分子细胞生物学。2006年12月；26(24): 9497–9507.
BRF1蛋白周转和mRNA衰变活性受蛋白激酶B在相同磷酸化位点的调节▿
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唐·本杰明
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
马丁·施密德林
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
卢敏
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
布里吉特·格罗斯
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
克里斯托夫·莫罗尼
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
瑞士巴塞尔4003 Petersplatz 10医学微生物学研究所
†D.B.和M.S.对这项研究的贡献相等。
2006年6月19日收到；2006年7月28日修订；2006年9月28日接受。
摘要
BRF1转录后通过将携带ARE的转录物靶向衰变机制来调节mRNA水平。我们之前显示，蛋白激酶B（PKB）磷酸化Ser92处的BRF1，导致与14-3-3结合并损害mRNA衰变活性。在这里，我们确定了Ser203的一个额外调节位点，该位点与Ser92在体内协同作用。体外激酶标记和wortmannin敏感性表明Ser203磷酸化也由PKB完成。两种丝氨酸到丙氨酸的突变将BRF1从PKB调节中解偶联，导致组成mRNA即使在存在稳定信号的情况下也会衰减。BRF1蛋白由于蛋白酶体降解（半衰期<3小时）而不稳定，但在磷酸化后变得稳定，在PKBα中不太稳定−/−细胞。令人惊讶的是，磷酸化依赖性蛋白的稳定性也由Ser92和Ser203调节，这些位点需要平行磷酸化。只有当两个位点都发生突变时，14-3-3的磷酸化依赖性结合才被废除。细胞室分馏实验支持一种模型，在该模型中，与14-3-3结合可通过重定标来隔离BRF1，并阻止其执行mRNA衰变活动以及蛋白酶体降解，从而保持BRF1蛋白的高水平，这是在稳定信号消散后恢复衰变所需的。
mRNA水平的转录后调节是控制基因表达的重要机制。调节mRNA转换率可以调节转录物的稳态水平，从而调节适应当前生理需求的最佳蛋白质水平。许多转录后控制的转录本本质上是不稳定的，半衰期短，然而，在适当的刺激下可以增加半衰期。短期成绩单顺式靶向mRNA衰变机制的元素；其中，最常见的是AU-rich元件（ARE），它位于3′非翻译区（UTR），存在于多达8%的所有转录物中(4). 不稳定的ARE相关转录物已被描述为来自不同基因组的转录物，如细胞因子、原癌基因、生长因子和细胞周期调节因子的转录物。ARE通常用作破坏AU-结合蛋白（AUBPs）稳定性的结合位点，AUBPs启动由二烯基化和去盖引发的事件链，并最终破坏转录物。已确定具有已知mRNA防腐剂特性的AUBP是ZFP36/Tis11家族三四脯氨酸（TTP）、BRF1（同义词ZFP36L1和Tis11b）、BRF2和ZFP36L3的CCCH串联锌指蛋白(6,10,24,41)和KH域RNA结合蛋白KSRP(16). 相反，HuR是稳定AUBP的一个例子(14,29)在AUF1的情况下，不同的亚型可以发挥稳定或不稳定作用(37,38).
转录后调控的显著特征是快速性和可逆性。大多数携带ARE的转录本的默认状态是不稳定；外源信号促进的稳定导致mRNA的快速积累和基因表达的扩增，从而导致其蛋白质水平的增加。当信号消散时，积累的过量ARE mRNA必须迅速降解，以恢复细胞以前的生理状态。众所周知的ARE mRNA稳定的生理学例子是在感染期间由白细胞介素-1（IL-1）或细菌脂多糖刺激的巨噬细胞产生TNF-α和CDX2(10,20)肥大细胞对免疫球蛋白E（IgE）相关过敏原的反应产生IL-3(47)以及免疫刺激后T细胞产生IL-2(28). 此外，紫外线暴露等应激刺激(17)、热休克和泛素化(25,26)，缺氧(35)和肿瘤发生(32)据报道导致ARE mRNA稳定。
AUBP是连接膜源刺激与mRNA衰变机制的信号通路的明显远端靶点。KSRP公司(7)和AUF1(46)活性受磷酸化负调控。据报道，c-Jun激酶在调节IL-2方面具有稳定作用(12)和IL-3(31)mRNA。p38-MK2通路以ARE依赖的方式调节肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA和生物合成(11,19,33). 巨噬细胞中p38-MK2的靶点是TTP，在脂多糖诱导多种不同的假定激酶后，TTP在多个部位发生过度磷酸化(9). MK2对Ser178的关键磷酸化导致14-3-3结合并抑制TTP活性(13,42).
