611538；BD Biosciences）或纯化的免疫球蛋白G（IgG）共免疫沉淀。免疫沉淀材料在SDS-PAGE凝胶上运行，转移到膜上，并探测是否存在Brg1、MyoD和Prmt5。（C） 作为对照，使用c15 Prmt5反义系模拟分化或MyoD分化36 h重复B组的实验。每个Western blot组包含来自相同blot的数据；为了清楚起见，去除了中间的样品。（D） 使用Brg1抗血清进行共免疫沉淀，并探测Prmt5和Brg1。（E） 使用MyoD抗血清进行共免疫沉淀，并检测Prmt5和MyoD的存在。WB，蛋白质印迹；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶。
Brg1和MyoD的结合需要肌生成素启动子处的Prmt5结合和H3R8二甲基化。
我们希望确定Prmt5是否通过与肌生成素基因启动子的调节区直接相互作用直接影响肌生成素的表达。我们检测了肌生成素启动子，因为该位点的转录激活对于后期标记基因（如结蛋白和骨骼α-肌动蛋白）的后续表达以及终末分化是必要的。在模拟和MyoD分化的NIH 3T3和Prmt5反义细胞系中进行Prmt5ChIP（图。). 在NIH 3T3细胞中，Prmt5与肌生成素启动子的结合需要MyoD诱导分化。H3R8是Prmt5的已知底物(41,42). 分化后，H3R8在肌生成素启动子处的二甲基化富集。正如预期的那样，Prmt5结合在反义细胞系中显著降低，与模拟分化细胞中的结合相当。同样，在反义系中，H3R8的二甲基化降低到模拟分化样品中观察到的水平，这表明H3R9在myogenin启动子处的二甲基化合需要Prmt5。
Prmt5与肌生成素启动子和二甲基化物H3R8结合。在模拟和MyoD分化的NIH 3T3和Prmt5反义细胞系中，使用抗Prmt5-和二甲基化（diMe）H3R8的抗体进行ChIP。（A） ChIPs表明，在反义系中，分化细胞中肌生成素启动子处Prmt5和二甲基化H3R8的结合显著减少。作为阴性对照，对延伸因子EF1-alpha的编码区进行扩增。（B） QPCR对肌生成素启动子处的Prmt5结合和H3R8二甲基化进行定量。（C） Prmt5和二甲基化H3R8与肌生成素启动子关联的时间进程。图中显示了分化细胞在指定时间内结合的QPCR分析。值是相对于时间零点获得的值来表示的，时间零点设置为1。
为了进一步研究Prmt5与肌生成素启动子的相互作用，在分化过程中进行了ChIPs。首次添加分化培养基时（时间零点）检测到Prmt5和二甲基化H3R8，并且在整个时间过程中观察到这些蛋白质的相互作用（图。). 这些相互作用先于肌生成素表达的激活(16)，表明Prmt5甲基转移酶有助于促进肌生成素表达的初始启动子重组。奇怪的是，尽管肌生成素启动子处的二甲基化H3R8水平在分化方案期间相对恒定，但在分化后0至12小时之间观察到启动子处存在的Prmt5量的可重复增加（图。). 这一观察的意义（如果有的话）尚不清楚。
先前的工作表明，诱导肌生成素转录需要Brg1的结合和活性，这是一种ATP酶，是一些SWI/SNF染色质重塑酶的催化亚单位(15). 为了确定Prmt5的减少是否影响Brg1与肌生成素启动子的结合，进行了额外的ChIP。这些实验表明，在Prmt5水平降低的细胞中，肌生成素启动子处Brg1的募集减少到模拟分化细胞中所见的结合水平（图。). 对照蛋白印迹显示，Brg1与肌生成素基因座结合的缺失并非由于Prmt5反义细胞中Brg1水平的变化所致（图。). 因此，Prmt5结合和H3R8的二甲基化是Brg1结合的先决条件。