核因子κB（NF-κB）是Rel家族蛋白的二聚体，调节免疫和炎症反应、应激修复、细胞生长和凋亡相关基因的转录(2,三,9,15,33,39,47,54). 在其惰性状态下，NF-κB存在于细胞质中，与被称为NFκB抑制剂（IκB）的蛋白质结合。在某些诱导条件下，IκB被磷酸化，导致其泛素化并随后被蛋白酶体降解。IκB的释放和蛋白水解促进NF-κB进入细胞核，在细胞核中该蛋白与κB共有DNA序列结合并调节转录。
细胞中NF-κB的激活是对多种应激条件的反应，包括暴露于促炎细胞因子、紫外线或γ射线照射、细菌或病毒感染或内质网（ER）中蛋白质折叠受损(47). 这些不同的应激信号被识别和信号NF-κB诱导的机制一直是许多研究的重点。在肿瘤坏死因子α（TNF-α）激活NF-κB的例子中，肿瘤坏死因子-α是一种作为先天免疫反应激活剂的细胞因子，TNF-(三,15,39). IκB激酶（IKK）含有两个催化亚单位，IKKα和β，以及一个调节亚单位IKKγ（NEMO），可磷酸化IκB中的Ser残基，从而促进其从NF-κB中释放(32). 发现分泌途径或暴露于内质网应激因子的许多不同蛋白质的表达升高可激活NF-κB(47-49). 这种信号转导途径被称为内质网超负荷反应（EOR），与内质网应激的另一种途径——未折叠蛋白反应（UPR）不同，后者诱导大量参与蛋白质分泌和加工的基因转录，如内质网伴侣GRP78/BiP和GRP94(22,35,47). EOR激活NF-κB的机制，包括IκB参与，目前尚不清楚。
我们一直有兴趣了解磷酸化真核细胞起始因子2（eIF2）α亚基的蛋白激酶家族在应激反应途径早期事件中的作用(12,65). eIF2与GTP和引发剂Met-tRNA偶联我遇见参与起始密码子的核糖体识别(27). 在翻译起始过程中，与eIF2相关的GTP水解为GDP，eIF2从核糖体中释放出来。将eIF2-GDP回收到eIF2-GTP需要一个鸟嘌呤核苷酸交换因子，即eIF2B。PEK（也称为Perk和EIF2AK3）对eIF2α进行磷酸化，以响应ER功能受损，从而将该起始因子从底物转化为eIF2B抑制剂(24,25,42,53,55). eIF2-GTP水平的降低可以减少一般翻译，使细胞有足够的时间在合成额外蛋白质之前纠正内质网应激导致的受损蛋白质折叠。伴随着整体蛋白质合成的减少，PEK对eIF2α的磷酸化可以诱导基因特异性翻译，这对应激补救基因的表达很重要(14,22,23,35). 损失北京(珀克)小鼠胚胎干（ES）细胞暴露于内质网应激导致蛋白质合成异常升高，进一步加剧了该细胞器中的蛋白质错误折叠，从而导致细胞凋亡(24). 损失北京(EIF2AK3型)在人类中会导致沃尔科特·雷利森综合征（WRS），这是一种由胰岛β细胞特征性破坏导致的新生儿胰岛素依赖性糖尿病(11). WRS患者没有表现出1型糖尿病的自身抗体特征，他们还患有骨骺发育不良、骨质疏松、生长迟缓、复发性肝炎和孤立性中央甲状腺功能减退症(6,8,58).北京−/−小鼠表现出许多这些表型，并在出生后几周内出现与高血糖相关的并发症(21,72).
除PEK外，还描述了其他三种哺乳动物eIF2α激酶，每一种都直接感应不同的应激信号，并通过调节翻译激活下游反应途径。这些eIF2α激酶包括GCN2，它被营养应激（包括氨基酸剥夺）激活(23,28,66,69,73); HRI，它将蛋白质合成与红细胞中血红素的可用性联系在一起，并且还被氧化应激和热应激以及暴露于某些可扩散气体时激活(10,20,40,59,71); 和PKR，后者控制干扰素诱导的抗病毒防御途径(34,67). 迄今为止，只有PKR通过独立于其eIF2α激酶活性的机制与NF-κB的激活相联系(1,17,67). 最初，PKR被提议直接磷酸化IκB(36). 最近的研究表明，PKR与IKK复合体有物理联系，并通过IKK和NF-κB诱导激酶（NIK）的作用刺激NF-κ的B转录功能(7,16,18,30,70). NF-κB的PKR依赖性诱导的细节存在争议，因为NFκB活化被报道依赖于或独立于PKR激酶催化活性。此外，PKR调节域的双链RNA（dsRNA）结合特性也被认为对NF-κB的诱导是不必要的(30).