另一种稳定方式是通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）-蛋白激酶B（PKB）途径，该途径对BRF1活性起抑制作用。我们之前的工作确定Ser92是PKB靶向的重要磷调节位点(39). 通过体外实验，我们发现PKB对BRF1的磷酸化导致14-3-3结合和ARE mRNA衰变-增殖活性的丧失。用丙氨酸替代Ser92使BRF1对PKB抑制不起作用。在本研究中，我们确定Ser203为第二个PKB调节位点，并报告Ser92和Ser203协同调节该AUBP的体内衰变活性。
BRF1基因敲除小鼠是胚胎致死小鼠，提示其在发育中起着重要作用(44). 此外，BRF1基因在心脏和肝脏等外周器官中呈昼夜节律表达(34,43)因此可能负责将昼夜节律表达强加到其目标转录物上。这些观察结果支持BRF1转录后调控可能发挥复杂生物学作用的观点。由于BRF1蛋白处于昼夜表达，为了反映这种表达模式，BRF1蛋白预计寿命较短。这里，我们表明，根据预测，BRF1蛋白确实会迅速降解；然而，蛋白质是通过磷酸化来稳定的。出乎意料的是，磷酸化依赖性蛋白质的稳定是由同样控制其mRNA衰变活性的磷调节位点赋予的。我们提出了一个模型，根据该模型，BRF1与14-3-3的磷酸化依赖性结合导致其活性和降解受到抑制，从而将这些看似不相关的现象结合起来，并且这种协调的调节确保有足够的BRF1蛋白可用于快速重新安装mRNA衰变。
材料和方法
质粒。
质粒pTet-off购自Clontech。质粒bsd-HisBRF1重量和bsd-HisBRF1S90/92A型已在前面描述过(39). bsd-HisBRF1型S203A型和bsd-HisBRF1S90/92/203A号以TV420（5′-TTGGCCTTTGCTGGGTTCCCAGTGC-3′）为上游引物，TV419（5′-AGGAATGCTGGGCGGGGGCGCG-3′）作为下游引物，bsd-HisBRF1为下游引物通过定点突变构建了三个突变体重量和bsd-HisBRF1S90/92A型作为模板。pTRE-BRF1wt、pTRE-BRF1S203A和pTRE-BRF1S90/92/203A是通过插入来自bsd-HisBRF1的XbaI-KpnI（钝）片段构建的重量，bsd-HisBRF1S203A型和bsdHisBRF1S90/92/203A号pTRE-myc-GFP的XbaI-SalI（钝）站点(43). 质粒SP6-ARE的构建(39)，（m/p）-HA-PKBα(2)、T7-ARE−和pQE-30-BRF1重量(41)前面已经介绍过。pSRL载体（Tet-β-珠蛋白-IL-3 3′UTR报告子）由pTet-BBB-ARE生成GMCSF公司(48)通过将钝化的BamHI-BstXI片段替换为pMXh-β-IL-3（UTR）wt的钝化BamHI-SphI片段(31). 第QE-30-BRF1页S203A型和pQE-30-BRF1重量通过插入bsd-HisBRF1中的BamHI（钝）-XhoI片段生成重量或bsd-HisBRF1S203A型分别进入pQE-30（QIAGEN）的SmaI-SalI位点。pQE-30-BRF1重量143-233和BRF1S203A143-233型通过插入bsdHISBRF1的240bp SacI/BtrI片段构建质粒重量或bsdHISBRF1S203A型分别进入pQE-30的SacI/SmaI位点。
如前所述生产重组蛋白(41). BRF1 S203和磷酸-S203肽，以及钥匙孔帽贝血蓝蛋白和卵清蛋白偶联肽，购自PickCell Laboratories BV。
细胞培养、转染和试剂。
HT1080，慢C(40)，不超过3T3 B2A类2-23个(48)，HIRc-B(30)，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）-PKBα+/+和MEF-PKBα−/−(51)细胞生长在添加有10%胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基中，37°，5%CO2为了降低背景PKB活性，在用胰岛素（20μg/ml；Sigma）刺激之前，细胞在无血清培养基中饥饿过夜。按照制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（生命技术）进行转染。
蛋白质纯化。
在含有完整蛋白酶抑制剂（Roche）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒I和II（Sigma）的放射免疫沉淀分析缓冲液中溶解细胞颗粒。按照制造商的建议，使用Qproteome Cell Compartment试剂（QIAGEN）进行亚细胞蛋白质组分离。将最终馏分甲醇沉淀并重新悬浮在80μl放射免疫沉淀分析缓冲液中，用于蛋白质浓度测量。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上运行10微克裂解液进行蛋白质印迹。如前所述，用镍柱纯化带有His标签的重组BRF1(39).
