缺乏4E-BP1和4E-BP2的小鼠对饮食诱导肥胖和胰岛素抵抗的敏感性升高

DKO小鼠胰岛素抵抗增加。

据认为，肥胖和脂质积累是胰岛素作用减弱的原因，导致胰岛素抵抗和代谢综合征的发展(25,26). 因此，用胰岛素治疗WT和DKO小鼠以监测胰岛素抵抗。喂食正常饮食的DKO和WT小鼠的葡萄糖清除水平相似（图​（图1F）。1F） ●●●●。HFD喂养导致DKO和WT小鼠出现胰岛素抵抗，如胰岛素降低血糖水平的能力降低所示（图​（图1F）。1F） ●●●●。在DKO小鼠中发现较高水平的胰岛素（表​（表1）1)表明4E-BP是胰岛素正常反应所必需的。事实上，我们观察到DKO小鼠的胰岛素作用受到更大的损害（图​（图1F）。1F） ●●●●。此外，喂食HFD的WT和DKO小鼠均表现出糖耐量受损（图​（图1G），1G） 在DKO小鼠中有更显著的效果。

删除4E-BP1和4E-BP2可促进S6K活动。

之前已经描述过S6K1抑制PI3K/Akt通路的负反馈回路(11,12,18,27). S6K1激活通过磷酸化IRS-1抑制胰岛素信号传导，导致其降解并随后抑制Akt信号传导。因为DKO小鼠表现出与瘦S6K1 KO表型相反的肥胖表型(11)由于4E-BP和S6Ks都是mTOR的靶点，我们怀疑S6K1可能在DKO小鼠中被解除调控。在对照小鼠中，注射胰岛素10分钟后，脂肪组织、肌肉和肝脏中Ser473Akt磷酸化显著增加（图​（图3A三A和补充图4）。然而，在DKO小鼠组织中，Akt磷酸化增加的程度要小得多。Akt磷酸化的减少与S6K活性的增加相关，如S6K1和S6磷酸化增加所示（图​（图3A三A和补充图4）。HFD和肥胖与mTOR通路过度激活有关，特别是与肌肉和肝脏中S6K活性增加有关(12). 在2种遗传性肥胖模型中，S6K活性也增加，对象/对象和K/KA（千卡）^年老鼠(11). HFD喂养导致WT小鼠中S6K1、S6和4E-BP1磷酸化增加（反映为上部缓慢迁移带的增加；图​图3A，三A、 比较通道1和5），表明mTOR活动升高。喂食HFD的DKO小鼠的Akt磷酸化显著受损，这与肥胖、胰岛素抵抗和葡萄糖耐量增加一致（图​（图3A三A和补充图4）。mTOR通路的过度激活也与IRS-1蛋白水平的降低有关(18,27). 由于S6K活性在我们的模型中增加并参与IRS-1活性的控制，我们检测了脂肪组织中IRS-1的表达。与WT小鼠相比，正常饮食喂养的DKO小鼠的IRS-1蛋白水平降低了约35%，HFD喂养的DK0小鼠的IRS蛋白水平降低约60%(P（P）< 0.05; 图​图3，三、B和C）。在这种条件下，喂食HFD的WT和DKO小鼠脂肪组织中胰岛素受体β的表达降低了约35%（补充图5）。这些数据表明，胰岛素信号传导的减少是IRS-1蛋白水平降低的结果。

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图3

4E-BP1和4E-BP2的缺失导致胰岛素信号受损。

(A类)WT和DKO动物肌肉、肝脏和脂肪组织中S6K活性增加，Akt的Ser473磷酸化降低。在尾静脉注射0.75U/kg胰岛素之前，小鼠禁食6小时。10分钟后处死动物，收集组织进行Western blotting。显示WT和DKO小鼠组织的免疫印迹。S473 pAkt，Akt的磷酸化Ser473；T389 pS6K1，磷酸化S6K1的Thr389；S240/244 pS6，磷酸化S6的Ser240/244。(B类)DKO脂肪组织中IRS-1表达降低。(C类)WT和DKO脂肪组织中IRS-1蛋白水平的量化。肌动蛋白水平标准化(n个= 6–7). 数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与WT（双尾、未配对学生t吨测试）。(D类)免疫印迹分析显示，胰岛素治疗后DKO MEF中IRS-1的抑制性丝氨酸磷酸化增加（S636/639 pIRS-1和S1101 pIRS-1），S6K1的持续Thr389磷酸化。