鉴于不同的应激条件激活NF-κB和eIF2α激酶及其重要的医学意义，我们有兴趣在这两种应激途径之间建立可能的调控重叠。在本研究中，我们使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）北京或通用条款2eIF2α磷酸化位点（Ser51Ala）被删除或含有纯合突变，我们证明eIF2的磷酸化是NF-κB在内质网应激或氨基酸饥饿时激活所必需的。eIF2α激酶诱导NF-κB的机制是释放而不是降解IκB。这些结果支持这样一种观点，即PEK缺陷细胞中NF-κB活化受损是其暴露于应激后易发生凋亡的重要潜在原因。
材料和方法
细胞培养和应激条件。
从杂合子杂交产生的胚胎中制备MEF细胞北京−/−(珀克−/−)老鼠(72),通用条款2−/−动物(73)，杂合eIF2αA/A(51)或它们的野生型对应物通过感染表达猴病毒40（SV40）大T抗原的重组逆转录病毒而永生(68). MEF第65页/RelA公司+/+和MEF p65/RelA公司−/−细胞取自Harikrishna Nakshatri（印第安纳大学医学院）(4,45). 细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、10%胎牛血清、100U青霉素/ml和100μg链霉素/ml的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；BioWhittaker）中培养(51)因此，A/A和野生型对应S/S细胞在这些富集培养基条件下保持不变。MEF细胞生长到50%至70%的汇合处，并受到内质网应激，包括在规定的培养时间内，向DMEM中添加浓度为2μM的thapsigargin（除非另有说明）或每毫升2μg衣霉素。合流生长本身就是一种应激，可以诱导eIF2α磷酸化。为了确保少于70%的融合，在ER或营养应激前12小时，将MEF细胞转移到含有0.5%胎牛血清的DMEM中，结果与使用添加10%胎牛血清、在DMEM连续分裂的细胞进行的应激实验相似。为了解决转录或蛋白质合成与内质网应激相结合的作用，向MEF细胞中添加50μg/ml环己酰亚胺或10μg/ml放线菌素D以及2μM thapsigargin，并在收集和分析之前培养细胞3或6小时。在不含亮氨酸的DMEM中培养MEF细胞（BioWhittaker）可导致氨基酸饥饿。作为IκB磷酸化和随后降解的对照，向DMEM中的MEF细胞中添加10 ng/ml的TNF-α，持续30分钟。ER或营养或应激条件下诱导的eIF2α磷酸化在原代MEF细胞和永生化MEF细胞系之间相似。
EMSA。
如前所述，从MEF细胞制备核提取物(31). 该制剂涉及将培养的MEF细胞在1 ml低温低渗RSB缓冲液（10 mM Tris[pH7.4]、10 mM NaCl和3 mM MgCl2)补充有0.5%的NP-40和蛋白酶抑制剂（100μM苯基甲基磺酰氟、0.15μM抑肽酶、1μM亮蛋白肽和1μM蛋白肽抑制素）。细胞用Dounce均质器溶解，在14000×克，将核芯丸重新悬浮在两个填充核体积的萃取缓冲液C中（420 mM KCl，20 mM HEPES[pH7.9]，1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA和20%甘油）补充蛋白酶抑制剂。蛋白质浓度通过使用Bio-Rad蛋白质分析测定。含有NF-κB结合元件的双链DNA片段的序列源自c-myc公司（URE）为5′-GATCCCAAGTCCGGGTTCCCCAACC-3′，对于Octemer-1（OCT-1）结合为5′-GATCGTCGAATGCAAATCACTAGA-3′(31). 在结合反应中，32将P标记的DNA片段（20000至25000 cpm）、5μg核提取物和2.5μg聚（dI-dC）作为非特异性竞争物添加到10 mM HEPES（pH 7.9）、4 mM二硫苏糖醇、0.5%Triton X-100、100 mM KCl和2.5%甘油的溶液中，最终分析体积为25μl。如前所述，在室温下进行30分钟的结合分析，通过凝胶电泳分离DNA-蛋白复合物并通过放射自显影术进行可视化(57). 为了解决NF-κB结合特异性问题，将未标记的竞争对手DNA片段以指定的化学计量比添加到结合混合物中。CREB竞争对手DNA包括一个已发布的ATF共识结合序列，即TGACGTCA(61). 通过在结合混合物中加入p65（Upstate Biotechnology）和/或p50特异性多克隆抗体（Santa Cruz），然后进行电泳迁移率转移分析（EMSA）和放射自显影术，进行超转移研究。