肌生成素启动子缺乏Brg1意味着该位点缺乏染色质重塑。在Prmt5水平正常或降低的情况下，REAA允许我们检测肌生成素位点染色质的可及性变化，以响应MyoD诱导分化。当模拟分化时，没有一个细胞系在肌生成素基因座显示出显著的酶可及性（图。). 分化后，NIH 3T3细胞的可接近性增加，但在Prmt5反义细胞系中观察到很少或没有可接近性。这些发现重申了Brg1以允许限制性内切酶可及的方式改变肌生成素启动子结构的要求，并表明Prmt5和二甲基化H3R8的存在不足以在肌生成素位点引起这种结构变化。
肌生成素启动子上的Brg1和MyoD结合需要Prmt5。（A） 在分化后36小时收获的模拟和MyoD分化细胞系中，使用抗Brg1和Myo D抗体进行ChIP，并对肌生成素启动子和延伸因子EF1-alpha编码区（输入对照）进行PCR扩增。面板A和图中的数据。均来自同一实验；因此，两个面板的输入控制带是相同的。（B） 通过QPCR定量Brg1和MyoD结合。（C） Western blot显示Brg1和MyoD蛋白水平不受Prmt5蛋白水平降低的影响。（D） 进行REAA以评估相对于肌生成素mRNA起始位点在−320的Pvu II位点的可及性。染色质可及性依赖于Prmt5的表达。
先前的研究表明，Pbx/Meis同源域因子通过提供一种将MyoD最初靶向该位点的机制，在肌生成素转录的诱导过程中发挥着重要作用(7,28). 进一步研究表明，Brg1介导的肌生成素启动子处的染色质重塑随后允许MyoD与Pbx/Meis位点上游和下游的共识结合位点稳定结合(16). 由于Brg1没有结合或重塑Prmt5反义细胞系中肌生成素启动子处的染色质，我们可以预测，在这些细胞中也不会观察到MyoD的稳定结合。正如预期的那样，反义系中Brg1相互作用减少的另一个结果是MyoD的结合降低到背景水平（图。). 总之，由于Prmt5和Brg1均未与启动子相互作用，Prmt4水平的降低导致肌生成素表达无法激活。因此，组蛋白甲基化、ATP依赖性染色质重塑和MyoD结合等后续事件并未发生。
为了进一步探讨肌生成素位点发生的分子事件，我们评估了Prmt5的结合和H3R8的二甲基化是否需要功能性Brg1。我们之前描述并描述了在没有四环素（Tet）的情况下表达标记的ATP酶缺乏的显性阴性Brg1蛋白的四环素抑制细胞系(14,15)并表明显性负性Brg1的表达阻断了肌源性早期和晚期基因的激活，因为每个诱导位点的染色质重塑被阻断(15,16,39). 在与MyoD分化后，Prmt5能够在表达功能性Brg1（含Tet）的细胞以及表达显性阴性版本Brg1的细胞（无Tet）中与肌生成素启动子结合（图。). H3R8的二甲基化也在启动子处富集，而与Brg1的功能状态无关（图。). 对照蛋白印迹表明，Prmt5蛋白水平不受显性阴性Brg1表达的影响，正如之前所记录的那样，显性阴性Brg 1的表达并没有改变细胞中Brg1的总体水平（图。) (16). 额外的mRNA分析表明，MyoD在表达或缺乏显性阴性Brg1的细胞中表达相同，显性阴性Brg 1的表达抑制了随后的肌源性基因表达（图。和数据未显示）。我们的结论是，Brg1的染色质重塑不需要促进Prmt5在肌生成素启动子处的结合。因此，绑定Brg1需要Prmt5绑定，但绑定Prmt4不需要Brg1函数。