体外磷酸化。
用30 mM Tris-HCl（pH 7.5）和5 mM MgCl的混合物进行体外磷酸化反应2、1 mM二硫苏糖醇和0.2 mM[γ-32P] ATP，以4 ng/μl重组BRF1肽为底物，10 ng/μl任一活化PKB(50)、ERK1（上游）、p38或MK2（由瑞士巴塞尔诺华H.Gram提供）在30°C下保持30分钟。
ARE mRNA衰变分析。
NIH 3T3 B中RNA衰变的测量2A类2-如前所述，对四环素敏感的Tet-β-珠蛋白-IL-3 3′UTR报告基因的23个细胞进行检测(39). 通过添加强力霉素（2μg/ml；Sigma）阻止报告者转录。结果通过QuantityOne软件（Bio-Read）的磷光成像进行量化。
如前所述，进行ARE依赖性体外衰变试验(39). 简单地说，将5 ng重组BRF1添加到5μg慢C细胞S100提取物中，并与标记的ARE RNA探针孵育指定时间。通过添加样品缓冲液停止反应，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳解析产物。
蛋白质印迹分析。
采用标准的Western blot方法。蛋白质样品在预制的4至20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶（Anamed）上运行，以获得BRF1条带的最佳分辨率。用于Western blot分析的抗体为sc-5536兔多克隆抗管蛋白（Santa Cruz）、597F11小鼠单克隆抗磷酸化-Ser473-PKB（Cell Signaling Technology）、兔多克隆抗体PKB（Cell Signaling-Technology）和兔多克隆抗血清BRF1(37)sc-629兔抗14-3-3β（Santa Cruz）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（抗GAPDH；Abcam）、抗组蛋白H1（Calbiochem）和二级抗体山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶（AP；Southern Biotech）和山羊抗鼠IgG-horsradish过氧化物酶（HRP；DAKO）。分别使用CDP-Star（Roche）或ECL Advance（Amersham）可视化波段。
通过在PickCell Laboratories BV用锁孔帽贝血蓝蛋白结合的磷酸肽（R-L-Q-H-S-F-pS-F-a-G-F-P-S，对应BRF1的氨基酸[aa]197-209）免疫三只兔子，产生抗磷酸化S203BRF1抗体。根据制造商的方案，用与激活的CH Sepharose 4B（Pharmacia）相连的免疫肽亲和纯化两只阳性兔的血清。将纯化的抗体与未磷酸化肽（与免疫肽序列相同）在冰上预吸附3小时，然后添加到印迹中。
BRF1-14-3-3配合物的共沉淀。
如前所述执行His-BRF1下拉(39). 简言之，将40ng His标记的重组BRF1（野生型，S90/92A、S203A和S90/92/203A）添加到40μg慢C细胞S100提取物中，并在30°C下孵育30分钟。将BRF1在含有10mM咪唑的1×结合缓冲液（1mM MgCOOH、1.5mM KCOOH、150mM NaCl、10%甘油）中于4°C下与镍柱（QIAGEN）结合1小时。将珠粒在含有20mM咪唑的1×结合缓冲液中洗涤（4℃，2×2小时）。结合蛋白在SDS样品缓冲液中煮沸洗脱，然后立即装入凝胶。
结果
除BRF1 Ser92外，识别另一个PKB调控位点。
我们之前通过ARE特异性体外衰变试验表明，BRF1通过PKB在Ser92处磷酸化而失活。92位丝氨酸被丙氨酸（S92A）取代的磷酸化缺失BRF1突变蛋白对PKB介导的失活具有抵抗力(39). 为了测试这种替代是否也足以消除体内PKB的调节，我们将野生型BRF1（BRF1wt）或S92A突变蛋白与活化的PKB共同转染到NIH 3T3 B中2A类2含有四环素诱导基因表达系统的小鼠成纤维细胞(48). 融合到IL-3 3′UTR的β-珠蛋白报告基因的表达是由这些细胞中的四环素敏感启动子驱动的。添加四环素类似物多西环素可阻止报告基因表达，从而避免了对放线菌素D等一般转录阻遏物的需要(18,48). 为了在我们的共转染试验中测量报告基因mRNA的稳定性，通过添加多西环素停止转录，并通过Northern杂交测定报告基因转录随时间的衰减率。正如预期的那样，由于ARE的不稳定存在，报告者迅速衰减（图。，车道1至3）；然而，活化PKB的共同转染大大延长了转录物的半衰期（第4到第6道）。BRF1wt与PKB共转染不会对抗稳定作用（7到9道），因为BRF1被PKB灭活。令人惊讶的是，Ser90/92Ala突变体（BRF1AAS，第10至12道）无法逃避PKB的稳定作用，这与体外试验的结果不一致。Ser90和Ser92一起突变，因为如果Ser92发生突变，Ser90可以在体外条件下作为替代磷酸化位点；然而，Ser90Ala突变没有显示Ser92Ala突变所观察到的生物特性（数据未显示）。图（左侧）显示了根据肌动蛋白控制标准化的三个独立实验的量化结果。这些观察结果表明，PKB对BRF1的体内调节需要Ser92以外的另一个调节位点。