蛋白裂解物的制备和免疫印迹分析。
将MEF细胞置于指示的应激条件下（或无应激条件下），用冰镇磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，并使用50 mM Tris-HCl（pH 7.9）、150 mM NaCl、1%NP-40、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、100 mM NaF、17.5 mMβ-甘油磷酸钠的溶液进行溶解，和添加蛋白酶抑制剂的10%甘油，超声处理30秒。通过离心澄清裂解液，并使用用于洗涤剂裂解的Bio-Read蛋白质定量试剂盒测量蛋白质含量。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离等量的每个蛋白质样品，并转移到硝化纤维过滤器。过滤器在TBS-T溶液（20 mM Tris-HCl[pH7.9]、150 mM NaCl和0.2%吐温20，补充4%脱脂奶）和识别特定蛋白质的抗体中培养。ATF4、p65、IκBα、Iκ）Bβ和Chop抗体购自Santa Cruz Biotechnology。使用David Ron（纽约大学医学院）提供的ATF4多克隆抗体证实了ATF4研究。用多克隆抗体测量eIF2α和IκBα的磷酸化，该抗体识别在Ser-51（研究遗传学）磷酸化的eIF2 a或在Ser-32（细胞信号传导）磷酸化了的IκAα。使用Scot Kimball（宾夕法尼亚州立大学医学院）提供的单克隆抗体测量总eIF2α水平。过滤器在TBS-T中清洗三次，以去除未结合抗体，并与含有与辣根过氧化物酶（Bio-Rad）结合的二级抗体的TBS-T孵育。利用辣根过氧化物酶标记的二级抗体和化学发光底物显示蛋白质-抗体复合物。低范围和高范围多肽标记（Bio-Rad）用于测量免疫印迹中检测到的蛋白质的大小。通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中连续稀释蛋白质，并通过多次放射自显影照射延长时间，建立免疫印迹分析的线性。可视化条带的定量是通过密度计进行的。
免疫荧光和共焦显微镜。
北京+/+MEF细胞在玻璃载玻片上培养过夜，然后用2μM thapsigargin处理6小时或不受压力。或者，北京−/−MEF细胞在150 mm的培养皿中培养至50%至70%的汇合处，5μg PEK表达质粒pKM10(41)使用FUGENE（Roche）与GFP表达质粒共转染。24小时后，将转染的培养物分为八个小室的载玻片，隔夜培养，然后用2μM thapsigargin或无应激处理。用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，并用0.5%Triton X-100渗透10分钟。使用针对该转录因子的多克隆抗体，然后使用与罗丹明红（分子探针公司）偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG），观察p65(31). 使用激光共聚焦显微镜LSM510（卡尔蔡司）进行免疫荧光。使用氩氪激光在568 nm处产生罗丹明红激发带，并使用单色光进行差分干涉对比图像，从而观察二级抗体。用荧光滤光片采集罗丹明红585至610 nm和异硫氰酸荧光素488至520 nm的荧光图像。使用Adobe Photoshop对图像进行数字存储。为了显示细胞核，用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）山地培养基（Jason Lab）对细胞进行复染。
双重荧光素酶分析。
为了测量NF-κB转录活性，北京+/+和北京−/−用NF-κB元件，即一个萤火虫荧光素酶报告质粒，将MEF细胞转染三次，该报告质粒包含来自MHCⅠ类启动子上游的三个κB元素(50). 根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行荧光素素酶分析。使用脂质体转染MEF细胞（Invitrogen Life Technologies）。转染前一天，将MEF细胞以10524孔板上每孔的细胞数。NF-κB导向荧光素酶构建物和雷尼利亚将SV40衍生启动子（Promega）表达的荧光素酶（作为内部对照）转染到MEF细胞。为了确定PEK的瞬时表达是否拯救了NF-κB转录活性北京−/−单元格北京表达质粒pKM10与荧光素酶报告基因共转染。