在缺乏功能性Brg1的情况下，Prmt5能够在肌生成素启动子处与H3R8结合并二甲基化。在含有Tet-抑制载体的细胞系分化36小时后进行ChIP，该载体表达标记的ATP酶缺乏显性阴性Brg1。（A） QPCR显示在功能性Brg1存在（+Tet）和不存在（−Tet）的情况下，Prmt5和二甲基化H3R8在肌生成素启动子处结合。（B） 通过Western blotting评估Brg1、Prmt5和标记显性阴性突变体Brg1的蛋白质水平。在没有Tet的样品中Flag的表达表明显性阴性Brg1的表达。（C） QPCR评估MyoD mRNA，以证明分化细胞表达MyoD和myogenin，以证明显性阴性Brg1抑制MyoD依赖性基因的表达。PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶。
Prmt5和二甲基化H3R8存在于体内卫星细胞的肌生成素位点。
为了确定Prmt5在体内是否与肌生成素启动子结合，我们分离了4-5周龄BL6小鼠的后肢肌肉，并分离了卫星细胞和肌纤维（见材料和方法）。卫星细胞是静止的肌肉前体细胞，位于成熟肌肉纤维的基底层(33,48). 激活后，它们表达肌源性调节因子，并通过与现有肌纤维增殖和融合或融合形成新的肌纤维来启动分化程序（参考文献综述19和25). 由于分离和分析这些细胞群的困难，限制了对这些细胞中肌源性基因激活期间转录调节剂和染色质重塑酶的分子作用的研究。
所使用的分离协议产生了一个包含静态和激活细胞的卫星细胞池。为了评估纯化方案是否能够充分分离卫星细胞和肌纤维，采用定量PCR检测卫星细胞和肌肉纤维标记基因的表达。Pax3是一种转录因子，是配对盒/同源结构域家族的成员，在卫星细胞中表达(10). 与成熟肌纤维或阴性对照肝组织相比，Pax3在卫星细胞中高度表达，这表明该部分富含卫星细胞，而肌纤维制剂中几乎没有卫星细胞（图。). 由于卫星细胞组分包含静止和激活的卫星细胞，卫星细胞和肌纤维组分均显示出MyoD和肌生成素的表达。晚期骨骼肌标志物肌营养不良蛋白的表达仅见于肌纤维部分，证明卫星细胞部分没有受到肌纤维的污染（图。).
Prmt5在肌肉卫星细胞的肌生成素启动子处与H3R8结合并二甲基化。（A） 通过标记基因mRNA的QPCR监测卫星细胞和肌纤维的分离和纯化。（B） 利用肌肉卫星细胞和肌纤维获得的细胞核进行的ChIP分析表明，Prmt5结合和二甲基化H3R8存在于卫星细胞的肌生成素启动子处，并且在肌纤维中含量降低。（C） 通过QPCR定量两种细胞类型中Prmt5的转录水平。（D） 通过QPCR量化Re-ChIP分析。用Prmt5抗体免疫沉淀的材料随后用MyoD抗体免疫沉淀。QPCR数据是三个独立实验的平均±标准偏差。
然后，我们从这些分离的组织样本中分离细胞核，并进行ChIP实验以评估肌生成素位点的因子相互作用。Prmt5在卫星细胞的肌生成素启动子处高度富集，但在肌纤维中这种富集显著减少（图。). H3R8二甲基化也在卫星细胞的肌生成素启动子处高度富集，而在肌纤维的肌生成蛋白启动子处增强到较小程度，这与观察到的Prmt5结合减少一致。Prmt5在两个组织样本中的表达水平相当（图。).
由于卫星细胞群同时包含静止细胞和激活细胞，我们无法确定Prmt5与肌生成素启动子的关联与这些细胞中基因表达的激活有关。为了更好地解决这个问题，我们询问Prmt5和MyoD是否可以与肌生成素启动子共定位。由于只有活化的卫星细胞表达MyoD，同时存在MyoD和Prmt5将表明Prmt4存在于积极表达肌生成素的细胞中的肌生成素位点。进行Re-ChIP实验，其中来自用Prmt5抗体免疫沉淀的卫星细胞核的染色质随后用MyoD抗体免疫沉淀。结果表明，Prmt5和MyoD同时存在于活化卫星细胞的肌生成素位点（图。).