为了检测4E-BP1和4E-BP2破坏对细胞自主系统中胰岛素信号传导的影响，并研究胰岛素的长期影响，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。在DKO和WT MEF中，胰岛素治疗导致S6K1磷酸化增加（图​（图3D）。三D） ●●●●。然而，在缺乏血清的DKO MEF中S6K1磷酸化已经升高（图​（图3D，三D、 比较泳道1和6），并且胰岛素刺激的S6K1磷酸化的动力学被加速，在胰岛素给药后20分钟达到最大磷酸化，并维持8小时（图​（图3D，三D、 比较车道2和7）。相反，在WT MEF中，S6K1磷酸化在胰岛素治疗后持续1小时，然后在治疗后4小时恢复到基础水平（图​（图3D）。三D） ●●●●。DKO MEF中S6K1的组成性激活也与Akt磷酸化的降低有关，这表明DKO MEFs对胰岛素治疗的敏感性较低（图​（图3D，三D、 比较车道2和7）。因为S6K1激活与肥胖和IRS-1丝氨酸磷酸化增加有关(11,12)还检测了IRS-1磷酸化。在DKO MEF中，S6K1磷酸化加速与IRS-1在Ser636/639和Ser1101残基上的更快磷酸化相关（图​（图3D，三D、 比较车道2和7），解释Akt激活减少的原因。这两个位点都与胰岛素信号的抑制有关(23,28)和Ser636/639磷酸化已被证明与2型糖尿病相关(23).

DKO脂肪组织中的脂质代谢发生改变。

接下来，为了确定DKO小鼠中的脂肪积累是脂肪生成增加还是脂肪分解减少的结果，在分离的性腺脂肪组织中检测了TG合成、甘油释放和再酯化。DKO和WT小鼠的基础TG合成类似。胰岛素使WT小鼠的TG合成增加了2.5倍，而喂食正常饮食的DKO小鼠的相同治疗仅增加了1.7倍（图​（图4A）。4A） ●●●●。这一结果与在DKO小鼠中观察到的受损胰岛素信号一致（图​（图3）。三). 用异丙肾上腺素（一种特异性脂肪分解激活剂）治疗后，WT和DKO小鼠的TG合成减少程度相同（图​（图4A）。4A） ●●●●。然后使用甘油释放作为脂质分解的指标来检测脂质分解。与WT小鼠相比，DKO小鼠脂肪组织中的基础脂肪分解较低（与WT水平相比，饮食中约32%，HFD中约47%；P（P）< 0.05; 图​图4B）。4B） ●●●●。脂肪分解减少可能是肥胖发展的主要原因。胰岛素治疗后，WT小鼠的脂肪分解受到抑制，但DKO小鼠没有。这也与我们的发现一致，即DKO小鼠存在胰岛素抵抗（图​（图1F）。1F） ●●●●。异丙肾上腺素治疗使WT和DKO小鼠的脂肪分解增加到相同程度（图​（图4B）。4B） ●●●●。进一步研究表明，参与脂肪细胞脂肪分解控制的2种蛋白质、激素敏感脂肪酶（HSL）、Ser565磷酸化HSL的水平没有显著差异(29,30)和紫苏素(31,32)，在DKO脂肪组织中（图​（图4C）。4C） ●●●●。因此，脂解途径成分的改变并不是DKO脂肪组织基础脂解减少的原因。

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图4

4E-BP1和4E-BP2的缺失改变了脂质代谢。

从对照组或高脂肪饮食的禁食小鼠中收集脂肪组织，并在5 mM葡萄糖钙中孵育²⁺-方法中描述的含有1%无脂肪酸BSA（基础）、100 nM胰岛素或10μM异丙肾上腺素的游离Krebs-Ringer缓冲液(n个= 5). (A类)在分离的脂肪组织中测量TG合成。(B类)DKO脂肪组织中的脂解减少。(C类)溶脂相关蛋白的Western blot分析。S565 pHSL，磷酸化HSL的Ser565。(D类)DKO脂肪组织中脂肪酸重结晶增加。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与WT（双向方差分析）。

脂肪酸再灭菌也可能导致WT和DKO小鼠脂肪积累的差异。在脂肪分解过程中，脂肪细胞TG释放NEFAs和甘油（比例为3:1）。尽管甘油不能被脂肪细胞重复使用，但NEFA可以重新灭菌以产生新的TG。因此，甘油水平与NEFA水平的比值提供了重新灭菌的指标(33). 在喂食正常饮食的小鼠中，约75%–80%的脂肪酸被脂肪细胞有效吸收并储存为TGs，WT和DKO小鼠之间没有差异（图​（图4D）。4D） ●●●●。在喂食HFD的小鼠中，由于饮食中容易获得的脂肪酸增加，脂肪酸的重新酯化减少了约30%-40%。胰岛素显著降低了喂食HFD的WT小鼠的脂肪酸重结晶，但喂食HFD-的DKO小鼠的重结晶保持在35%（图​（图4D）。4D） ●●●●。总之，这些数据表明，脂肪分解减少和胰岛素刺激的再酯化增加会导致DKO小鼠的脂肪积累增加。