将细胞孵育48 h，并按指示用0至2.0μM thapsigargin处理6 h。然后用PBS洗涤细胞两次，并用900μl 1×被动裂解缓冲液（Promega）收集细胞。将200μl体积的细胞裂解液与100μl荧光素酶分析试剂II混合，以测量萤火虫荧光素酶活性，并添加100μl Stop&Glo试剂（Promega）以测量雷尼利亚荧光素酶活性。对两种荧光素酶活性的光单位进行了10 s的分析。荧光素酶活性作为相对光单位（RLU）进行测量（单光光度计，2010型）。NF-κB启动子结构的荧光素酶活性计算为萤火虫荧光素酶活性与雷尼利亚每个转染的荧光素酶活性。所有数据均表示为NF-κB导向荧光素酶的平均相对荧光素素酶活性除以参考构建物的RLU。然后将荧光素酶活性标准化为为北京+/+未经thapsigargin处理的MEF细胞。进行了三个独立的实验。
结果
PEK对eIF2α的磷酸化是激活NF-κB以响应内质网应激所必需的。
eIF2α的磷酸化是许多不同环境胁迫条件协调响应的早期信号。在内质网应激的情况下，在用thapsigargin治疗的15分钟内，PEK磷酸化MEF细胞中的eIF2α，这是一种标准内质网胁迫剂，可触发该细胞器中钙的释放（图。). 通过免疫印迹分析和Ser-51磷酸化eIF2α的多克隆抗体测定eIF2的磷酸化。相比之下，eIF2α磷酸化的诱导作用在北京−/−MEF细胞。在不同的裂解物制剂之间，通过使用识别eIF2α磷酸化和非磷酸化形式的抗体进行免疫印迹来判断，eIF2总α的水平相似，从而证明eIF2β磷酸化的变化不是由于蛋白质水平的变化引起的（图。). 为了解决eIF2α磷酸化在内质网应激介导的NF-κB诱导中的作用，我们使用EMSA和一个包含NFκB结合位点的放射性标记DNA片段测量了该转录因子的活性，如前所述(31)（图。). 核裂解物由北京+/+和北京−/−用thapsigargin或无应激处理MEF细胞。NF-κB二聚体p65/p50和p50/p50引起的显著DNA结合在北京+/+thapsigargin处理1小时后的细胞，在暴露于该内质网应激3和6小时后观察到进一步增强的结合（图。). 在内质网应激期间未检测到NF-κB结合的诱导北京−/−细胞。作为对照，我们还使用北京+/+和北京−/−核裂解物，我们发现这种转录因子的结合水平差异很小（图。). 值得注意的是，在北京−/−样品中，使用含有OCT1结合位点的放射性标记DNA，有一个额外的快速迁移带，该结合位点在北京+/+裂解物。
eIF2α激酶PEK是激活NF-κB以应对内质网应激所必需的。（A）北京+/+和北京−/−将MEF细胞暴露于thapsigargin 0.25至3小时（如图所示）或在不存在这种ER应激剂的情况下（0小时）。使用Ser-51磷酸化的eIF2α（eIF2 a～P）特异性多克隆抗体，通过免疫印迹分析测定eIF2的磷酸化。通过使用识别磷酸化和非磷酸化翻译起始因子的抗体来检测总eIF2α的水平。（即eIF2α）。核裂解物由北京+/+（2至7车道）和北京−/−（第8至13条通道）MEF细胞经thapsigargin处理指定时间，并与含有NF-κB（B）或OCT1（C）结合位点的放射性标记DNA孵育。结合混合物通过电泳分离，结合DNA通过放射自显影术显示。箭头表示DNA与p65/p50或p50/p50复合，如图所示的实验所定义。.OCT1与DNA和未知蛋白质复合物结合也用箭头表示。面板B和C底部的放射性标记DNA是未结合探针。自由探针（FP）表示放射性标记的NF-κB或OCT1 DNA片段没有核裂解物。
NF-κB DNA结合的特异性首先通过向EMSA反应混合物中添加非放射性标记的竞争对手DNA来确认。我们发现含有NF-κB结合位点（即URE）的过量非放射性标记探针降低了结合，而未观察到与含有CREB结合元件的非放射性标记DNA的竞争（图。). 此外，我们评估了添加针对p50或p65的多克隆抗体后的迁移率变化。p50抗体的加入完全延缓了放射性标记DNA p50/p50的迁移，并减少了部分p65/p50带的迁移（图。，10至13车道）.相比之下，将p65特异性抗体添加到EMSA混合物中会导致指定的p65/p50放射性标记DNA的一部分发生超位移，并且对p50/p50带没有影响。p50和p65抗体共同引起NF-κB两条带的迁移。这些结果表明，在内质网应激条件下诱导这些NF-κB二聚体需要PEK活性。