BRF1活性在丝氨酸92和203的体内协同调节。（A） 已知哺乳动物ZFP36/Tis11家族成员BRF1、BRF2、TTP和ZFP36L3的比对显示了203位的保守丝氨酸（BRF1编号）。除ZFP36L3外，显示了人的序列，这是小鼠特有的。人类和小鼠BRF1蛋白在所示序列上具有完美的同源性。（B） Tet-β-珠蛋白-IL-3 3′UTR报告基因单独转染（1至3道）或与组成性激活的m/pPKB（4至18道）和BRF1wt（7至9道）、BRF1S90A/S92A（BRF1AAS，10至12道）、BREF1S203A（BRF1 SSA，13至15道）或BRF1S90 A/S92A/S203A组合转染（BRF1AA，16至18道。48小时后，通过添加强力霉素（2μg/ml）停止转录。在指定的时间点分离细胞质RNA并进行Northern印迹处理。泳道1至3和泳道16至18的面板由于信使核糖核酸报告基因的起始水平较低而暴露时间较长。（C） 显示报告转录信号量化的图表，标准化为来自三个独立实验的肌动蛋白对照。GAPDH的印迹重绘和报告探针对GAPDH衰变的归一化作为独立对照，得出了与肌动蛋白类似的结果（数据未显示）。
BRF1中的丝氨酸203保守并参与调控。
对BRF1蛋白序列的激酶目标基序的搜索确定Ser203为假定的磷酸化位点。丝氨酸203与丝氨酸178在TTP中同源，TTP是ZFP36/Tis11蛋白家族的另一个成员，被MK2磷酸化(13). 值得注意的是，丝氨酸203位点在家族的每个成员中都是保守的（图。). 为了确定该丝氨酸是否真的是BRF1中的一个额外调节位点，我们构建了一个Ser203Ala突变体（BRF1SSA）和一个三重突变体Ser90/92/203Ala（BRF1AAA），并通过共转染实验测试了它们在体内的行为。仅丝氨酸203的突变无法克服PKB的稳定作用（图。，泳道13至15）。然而，组合突变赋予了对PKB介导的BRF1失活的抗性，并且ARE报告RNA被迅速降解（泳道16至18）。图中显示了三个独立实验的量化结果。（右侧）。值得注意的是，即使在活化的PKB存在的情况下转染AAA突变体，也会使报告者的稳定性降低到比对照细胞更低的水平，这表明在这种情况下，BRF1活性完全从PKB对照中被解除。在未转染细胞（1至3道）和BRF1AAA转染细胞中（16至18道），报告转录物的基线水平较低，这可能反映了报告mRNA在这些情况下的低稳定性。这些数据表明，除Ser92外，Ser203还调节BRF1对PKB的反应。
BRF1丝氨酸203在体外被PKB磷酸化。
为了测试Ser203是否被PKB直接靶向，我们用活化形式的PKB、p38、MK2和Erk1制备了体外激酶反应。为了减少其他丝氨酸或苏氨酸磷酸化的背景信号，我们使用了一个截短的BRF1肽，跨越丝氨酸203（aa 143至233）和一个相应的带有Ser203Ala取代的片段作为特异性对照。而所有其他测试的激酶都能够磷酸化野生型和突变肽（图。)，只有PKB显示出差异磷酸化，并且无法磷酸化含S203A的片段。将越来越多的肽滴定到体外PKB激酶反应混合物中，结果表明，在底物的大浓度范围内，野生型和突变型片段的磷酸化之间存在相同的差异（图。). 为了确认迄今为止观察到的结果是针对Ser203磷酸化的，并排除引入的突变反而破坏了另一种丝氨酸/苏氨酸的识别位点的可能性，我们用磷酸化Ser203特异性抗体在血清学上证实了这些实验。用跨越Ser203的磷酸肽（R-L-Q-H-S-F-pS-F-a-G-F-P-S；BRF1的aa 197至209）免疫兔子，血清的特异性如图所示。。我们重复了体外激酶检测，并用磷酸特异性抗体探测磷酸化-Ser203特异性信号。与PKB孵育的野生型肽获得强烈信号，但在突变肽中未观察到相应的磷酸化（图。、车道2和3以及E）。p38、MK2和Erk1未检测到磷酸化-Ser203特异性信号，这说明这些激酶在其他位点对片段进行了磷酸化。值得注意的是，TTP（丝氨酸178）中与丝氨酸203同源的位点被MK2磷酸化。虽然这两种蛋白质之间的磷调节位点是保守的，但似乎涉及不同的信号通路。
PKB在丝氨酸203处磷酸化BRF1。（A） 抗磷酸化-Ser203抗体的特性。用BRF1wt（wt）或BRF1S203A突变蛋白（S203A）转染HIRc-B细胞，并用胰岛素刺激30分钟以激活PKB。细胞裂解物与磷酸化和非磷酸化对照肽（pept）一起运行，以观察抗体是否可以从总细胞裂解物中检测磷酸-Ser203。如有指示，在装载前用λ蛋白磷酸酶（30℃，30 min）处理提取物。磷特异性信号由箭头指示。（B） 含有野生型序列（wt）或S203A突变（S203A）的重组BRF1肽（aa 143至233）与活化激酶PKB、p38、MK2和Erk1以及放射性ATP一起孵育。对样品进行解析，并通过放射自显影术对肽标记进行可视化。（C） PKB磷酸化的条件与B组相同，并滴定增加的肽量。（D和E）以非放射性方式重复上述实验，并用抗磷酸化Ser203抗体对反应产物进行Western印迹。磷酸化信号仅在PKB磷酸化后检测到，在与S203A肽的反应混合物中不存在。