总之，这些结果表明，Prmt5精氨酸甲基转移酶是MyoD介导的分化所必需的。对一个早期成肌靶基因的检测表明，Prmt5与肌生成素启动子和二甲基化物H3R8结合。Brg1染色质重塑酶与启动子的结合以及肌生成素表达激活期间发生的所有后续事件都需要Prmt5结合。因此，Prmt5水平降低的细胞无法激活肌生成素，并且由于肌生成素的缺乏，未能激活肌生成晚期基因，导致观察到的分化阻滞。Prmt5和MyoD与原代卫星细胞中的肌生成素基因座的共定位证实了Prmt5在体内肌生成分化中的作用。本文的研究结果为Prmt5在诱导骨骼肌分化过程中的重要生理作用提供了证据，因为它促进肌源性位点依赖ATP的染色质重塑，进而导致基因表达。
讨论
Prmt5是激活肌生成素表达和肌生成所必需的。
结果表明，蛋白甲基转移酶Prmt5是MyoD介导的骨骼肌分化所必需的。Prmt5定位于肌生成素启动子，这是一种MyoD诱导的基因，其表达可介导终末分化(24,27,37). 在细胞培养和从肌肉组织分离的卫星细胞中，肌生成素启动子处Prmt5的存在与二甲基化H3R8的存在相一致，后者是已知的Prmt5B底物(41). 表达低水平Prmt5的操作细胞无法激活肌生成素或其他肌肉特异性基因的表达，且缺乏激活与肌生成素基因座缺乏Prmt5-和二甲基化H3R8相关。此外，在肌生成素表达之前、开始和之后，Prmt5和二甲基化H3R8均存在于肌生成素位点。最后，来自卫星细胞核的re-ChIP实验表明，初级组织中肌生成素启动子处同时存在MyoD和Prmt5。卫星细胞池既包含静止细胞，也包含启动分化的活化细胞。由于只有激活的细胞表达MyoD，re-ChIP实验将Prmt5放在主动表达肌生成素并处于分化过程中的原代细胞的肌生成素启动子上。这一结果支持了Prmt5在骨骼肌分化过程中促进基因激活的结论。
此前有两份报告表明，Prmt5促进报告基因激活；所有其他研究表明，Prmt5在转录抑制中发挥作用。在一项研究中，RNA干扰方法对Prmt5的剂量依赖性降低导致NFAT和白细胞介素-2（IL-2）驱动的启动子活性以及IL-2分泌相应降低，这表明Prmt4促进IL-2表达(44). 在另一份报告中，Prmt5在与p44的多蛋白复合物中纯化，p44是一种雄激素受体（AR）相互作用蛋白，可增强AR依赖性转录。Prmt5与p44协同作用，介导AR依赖性报告基因表达。然而，Prmt5在该系统中的激活不需要其甲基转移酶功能；因此，Prmt5激活转录发生的机制尚不清楚(26). 相比之下，Prmt5参与基因阻遏更为人们所知。有趣的是，似乎涉及多种机制。Prmt5可以使延伸因子Spt5甲基化，从而降低其与聚合酶II（Pol II）的亲和力并阻碍转录延伸(30). 相反，Prmt5直接与控制细胞周期蛋白E、肿瘤抑制因子NM23和ST7的表达的调控序列结合，并且与细胞周期蛋白的表达密切相关-myc公司靶基因、CAD和甲基转移酶功能在检测时需要阻遏(21,41,42). 微阵列和验证性RT-PCR实验确定了其他参与细胞生长控制的Prmt5靶基因(41). H3R8启动子序列的二甲基化与所检测基因的抑制以及Prmt5作为组蛋白脱乙酰酶2和SWI/SNF ATP酶Brg1的多酶复合物的一部分的纯化有关(42)提示了基因调控序列上的核小体可以被改变和/或重新定位的机制，组蛋白可以被二甲基化和去乙酰化，从而导致转录抑制。
Prmt5也在与RNA Pol II和Pol II相关磷酸酶FCP1的复合物中发挥作用，并与一些细胞溶质蛋白一起促进snRNP组装(2,4,35). 因此，可以确定Prmt5可以在多个复合物中发挥多种功能，可能通过其蛋白甲基化酶活性来调节不同的细胞过程。我们的结果表明，Prmt5也可能是一个或多个额外复合物的组成部分，这些复合物作为基因表达的辅激活剂发挥作用。