在内质网应激期间，Ser-51处eIF2α的磷酸化促进NF-κB的活化。从MEF细胞中制备核裂解物，该MEF细胞含有eIF2α和野生型Ser-51（S/S），或在内质网应激或无应激条件下用丙氨酸取代eIF2β磷酸化位点（A/A）。在每个EMSA混合物中使用等量的核裂解物，该混合物包含带有NF-κB结合位点的放射性标记DNA。放射自显影后观察到DNA与NF-κB二聚体p65/p50和p50/p50（箭头所示）复合的情况。（A） 为了确定NF-κB结合位点的特异性，将含有NF-κ）B位点、URE（第2至第4道）或不相关CREB DNA结合位点（第1至第3道）的非放射性标记DNA添加到EMSA结合混合物中，EMSA结合混合液中含有用thapsigargin处理过的S/S MEF细胞制备的核裂解物。竞争表明，非放射性标记的竞争对手DNA以1×、10×或100×摩尔过量添加。自由探针（FP）显示只有放射性标记的NF-κB DNA片段没有核裂解物。面板底部的放射性标记DNA是未结合探针。（B） 将S/S（第2至5道）和A/A（第6至9道）MEF细胞经thapsigargin处理0至6小时后制备核裂解物，并在EMSA中检测NF-κB结合。在通道10至13中，超位移表明，在EMSA结合混合物中添加了特异性识别p50和/或p65的多克隆抗体。“无”表示在测定中未使用抗体（泳道10）。（C） MEF细胞暴露于“+”或“-”所示的thapsigargin（Tg）或tunicamycin（Tunc），持续指定的小时数。分析从S/S和A/A MEF细胞（如图所示）制备的核裂解物与EMSA中的NF-κB探针的结合。
通过使用含有野生型eIF2α（S/S）的MEF细胞或含有取代磷酸化Ser-51残基（a/a）的Ala的突变型MEF细胞，可以直接探讨Ser-51处eIF2 a磷酸化在NF-κB活化中的作用（图。，车道2至9）。虽然在上述类似的时间过程中，暴露于thapsigargin的S/S细胞中出现NF-κB活化，但在a/a细胞中未检测到NFκB结合增加。最后，我们探讨了eIF2α磷酸化在NF-κB激活中的重要性，以响应不同的内质网应激剂-衣霉素，衣霉素抑制该细胞器中的蛋白糖基化并激活PEK(25). 在S／S细胞膜霉素暴露3小时内检测到NF-κB结合增强，ER应激处理6小时后进一步增加（图。). 在A/A MEF细胞中未观察到NF-κB活化。我们得出的结论是，在内质网的不同应激条件下，激活NF-κB需要PEK对eIF2α进行磷酸化。
eIF2α激酶GCN2在氨基酸剥夺期间促进NF-κB的激活。
接下来我们研究eIF2α激酶家族的其他成员是否介导NF-κB的激活。GCN2是氨基酸剥夺期间激活的主要eIF2α激酶，eIF2通用条款2+/+该应力1小时内出现的MEF细胞（图。) (13,23,56,73). 相比之下，eIF2α磷酸化在通用条款2−/−MEF细胞仅在亮氨酸限制6小时后，因此表明一个或多个替代eIF2α激酶可以在长期营养应激期间被激活（图。). 在两种细胞中都观察到内质网应激诱导eIF2α磷酸化通用条款2+/+和通用条款2−/−MEF细胞。使用由通用条款2+/+MEF细胞中，我们发现在3小时的亮氨酸剥夺后，EMSA中的NF-κB结合增强，这种结合在6小时的应激状态后继续升高（图。，车道2至5）。相比之下，只有在亮氨酸饥饿6小时后，NF-κB结合在通用条款2−/−电池（图。，车道6至9）。进一步强调GCN2和PEK对氨基酸饥饿或内质网应激的调节特异性，我们发现NF-κB在通用条款2−/−细胞对内质网应激的反应，NF-κB在北京−/−细胞对亮氨酸耗竭而不是内质网应激的反应（图。). 在含有eIF2α且Ala取代Ser-51（A/A）的MEF细胞中，即使在亮氨酸饥饿6小时后，在氨基酸限制期间也没有NF-κB的激活（图。，15至18车道）。这些结果表明，eIF2α磷酸化是诱导NF-κB响应氨基酸限制和内质网应激所必需的。虽然GCN2是对氨基酸饥饿反应的主要eIF2α激酶，但在长时间的亮氨酸饥饿期间可以诱导一个或多个替代eIF2β激酶，这种eIF2的磷酸化升高导致NF-κB的激活。