BRF1在体内Ser203被磷酸化。
为了证实BRF1Ser203在体内确实被磷酸化，我们使用了HIRc-B细胞，该细胞过表达胰岛素受体并对胰岛素产生强烈反应(30). 这些细胞先前被用于证明胰岛素刺激的PKB激活和随后的BRF1 Ser92磷酸化(39). 用BRF1wt和BRF1S203A突变体转染HIRc-B细胞，并用胰岛素或冈田酸（OA）刺激。OA是一种蛋白磷酸酶2A抑制剂，广泛激活多种信号通路并稳定IL-3 mRNA(5). 用磷酸化-Ser203抗体检测处理细胞的裂解液。两种刺激都能激活PKB并增加BRF1的基础磷酸化水平（图。，将车道1与车道3、4和5进行比较）。至关重要的是，用沃特曼（WM）预处理细胞，沃特曼是一种PI3-K抑制剂，可以阻止胰岛素诱导的PI3-K下游靶蛋白PKB的激活，导致BRF1磷酸化显著降低（6到8道），这与缺乏PKB激活相关（最低部分）。这些数据支持PKB参与体内丝氨酸203处BRF1的磷酸化。
BRF1在体内被丝氨酸203磷酸化。（A） 用BRF1wt或BRF1S203A转染HIRc-B细胞，转染后48小时用胰岛素（20μg/ml）或400 nM OA刺激30分钟。如有指示，在刺激前15分钟用WM（200 nM）预处理细胞。用抗磷酸化Ser203 BRF1抗体和抗磷酸化Ser473 PKB检测细胞裂解产物，以显示BRF1 Ser203磷酸化与PKB活性之间的相关性。（B） 用BRF1wt或BRF1S203A转染NIH 3T3细胞，并用400 nM OA刺激30分钟。每个面板左侧显示磷酸化S203特异性信号。
我们接下来想看看这是否也适用于NIH 3T3 B2A类2BRF1的PKB磷酸化，即调节其mRNA衰变活性的功能作用已经被证明。转染BRF1wt和BRF1S203A构建物，由于胰岛素反应较弱，细胞用OA而不是胰岛素刺激（数据未显示）。OA增加了PKB激活水平，导致BRF1 Ser203的磷酸化水平升高（图。，比较车道1和3）。我们得出结论，体内BRF1在Ser203处被磷酸化，以响应激活PKB的生理和非生理刺激。
BRF1蛋白通过磷酸化快速降解和稳定。
在进行这些实验的同时，我们还对BRF1蛋白的稳定性感兴趣。由于BRF1是昼夜节律表达的(34,43)通过预测，它应该迅速退化，以反映这种表达模式。用嘌呤霉素和环己酰亚胺在人HT1080细胞中阻止翻译。在一段时间内收集细胞，并用抗BRF1抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。如图所示。，BRF1以<3小时的半衰期迅速降解。BRF1在SDS-PAGE上异常迁移（表观大小为40至47kDa，而理论大小为36kDa），并显示出广泛分布的条带的特征模式，这表明磷酸化状态和可能的其他翻译后修饰。在体外用λ磷酸酶去磷酸化导致所有条带坍塌为一条高迁移率条带（图。). 值得注意的是，迁移速度较慢且可能磷酸化程度较高的BRF1的衰变速度较慢（图。). 大多数蛋白质通过泛素蛋白酶体途径降解。当26S蛋白酶体活性被特异性抑制剂MG132阻断时，即使在没有进行翻译的情况下，原有的BRF1蛋白也稳定下来，认为它确实是通过蛋白酶体降解的（图。，车道4）。
BRF1蛋白是不稳定的。（A） 用嘌呤霉素（Puro；50μg/ml）或50μM环己酰亚胺（CHX）阻断HT1080细胞中的翻译，并在指定时间收获细胞。用抗BRF1抗体检测发现该蛋白迅速衰变。去除印迹，并针对GAPDH进行重制，作为负载控制。slowC细胞（HT1080 BRF1）的裂解液−/−)同时作为BRF1的阴性对照。（B） 用嘌呤霉素阻止翻译，在较早的时间点采集细胞。裂解产物也用λ磷酸酶处理，并与之并行比较。（C） 用嘌呤霉素和蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）处理细胞6小时。在MG132存在下BRF1的稳定性表明其通过蛋白酶体降解。星号表示非特定带。
Ser92和Ser203的磷酸化与BRF1蛋白的稳定性有关。
许多蛋白质的周转率会受到关键部位磷酸化的影响。因此，我们使用OA使BRF1过度磷酸化，同时用嘌呤霉素阻断翻译。即使在用嘌呤霉素阻断6小时后（超过两个半衰期），先前存在的BRF1仍持续存在，这表明它确实通过磷酸化而稳定（图。).
磷酸化BRF1是稳定的。（A） 用嘌呤霉素（Puro；50μg/ml）和OA（400 nM）单独或联合处理HT1080细胞6 h，用抗BRF1抗体探测裂解产物。BRF1在OA诱导的细胞中持续存在，即使翻译被阻断，也表明其通过磷酸化而稳定。注意过度磷酸化形式BRF1迁移特征的向上移动。（B）用针对磷酸化-Ser92和磷酸化-Ser 203的磷酸化特异性抗体探测OA诱导细胞（400 nM，3 h）的裂解物，证实HT1080细胞中这些位点被磷酸化。OA治疗后检测到磷脂酶信号（箭头），并对λ磷酸酶（λPPase）敏感。（C） 用抗BRF1抗体检测B组裂解液。OA处理后BRF1各带向上移动，经λ磷酸酶去磷酸化后恢复为单个高迁移率带。（D） 一系列BRF1磷酸化缺失突变体在慢C细胞中稳定表达。如A组所述，对BRF1进行翻译阻滞和OA诱导的磷酸化。尽管OA诱导过度磷酸化，BRF1AAA蛋白的组成不稳定性表明这些位点对磷酸化依赖性稳定至关重要。与内源性蛋白不同，由于存在His和Xpress标记，转染BRF1在OA治疗后的迁移率略高于非特异性带（与面板A相比）。星号表示非特定带。