材料和化学品。

所有细胞培养液和补充剂均购自Invitrogen。FBS购自Sigma-Aldrich。SDS-PAGE试剂购自Bio-Read。增强化学发光试剂盒购自PerkinElmer。与辣根过氧化物酶结合的抗鼠和抗兔IgG购自Amersham Biosciences。用于胰岛素抵抗测试的人胰岛素（Humalog）是从礼来公司获得的。在脂肪生成实验中，胰岛素3,3′，5-三碘-我-甲状腺素、DEX、IBMX和IND来自Sigma-Aldrich。d日-[1-¹⁴C] 葡萄糖[^三H] 油酸，以及[^三H] 甲羟戊酸内酯购自PerkinElmer，用于色谱的氧化铝06300 Fluka和所有其他化学品购自Sigma-Aldrich。

代谢研究。

8周龄雄性小鼠随意喂食正常饮食或HFD 16周。每周记录体重，并在饮食结束时连续15天每天测量食物摄入量。为了测试胰岛素抵抗，给喂食动物腹腔注射0.75 U/kg胰岛素，并使用AccuSoft advantage血糖仪（罗氏诊断公司）在0、15、30、45和60分钟时测量尾静脉全血中的葡萄糖浓度。隔夜禁食后进行葡萄糖耐量试验。小鼠腹腔内注射2 g/kg葡萄糖，并在0、30、60、90和120分钟时测量血糖水平。用ELISA（ALPCO诊断和研发系统）测定空腹胰岛素和瘦素水平。使用检测试剂盒（Roche Diagnostics）测量TG、胆固醇和HDL-胆固醇水平。使用NEFA C试剂盒（Wako）测量NEFA。

沃₂测量。

沃₂分析了48小时内的二氧化碳生成量和呼吸商。使用氧气分析仪（S-3A1；Applied Electronicstry；AEI Technologies Inc.）和二氧化碳分析仪（CD-3A；Applieve Electronics；AEI技术Inc.）在开路系统中进行24小时连续测量。沃₂计算为ml/kg/h。

肝脏和脂肪组织的组织学和形态计量学分析。

如前所述，通过苏木精和伊红染色分析石蜡包埋脂肪组织和肝脏切片(10). 使用NIH ImageJ软件对来自每种基因型3种不同动物的500个细胞的性腺白色脂肪组织进行形态计量学分析(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/).

RT-PCR分析。

使用TRI提取总RNA佐尔（Invitrogen）根据制造商的说明。使用铂qRT-PCR Thermoscript一步法系统（Invitrogen）扩增总RNA（100 ng）。PCR中使用的引物如下：C/EBPβ，5′-GCAAGAGCGACAAG-3′，反义5′-GGCTCGGCGCTT-3′；C/EBPδ、有义5′-GCTCTTGACTCGAACG-3、反义5′-TGCTACCTTAGCTGCAATGG-3；C/EBPα，5′-GAACACGAGTACCGGTA-3′，反义5′-GCCATGCTTGACCAAGGAG-3′；PPARγ，意义5′-CACAGAGCATGGTGCTTCGCT-3′，反义5′-CAGCAACCATGGTCAGCTC-3′；β-肌动蛋白，5′-GGACTCCTATGTGTGGACGAGG-3′，反义5′-GGGAGAGCATAGCTCGTAGAT-3′。

蛋白质印迹分析。

在含有40 mM HEPES（pH 7.5）、120 mM NaCl、1 mM EDTA、10 mM焦磷酸、10 mM甘油磷酸、50 mM NaF、1.5 mM原钒酸钠、10μM冈田酸、10μg/ml抑肽酶和10μg/ml亮氨酸肽的裂解缓冲液中采集组织。溶解后，在12000℃离心除去不溶物克在4°C下保持10分钟。蛋白质含量由Bradford蛋白质测定法（Bio-Rad）测定。用Laemmli样品缓冲液处理等量的蛋白质。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。用含0.1%（v/v）吐温-20的PBS中的5%脱脂干乳封闭膜1小时，并用一级抗体孵育过夜。使用过氧化物酶偶联二级抗体和增强化学发光检测一级抗体（Amersham Biosciences）。抗4E-BP1、Akt、Ser473-磷酸化Akt，S6K、Thr389-磷酸化S6K、S6、Ser240/244磷酸化S6、Ser636/639-磷酸化IRS-1和Ser565-磷酸化HSL的抗体购自Cell Signaling Technology。IRS-1抗体购自Upstate USA Inc.。Ser1101-磷酸化IRS-1疫苗是R.D.Polakiewicz（Cell Signaling Technology，Danvers，Massachusetts，USA）赠送的礼物。抗-HSL和-紫苏素抗体是C.Londos（NIH，Bethesda，Maryland，USA）赠送的礼物。