在氨基酸条件下NF-κB的激活需要GCN2蛋白激酶磷酸化eIF2α。（A）通用条款2+/+和通用条款2−/−MEF细胞被剥夺亮氨酸1至6小时，并受到thapsigargin 1小时或无应激（0小时），如图所示。使用Ser-51磷酸化的eIF2α特异性抗体（eIF2 a～P）通过免疫印迹分析检测eIF2β的磷酸化，并使用识别eIF2γ磷酸化和非磷酸化版本的抗体测量eIF2总α水平（eIFα）。（B） 核裂解物由通用条款2+/+（2至5车道），通用条款2−/−（车道6至9），S/S（车道11到14)和A/A（车道15到18)MEF细胞在指定的时间内失去亮氨酸，并通过EMSA检测其与含有NF-κB结合位点的放射性标记DNA的结合。（C） EMSA使用制备的核裂解物测量NF-κB结合通用条款2−/−和北京−/−MEF细胞缺乏亮氨酸或暴露于thapsigargin达指定小时数。箭头表示DNA与p65/p50或p50/p50复合。游离探针（FP）表明，在测定中只使用了放射性标记的NF-κB DNA，而图B底部的放射性标记DNA是未结合的探针。
内质网应激诱导NF-κB定位于细胞核并转录激活。
核靶向NF-κB是该转录因子激活机制中的一个重要步骤，以响应广泛的应激条件。为了表征NF-κB在内质网应激反应中的细胞定位，将具有功能性PEK的MEF细胞生长在玻璃片上，并用thapsigargin处理6小时或不受内质网胁迫。使用p65特异的一级抗体和罗丹明红结合的二级抗体通过间接免疫荧光法显示NF-κB北京+/+未经thapsigargin处理的细胞，具有明显的细胞质定位（图。). 在内质网应激期间，NF-κB均匀地存在于细胞核和细胞质中（图。). ATF4和Chop/GADD153的类似特征北京+/+细胞显示，这些转录因子也由内质网应激诱导，主要存在于细胞核中（数据未显示）(23). 为了说明PEK在核靶向中的重要性，我们观察了NF-κB在北京−/−MEF细胞和在这些细胞中瞬时表达eIF2α激酶。通过共转染编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒来描绘PEK表达细胞。在缺乏PEK功能的MEF细胞中，NF-κB在内质网应激反应中没有核定位（图。). 相反，在含有GFP的细胞中，其存在表明PEK表达，NF-κB的核定位（图。). 在没有内质网应激的情况下，NF-κB限制在两种细胞的细胞质中北京−/−细胞或短暂表达PEK的MEF细胞（图。).
eIF2α激酶PEK是内质网应激时NF-κB转位到细胞核所必需的。（A和B）北京+/+用thapsigargin处理在载玻片上生长的MEF细胞6小时（Tg；图A）或无应激（UT；图B）。制备细胞，并使用针对该转录因子的兔多克隆抗体显示NF-κB的p65亚单位，然后使用与罗丹明红结合的山羊抗兔IgG。用激光共聚焦显微镜显示与罗丹红连接的NF-κ的B。细胞核用DAPI山地培养基染色，罗丹明红和DAPI的电子图像合并在右图中。（C到F）北京−/−转染表达PEK（PEK）的质粒和编码GFP的质粒的细胞在玻璃片上生长。转染细胞暴露于thapsigargin（D和E）或未经处理（C）。用罗丹明红结合的二级抗体、DAPI染色的核DNA和异硫氰酸荧光素结合的GFP显示NF-κB。如图所示，将所有三个面板合并。北京−/−通过与GFP共表达鉴定瞬时表达PEK的细胞。这个北京−/−D组MEF细胞不表达PEK或GFP，并在内质网应激期间作为NF-κB转位到细胞核的eIF2α激酶依赖性的对照。
核定位有助于在启动子中包含NF-κB结合元件的基因的转录调控。我们将含有多个上游NF-κB结合位点的NF-κB导向的萤光素酶报告基因引入北京+/+或北京−/−MEF细胞。将这些瞬时转染的细胞暴露于0至2μM浓度范围内的thapsigargin中6 h。当thapsigargin浓度为0.5μM时，细胞中荧光素酶活性增加了两倍北京+/+细胞与非应力对应物（图。). 当暴露于较高浓度的1μM至2μM的thapsigargin时，荧光素酶的表达分别增加了3.5至10倍北京+/+细胞。相比之下，荧光素酶活性在北京−/−暴露于这些不同浓度的thapsigargin的细胞。作为对照，我们还使用质粒pcDNA3中的CMV启动子将编码野生型PEK的cDNA转染到北京−/−细胞暴露于2μM thapsigargin，我们发现荧光素酶活性在内质网应激反应中增加了近10倍（图。). 总之，这些结果与PEK的eIF2α磷酸化促进内质网应激期间NF-κB的核定位，从而导致其靶基因的转录激活这一观点一致。
eIF2α激酶PEK是内质网应激反应中NF-κB转录活性所必需的。NF-κB萤火虫荧光素酶报告基因与雷尼利亚荧光素酶控制质粒导入北京+/+（黑色条）或北京−/−（白色条）MEF单元。MEF细胞用0～2μM的thapsigargin处理6 h，并按照材料和方法进行双重荧光素酶分析。为了解决PEK在北京−/−MEF细胞恢复了NF-κB转录活性，我们共同转染了北京表达含荧光素酶基因的质粒，并将这些细胞接种于2μM的thapsigargin（灰条）。相对NF-κB-荧光素酶活性显示在直方图中，该直方图针对北京+/+未经thapsigargin处理的细胞。