由于已经证明Ser92和Ser203的磷酸化具有调节作用，我们很好奇这些位点是否也可能发挥更广泛的生物学作用。slowC细胞，HT1080的衍生物，即BRF1−/−(40)允许在丝氨酸90、92和203处突变的BRF1结构的一组表达，而不会混淆内源性BRF1的信号。为了证实BRF1在这些位点被磷酸化以应对OA，我们测试了针对phospho-Ser92和phosphoy-Ser203的磷酸化特异性抗体，发现了一个预期大小的特异性信号，在用λ磷酸酶治疗后消失，表明OA治疗后HT1080细胞中这些位点确实磷酸化（图。). OA治疗后BRF1的迁移率降低，各带向上移动。在去磷酸化后，这些还原为单个高迁移率带，以近似理论预测的大小迁移（图。). 为了测试各种磷酸化缺失BRF1突变体对蛋白质稳定性的影响，将各个构建物稳定转染到slowC细胞中，并选择表达水平大致相似的克隆进行分析。如图所示。（上图），BRF1wt的行为方式与内源性蛋白质的行为方式相同（图。)并且通过OA诱导的磷酸化而稳定。90位和92位的Ser-to-Ala替代并不影响蛋白质的稳定，而203位的类似替代仅轻微影响蛋白质的稳定性。引人注目的是，在所有三个位点都含有丙氨酸取代的三重突变体无法实现磷酸化依赖性稳定，这表明这两个位点的共同作用是它发挥生物作用所必需的。由于BRF1迁移发生改变，因此在其他位点上仍明显磷酸化，因此似乎是位点90、92和203对磷酸化依赖性蛋白质的稳定至关重要。
BRF1蛋白在PKBα中不稳定−/−细胞。
由于PKB负责这些位点的磷酸化，我们研究了其在稳定BRF1蛋白中的作用。将BRF1wt的Myc-tagged构建物和三重突变体转染到来自PKBα的MEF中+/+或PKBα−/−背景(51). 蛋白合成被嘌呤霉素阻断，BRF1蛋白水平通过免疫印迹法测定（图。). 有趣的是，PKBα中BRF1wt蛋白的稳态水平要高得多+/+与敲除背景中的细胞相比，蛋白质的半衰期也增加了（与1到4道和5到8道相比）。值得注意的是，无论PKBα的存在（通道9至12）还是缺失（通道13至16），突变蛋白都表现出类似的稳定性。此外，与野生型蛋白相比，突变蛋白的水平较低，这表明这些位点缺乏磷酸化对BRF1蛋白的稳定性有不利影响。PKB的转录效应可以排除，因为相同的启动子用于驱动两个BRF1结构的表达。
PKB活性影响BRF1水平。（A） 将Myc-tagged BRF1wt或S90/92/203A突变体（BRF1AAA）转染到PKBα+/+和PKBα−/−MEF公司。在指定的时间段内，通过添加嘌呤霉素（puro；50μg/ml）停止翻译，并通过针对myc标签和GAPDH（负载控制）的Western blotting测定蛋白质水平。对于BRF1wt转染的细胞，显示了两种不同的Western blot暴露。（B） 在翻译停止（嘌呤霉素）或添加蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）后，测定MEF细胞中内源性BRF1的水平。
当我们比较这些细胞中内源性BRF1的水平时，我们观察到较高水平的蛋白质（图。，比较车道1和5）和PKBα中较慢的衰减率+/+比PKB中的单元格−/−单元格（将车道2和3与车道6和7进行比较）。在这两种细胞类型中，添加MG132可以抑制BRF1的降解。这些结果进一步支持了PKBα在丝氨酸92和203处磷酸化BRF1抑制BRF1蛋白酶体降解的结论。
BRF1的定位通过磷酸化而改变。
我们之前的结果确定Ser92磷酸化是BRF1向14-3-3募集的触发因素。ZFP36/Tis11家族其他成员的14-3-3磷酸化依赖性结合也有类似的发现，在TTP的情况下，这对确定其细胞内定位至关重要(21). 从对照和OA处理的细胞中提取不同细胞室的蛋白质组分。Western blotting显示，长期OA治疗后，细胞骨架/不溶性颗粒中越来越多地发现BRF1的重要部分，主要是高度修饰的低迁移率形式（图。，车道12）。针对14-3-3重制印迹，主要在细胞溶质部分检测到，但在膜和细胞骨架/不溶性部分也有很好的表现。也许是因为在参与多种活动的各种细胞内隔室中已经大量存在，在OA治疗后，14-3-3定位没有观察到明显变化。针对各种亚细胞组分的已知标记蛋白重新进行印迹，以确认所进行纯化的完整性。
对照和OA诱导的HT1080细胞中主要亚细胞区室的蛋白质分离。用10进行分馏6细胞，每个组分负载10μg蛋白质。用各自的抗体确定BRF1和14-3-3的定位。对该印迹和相同提取物对已知标记蛋白组蛋白H1（核）、微管蛋白（细胞骨架）和GAPDH（细胞溶质/膜）进行的平行印迹的重配证实了分馏的完整性。星号表示非特定带。
BRF1与14-3-3的磷酸依赖性结合被这些位点的突变所消除。