有趣的是，尽管肌生成素表达以及几种骨骼肌特异性晚期基因的表达需要Prmt5，但在MyoD介导的分化过程中上调以促进细胞周期退出的细胞周期调节因子在Prmt5反义细胞系中正常诱导。这一结果表明，激活每个MyoD靶基因并不需要Prmt5，这让人想起以前的研究，这些研究表明SWI/SNF染色质重塑酶是激活肌生成素和许多骨骼肌特异性晚期基因所必需的，而不是激活细胞周期调节器所必需的(18,45). cDNA表达阵列分析最终显示，虽然在该培养体系中，几乎所有由MyoD诱导的基因都显示出至少适度依赖功能性SWI/SNF酶的存在，但这些基因中只有约三分之一高度依赖功能性SWI/SNF酶类(16). 我们预测，对SWI/SNF酶需求最大的一组基因也将高度依赖Prmt5；需要进行基因芯片分析以明确解决这个问题。
Prmt5功能在导致肌生成素表达的级联事件中促进ATP依赖的染色质重塑。
观察到Prmt5是Brg1-ATP依赖性染色质重塑器结合和功能所必需的，这表明组蛋白甲基转移酶是ATP依赖的染色质重塑发生所必需的。尽管有报道称，特异性修饰的组蛋白作为ATP依赖性染色质重塑酶的特定亚基与染色质相互作用的识别位点(1,22,23,31,52)，我们认为这是首次证明ATP依赖的染色质重塑酶需要特定的组蛋白修饰酶来修饰染色质结构并激活内源性位点的基因表达。
许多研究已经检查了导致肌生成素位点激活的因素和事件顺序(7,16,49). 先前的研究表明，同源域因子Pbx与肌生成素启动子组成性相互作用，并提供了一种机制，以最初将MyoD靶向启动子。这导致启动子特异性组蛋白乙酰化，然后结合SWI/SNF染色质重塑酶的Brg1-ATP酶。随后的步骤，包括染色质可及性的增加、MyoD和Mef2与启动子的稳定结合以及肌生成素转录的激活，都完全依赖于Brg1的功能。组蛋白乙酰化和Brg1结合的动力学，以及分化过程开始时内源性Brg1和内源性Pbx之间的蛋白-蛋白质相互作用，支持染色质修饰酶通过MyoD/Pbx/Meis复合物靶向启动子的想法，以允许组蛋白修饰和依赖ATP的染色质重塑，从而使肌生成素转录所需的转录因子能够稳定占据。Brg1结合对Prmt5存在的依赖性使Prmt4在激活过程的早期发挥作用，与Brg1与启动子的相互作用一致或在此之前。Prmt5功能的时间以及观察到的Prmt4、MyoD和Brg1之间的物理联系表明，以肌生成素启动子为靶点的重塑酶的机制类似。
观察到，Brg1与肌生成素启动子的结合及其随后的染色质重塑功能需要Prmt5，这表明，在肌生成素的启动子上Prmt4的物理存在和/或启动子上H3R8的二甲基化促进了Brg1的结合。组蛋白乙酰化也先于肌生成素启动子处的Brg1相互作用(16)体内和体外数据均表明，Brg1中的溴代多巴胺与乙酰化组蛋白相互作用，组蛋白乙酰化可促进SWI/SNF复合物的功能(1,22,23). 我们推测，Brg1对含有被Prmt5二甲基化的H3R8的染色质有较高的亲和力，H3R8-二甲基化可能与组蛋白乙酰化结合，为Brg1依赖的染色质重塑创造更宽松的底物。
肌发生过程中不同甲基转移酶之间的功能相互作用。
一种独特的蛋白甲基转移酶，Prmt4/Carm1，以前被证明有助于肌生成(9). Prmt4和Mef2C蛋白在ChIP分化细胞培养中定位为肌肌酸激酶启动子，抑制Prmt5表达可阻断肌源性基因的表达。事实上，Prmt4与Brg1复合物中发现，该复合物可促进雌激素受体刺激的基因表达(53)提出了两种PRMT在基因激活事件中与SWI/SNF染色质重塑酶协同作用的可能性。然而，体外Prmt4组蛋白甲基化需要Brg1的ATP酶活性(53)，而我们的数据表明，Prmt5对于Brg1与肌生成素启动子的关联以及启动子染色质可及性的后续变化是必要的。因此，这两种PRMT的作用机制可能不同。此外，据所知，Prmt4和Prmt5不共享相同的组蛋白底物。Prmt5和Prmt4是否可以协同作用，在相同的肌源性位点修饰组蛋白，尚待确定。