内质网应激通过涉及IκB释放而非降解的机制激活NF-κB。
促进NF-κB核定位的一种机制涉及IκB的磷酸化和蛋白水解。我们希望测量S/S和A/A MEF细胞对内质网应激反应中的IκB磷酸化和蛋白质水平。作为对照，我们还分析了这些MEF细胞对TNF-α治疗的反应，TNF-γ是一种细胞因子，可以诱导IκB在Ser残基32和36处的磷酸化，从而导致IκB-泛素介导的蛋白水解。在thapsigargin暴露的15分钟内，eIF2α磷酸化诱导持续了6小时（图。). 暴露于TNF-α30分钟后，未检测到eIF2α磷酸化（图。第7和14车道）。正如预期的那样，在A/A细胞中未检测到eIF2α磷酸化。为了确定内质网应激是否促进IκBα的磷酸化，我们在免疫印迹分析中使用了一种针对Ser-32磷酸化的抑制蛋白的多克隆抗体。TNF-α诱导S/S和A/A细胞中IκBα的磷酸化（图。); 然而，在内质网应激的6小时过程中，两种MEF细胞系均未检测到磷酸化。
内质网应激反应中NF-κB的激活涉及IκB释放而非蛋白水解。用thapsigargin处理S/S（1至7道）和A/A（8至14道）MEF细胞6小时，用TNF-α处理30分钟，或在无应激（0小时）的情况下处理。通过SDS-PAGE分离等量的全细胞裂解物；用特异性抗体免疫印迹法测定磷酸化eIF2α（A）、总eIF2β（B）、在Ser-32（C）磷酸化的IκBα、IκBβ（D）和p65（E）的总水平。免疫沉淀IκBα，免疫印迹分析检测免疫复合物中p65（F）或IκBα（G）的水平。如图F所示，免疫复合物中的IgG在SDS-PAGE中的p65附近迁移。每张图都来自一次免疫印迹实验，图中显示7和8道之间的虚线仅用于对齐。
IκB的α和β亚型水平通过使用这些蛋白的特异性多克隆抗体进行测量。与TNF-α介导的IκB磷酸化一致，用该细胞因子治疗后，S/S和a/a MEF细胞中的Iκ）Bα和β均减少（图。车道7和14）。在分析的时间点，与S/S细胞相比，TNF-α诱导a/a MEF细胞中IκBα和β水平的降低更大。相比之下，这些MEF细胞中的IκB亚型水平并没有明显降低，即使在治疗6小时后（图。). 为了进一步研究NF-kB活性的增加是否与蛋白酶体降解IκB有关，将MG132-蛋白酶体抑制剂与TNF-α或thapsigargin一起添加到MEF细胞中。虽然蛋白酶体的抑制显著降低了NF-κB的TNF-α激活，但对内质网应激诱导的NF-kb活性没有不利影响（图。). 我们得出结论，PEK介导的NF-κB激活是通过一种机制发生的，该机制不涉及IκBα和β的降解。进一步强调eIF2α激酶和TNF-α途径之间的分离是我们的观察结果，eIF2β激酶（如PEK）的缺失对使用该细胞因子治疗MEF细胞时NF-κB的激活没有不利影响（数据未显示）。
蛋白质降解减少会削弱TNF-α对NF-κB的诱导作用，但在内质网应激期间不会降低NF-κ的活性。北京+/+和北京−/−用thapsigargin（Tg）、TNF-α和MG132处理MEF细胞，如“+”或“−”符号所示，处理时间为指定的小时数，或不受任何应激（0小时）。用EMSA分析从MEF细胞制备的等量核裂解物与NF-κB探针的结合。与p65/p50或p50/p50复合的DNA用箭头表示。
与IκB的分离对于NF-κB定位于细胞核及其靶基因的转录调控至关重要。为了确定IκB的释放是否对NF-κB在内质网应激反应中的活化至关重要，我们从用thapsigargin处理的S/S和A/A MEF细胞制备的裂解液中免疫沉淀了IκBα。免疫复合物中的蛋白质接受SDS-PAGE并通过免疫印迹进行分析。在从thapsigargin处理的裂解物中衍生的每个免疫复合物中测量到类似的IκBα水平（图。). 相反，通过p65多克隆抗体测量的共沉淀NF-κB水平在S/S细胞中降低，以应对内质网应激（图。). thapsigargin治疗30分钟后，与IκBα相关的p65显著降低，在内质网应激1至3小时后进一步降低。相反，在A/A细胞中，p65与IκBα一致相关，而与thapsigargin处理无关。TNF-α暴露后，S/S和a/a细胞中p65与IκBα的共沉淀减少。每个样本中总细胞裂解液中p65的水平是一致的，这表明在内质网应激诱导后，NF-κB与IκB细胞的关联性减少并不是由于内质网中p65含量的减少所致北京+/+MEF细胞（图。).