原代MEF和分离的前脂肪细胞的脂肪细胞分化。

如前所述，通过胶原酶消化从WT和DKO性腺白色脂肪组织中分离出脂肪细胞及其前体细胞(34)并按照MEF所述进行区分。将13.5至14.5日龄胚胎的初级MEF（第0代或第1代）在分化培养基（含10%FBS的DMEM，添加20 nM胰岛素和1 nM 3,3′，5-三碘-我-甲状腺素）。通过将融合细胞置于进一步添加500μM IBMX、500 nM DEX和125μM IND的分化培养基中处理48小时，诱导脂肪细胞分化2天。诱导期结束后，用分化培养基替换培养基，然后每隔一天更换一次。在分化培养基中再培养4天后（第6天），细胞表现出完全分化的表型，并大量积聚多房脂肪滴。

油红O染色。

在组织培养皿中生长的细胞用PBS洗涤两次，并在室温下用10%的缓冲甲醛固定至少1小时。然后在室温下用过滤过的0.5%油红O溶液（异丙醇）对细胞染色2小时，并用蒸馏水彻底清洗，然后进行可视化。使用染料提取物（Chemicon International）提取脂质后测定TG含量。

原发性MEF感染4E-BP1和4E-BP2逆转录病毒。

将人类4E-BP1和4E-BP2 cDNA亚克隆到MSCV-IRES-GFP逆转录病毒质粒中（来自加拿大蒙特雷尔麦吉尔大学J.Pelletier）。通过使用Lipofectamine Plus试剂（Invitrogen）转染Phoenix 293细胞产生逆转录病毒。使用上清液（转染后48小时）感染早期传代MEF，每天感染3天，并加入聚brene（5μg/ml）。通过GFP的存在监测感染效率。然后使用融合培养物诱导分化。

脂解和脂肪生成分析。

收集性腺脂肪组织（在饮食2周后），并在室温下放置在MEM中。用PBS冲洗组织，切成小块，放入48周的板中，然后用PBS、100 nM胰岛素或10μM异丙肾上腺素处理，并在37°C的5 mM葡萄糖钙中培养3小时²⁺-自由Krebs-Ringer缓冲器(56)含1%不含脂肪酸的BSA和1μCi/μld日-[1-¹⁴C] 葡萄糖。为了刺激脂肪分解，我们使用了异丙肾上腺素，而不是肾上腺素或儿茶酚胺，因为它是一种纯β-激动剂，因此会引起更大的脂肪分解反应。孵育后，将平板置于冰上，取出缓冲液并储存在-20°C下，以供将来进行NEFA和甘油释放分析。在-20°C的庚烷/异丙醇（3:2比）中隔夜从组织碎片中提取脂质。第二天，用第二次添加的庚烷-异丙醇溶液从组织碎片中重新提取脂质，并将两个池合并并冷冻干燥。为了选择中性脂质（TGs），通过向每个样品中添加庚烷/异丙醇（3:2比例）和氧化铝，磷脂与氧化铝结合。样品在室温下在平板振动筛上混合15分钟，并在800℃下离心克在4°C下持续15分钟，将上清液转移到闪烁瓶中并计数5分钟。使用Wako的商用NEFA C试剂盒和Roche Diagnostics的TG试剂盒测量组织释放的NEFA和甘油量。将可溶性细胞蛋白溶解在0.1 N NaOH中，用Bradford试验（Bio-Rad）测量蛋白质浓度，并给出相对于总蛋白质的数值（μg）。

我们感谢C.Lister、P.Kirk和K.Zwicker提供的出色技术援助，以及J.Penney和A.Sylvestre维护小鼠群体。我们感谢R.D.Polakiewicz的Ser1101磷酸化IRS-1抗体，C.Londos的抗HSL和抗血脂素抗体，以及Y.H.Tseng对脂肪生成的有益讨论。这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）对N.Sonenberg的资助，N.Sonemberg是CIHR杰出科学家和霍华德·休斯医学院国际研究学者。O.Le Bacquer和E.Petroulakis是麦吉尔大学博士后奖学金的获得者，K.Cianflone是加拿大高级研究主席学者，由CIHR资助，F.Poulin获得了CIHR的博士奖。