我们之前表明，Ser92对BRF1与14-3-3的磷酸化依赖性结合很重要(39). Ser92突变为丙氨酸损害了这种联系，但并没有消除这种联系。为了研究Ser203位点单独以及与Ser92结合的作用，我们纯化了带有各种Ser-To-Ala替代的重组His-tagged BRF1。将重组BRF1作为未修饰蛋白或先前在体外用PKBα磷酸化的蛋白添加到慢C细胞S100提取物中。BRF1诱饵与镍柱结合，清洗，并在SDS样品缓冲液中洗脱，以进行SDS-PAGE。洗脱组分对14-3-3的蛋白质印迹显示，BRF1wt和14-3-3之间的相互作用高度依赖于磷酸化（图。，比较车道1和5）。Ser90和Ser92或Ser203（第6和第7车道）的突变未干扰相互作用。然而，所有这些位点的突变都完全消除了BRF1-14-3-3相互作用（通道8），这表明所有这些位点之间需要高度合作，以促进磷酸化依赖性结合。针对BRF1（面板A，底部）重新绘制了该图，确认回收了大致相等数量的BRF1。
BRF1-14-3-3配合物的共沉淀。（A） 将未经PKBα修饰或体外磷酸化的重组His-BRF1（40 ng）添加到40μg慢C细胞S100提取物中。与镍珠结合并洗涤后，在SDS-PAGE上运行洗脱部分，并针对14-3-3和BRF1进行探测（作为沉淀控制）。（B） 利用ARE RNA探针进行体外RNA衰变试验，测试各种重组BRF1蛋白的生物活性(39). 所有蛋白质都能促进探针的快速衰变，表明其具有适当的构象和活性。
引入的突变可能会干扰BRF1的正确折叠，因此可能与14-3-3下拉数据的解释有关。因此，纯化的蛋白质用于体外ARE RNA衰变分析（图。)以评估其生物活性。添加的蛋白质促进ARE RNA探针衰变的能力表明，纯化的重组蛋白是活性的，很可能具有适当的生理构象。
讨论
在我们之前的工作中，我们通过体外ARE特异性衰变分析表明，BRF1活性在Ser92由PKB调节。然而，本文报道的体内实验表明，完整细胞的机制更为复杂，因为不能通过Ser92突变来避免PKB依赖性调节BRF1活性（图。)，要求BRF1上至少存在一个额外的PKB监管站点。这与基于Ser92的机制涉及与14-3-3结合的事实一致，14-3-3通常在两个不同的位置与靶蛋白结合(1,49). 由于Ser203与作为两个14-3-3结合位点之一的TTP Ser178同源，我们将其作为额外磷调节位点的候选位点(21). 尽管TTP Ser178被MK2磷酸化(21,42)，我们没有发现BRF1Ser203在体外被该激酶或p38或ERK1磷酸化的证据。相反，该位点被PKB强烈磷酸化（图。). 结合体内数据，其中磷酸化-Ser203特异性抗体显示具有刺激PKB活性的细胞提取物中的Ser203磷酸化对WM敏感增加（图。)PKB是负责Ser203磷酸化的激酶，这一点有充分的理由。有趣的是，该位点与PKB一致靶序列（BRF1，R-L-Q-H-201S-F系列-203-S-F-A-G；PKB共识，R/K-X-R/K-X-X-S/TP（P）). 相反，Ser92位点对PKB和14-3-3共识结合序列（BRF1、R-D-R-90S-F系列-92S-E-G；14-3-3共识，R/K-X-X-SP（P）-X-P）。然而，在文献中有非经典PKB和14-3-3结合位点的例子（参考文献综述1和15). Ser92和Ser203的磷酸化位点前两个位置存在丝氨酸残基，这提出了一个有趣的可能性，并提出了这样一个问题：这是否会产生与p53蛋白类似的情况。在p53中，Ser376的磷酸化阻止了Ser378的磷酸化，Ser378磷酸化和随后的14-3-3结合需要去除Ser376磷酸化(45). 然而，我们尚未观察到BRF1的Ser90Ala和Ser201Ala突变形式与Ser92Ala、Ser203Ala或这两种突变形式相比有任何生物效应（数据未显示）。
我们测试了Ser92和Ser203突变在BRF1生物学三个不同方面的体内行为，所有这些都受到PKB的调节：（i）ARE mRNA衰变抑制活性的负调节，（ii）蛋白质周转的磷酸化依赖性调节，以及（iii）与14-3-3结合。Ser92Ala突变对体内所有三个过程都是惰性的，而Ser203Ala突变能够轻微损害PKB调节和蛋白质稳定（图。和). 虽然Ser92位点在体内似乎是多余的，但当它与Ser203一起突变时，其作用是高度协同的，导致所研究的所有三个过程都受到严重损害。
令人惊讶的是，蛋白质稳定性应该由最初确定为BRF1 mRNA衰变-增殖活性调控位点的相同位点赋予。这些位点的BRF1蛋白突变在OA处理中仍然被过度磷酸化，如其在SDS-PAGE上的迁移改变所示；然而，由于Ser92和Ser203所起的关键作用，它无法稳定下来（图。). 当蛋白以PKBα表达时−/−和PKBα+/+小鼠胚胎成纤维细胞，观察到稳态BRF1wt水平的显著差异（图。)，在PKBα中具有更大的蛋白质稳定性+/+细胞。内源性BRF1在这些背景下的类似行为进一步支持了这一观察。然而，在突变位点不能被PKB磷酸化的BRF1三重突变体的表达在PKBα野生型和敲除细胞中产生相等的BRF1蛋白水平。这些数据表明，BRF1上PKB磷酸化的基础水平可能在调节降解速率以及BRF1蛋白水平方面发挥作用。
我们提出了一个模型（图。)由此可以解释BRF1的这两个看似无关的方面，即蛋白质周转及其mRNA衰变活性的调节。在默认状态下，BRF1在关键的Ser92和Ser203位点未磷酸化，并在促进其目标ARE转录物的衰变中发挥积极作用。由于BRF1基因表达的昼夜节律性质，蛋白质也经历了快速周转。在接收到稳定信号后，该蛋白在Ser92和Ser203处被磷酸化，与14-3-3结合，并被阻止参与mRNA衰变（这需要BRF1与ARE结合并与衰变机制的成分相互作用），除了防止降解之外（可能通过防止泛素化和靶向蛋白酶体）。这可以通过BRF1-14-3-3复合物的移位或隔离实现，与我们的细胞分馏实验一致，在该实验中，OA刺激细胞中的BRF1被转移到另一个隔间（图。). 由于该组分由细胞骨架和不溶性蛋白质组成，我们无法明确说明磷酸化BRF1是否与细胞骨架或As-yet-unidentified亚细胞隔室（如应激颗粒）相关(22). BRF1-14-3-3共沉淀数据（图。)表明每个位点都能够自身强烈结合14-3-3；然而，Ser92单一突变显著降低体内结合(39)这表明完整细胞中14-3-3结合需要两个位点同时存在。相应地，这两个关键位点的突变似乎完全消除了BRF1-14-3-3的关联，并产生了相应的生物学后果。体内观察到Ser203突变的残余效应（图。和)提出以下可能性：磷酸化-BRF1-14-3-3复合物的形成还可能包括来自辅助调节位点或辅助蛋白的输入，并且两个单一突变引发的可变反应可能反映整个复合物在14-3-3结合程度上的不同敏感性。
BRF1活性和蛋白质稳定性的协调调节模型。在默认状态下，BRF1在Ser92和Ser203处未磷酸化，并积极促进ARE mRNA的衰变，同时由于蛋白酶体降解而快速转换。一个特定的mRNA-稳定信号导致PKB活化，从而使这些位点磷酸化。这会触发磷酸化依赖性BRF1与14-3-3的结合和复合体的移位，而复合体现在无法促进mRNA的衰变，也无法以蛋白酶体为靶点进行降解。一个悬而未决的问题是BRF1上是否存在其他磷调节位点，BRF1富含丝氨酸/苏氨酸，也可能通过14-3-3依赖机制调节其活性。
该模型与Hitti和其他TTP模型的一些特性相同(8,19). TTP通常在极低水平表达，仅在炎症反应期间高表达，其主要靶转录物TNF-α也异常高表达。在这种情况下，似乎很可能合成TTP，但通过磷酸化使其保持静止，以避免通过降解TNF-αmRNA来钝化炎症反应。然而，高水平的TTP是通过稳定蛋白和炎症反应结束后保持的，去磷酸化的TTP可用于积极招募TNF-α转录物进行降解。然而，这不太可能适用于BRF1，因为BRF1在许多细胞和组织类型中高度表达，并且提出了一个问题，即BRF1活性和周转的联合调节有什么生物学原理。一个可能的原因可能是BRF1的昼夜节律表达所施加的限制(34,43). 在mRNA稳定开始时，BRF1蛋白水平的波动不会带来任何困难，因为其活性通过磷酸化直接受到抑制。因此，无论BRF1的实际含量如何，mRNA稳定都可以顺利进行。然而，当BRF1水平处于每日振荡的低点时，稳定信号消散后的稳定反转可能会带来问题。在这种情况下，由于之前的稳定，BRF1靶转录本会积累到较高水平；然而，BRF1不足以降解这一庞大的转录物池并恢复细胞的原始默认状态。如果禁用BRF1活性的同一信号也阻止其周转，从而确保在稳定信号结束时出现足够水平的BRF1，以恢复mRNA的快速衰退，则可以巧妙地解决这个难题。
BRF1或其他转录后调节物（如TTP）的昼夜表达（参见参考文献中的补充数据43)这就提出了一种可能性，即许多表现出这种表达的基因之所以以次要方式这样做，是因为它们受到转录后调控，而不是因为它们的转录是以昼夜节律方式驱动的。由于携带are的转录物远远多于少数已确定的AUBP，因此每个AUBP很可能在转录后调节和协调一组目标转录物，这些转录物可以在转录后操纵子中进行功能分组（参考文献中进行了综述23和36)；在这种情况下，BRF1可能会在其靶转录物上施加昼夜节律的表达模式。一个相关的例子是夜曲素，一种在含有时钟的光感受器细胞层中显示高振幅昼夜节律表达的去烯基酶爪蟾视网膜(三)这被认为是二烯基化了一部分昼夜节律相关转录物。由于转录后调控，一整类转录物的昼夜表达也在拟南芥(27).
考虑到细胞可能必须同时对多种刺激作出反应，有时可能需要相互矛盾的反应，很明显AUBP在多个位点受到调控，因此它可以整合各种信号以产生适当的反应。当再加上参与转录后调控的成分的复杂时空表达，以及大量潜在的靶转录物时，我们面临着一项巨大的任务，即理解所涉及的复杂性。显然，我们才刚刚开始了解AUBP监管。例如，长338 aa的BRF1含有49个丝氨酸和21个苏氨酸残基（在326 aa中，TTP的数量分别为57个丝氨酸以及17个苏氨酸），所有这些都可能被视为潜在的磷调节位点，这提醒了我们面前艰巨的任务。
致谢
我们感谢Brian Hemmings的PKBα野生型和淘汰型MEF。
这项工作得到了Schweizerische Nationalfonds zur Foerderung der wissenschaftlichen Forschung向C.M。
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