eIF2α的磷酸化需要激活NF-κB，以响应一般转录或翻译的抑制。
在旨在解决蛋白质和mRNA合成在应激反应中的作用的实验过程中，我们发现用放线菌酮或放线菌素D处理可诱导eIF2α磷酸化（图。). 暴露3小时后，环己酰亚胺在MEF细胞中诱导了高水平的eIF2α磷酸化。相比之下，用放线菌素D处理MEF细胞，暴露3h后，eIF2α磷酸化水平适中，6h后显著升高。). 在每种裂解液中发现的eIF2α总量相似。
NF-κB对放线菌酮或放线菌素D暴露的反应需要eIF2α磷酸化。（A） 将S/S MEF细胞暴露于所指示的thapsigargin（Tg）、放线菌素D（AD）或放线菌酮（CHX）达所指示的小时数，或不暴露于应激剂（0小时）。使用Ser-51磷酸化的eIF2α特异性多克隆抗体（eIF2 a～P）通过免疫印迹分析测定eIF2的磷酸化。通过使用识别磷酸化和非磷酸化翻译起始因子（eIF2α）的抗体来检测总eIF2的水平。S/S和A/A MEF细胞暴露于由“+”或“−”表示的thapsigargin、环己酰亚胺（B）或放线菌素D（C），持续指定的小时数。如图所示，分析从S/S和A/A MEF细胞制备的核裂解物与EMSA中的NF-κB探针的结合。箭头表示DNA与塔西菌素应激制剂中的p65/p50或p50/p50复合，或与放线菌素D应激细胞中的p65/p65复合，如面板D所示。在面板D中，S/S MEF细胞用放线菌肽D处理6小时，并分析与NF-κB DNA的结合。在通道1至通道4中，超位移表示将特异性识别p50和/或p65的抗体添加到EMSA结合混合物中。“无”表示未向测定中添加抗体。在通道5至7中，竞争（Comp）表明非放射性标记NF-κB URE竞争物DNA以10×或100×摩尔过量添加或未添加（无）。在通道8中，使用放线菌素D对A/A MEF细胞进行类似分析。
鉴于环己酰亚胺处理抑制蛋白质合成也可诱导NF-κB(52)，我们询问对这种化学抑制剂的eIF2α磷酸化反应是否与ER和营养应激中观察到的NF-κB活化有关。在S/S MEF细胞暴露于环己酰亚胺3 h后，通过EMSA中增强的结合来测量NF-κB的显著激活，该结合在治疗6 h后进一步增加（图。，车道5和6）。与内质网应激条件不同，环己酰亚胺诱导NF-κB只涉及检测高分子量放射性标记带。将thapsigargin和放线菌酮联合添加到S/S MEF细胞中也仅在与单独观察到的放线菌胺类似的水平上诱导了较大的谱带（图。，第9和第10车道）。在涉及A/A的类似实验中，NF-κB结合显著减少，这表明需要eIF2α磷酸化才能对放线菌酮产生反应，使NFκB充分活化（图。).
暴露于放线菌素D 3 h的S/S MEF细胞中NF-κB结合也增强，治疗6 h后进一步增加（图。，第6和第7车道）。正如环己酰亚胺所述，放线菌素D对NF-κB的诱导仅涉及高分子量版本。同时添加放线菌素D和thapsigargin导致NF-κB的诱导作用更强（图。，第9和第10车道）。相比之下，用放线菌素D或放线菌素D和他司加金相结合处理的A/A细胞中NF-κB的活化显著降低（图。第7、8、11和12车道）。
为了解决NF-κB亚单位的组成问题，我们将p50特异性多克隆抗体添加到EMSA混合物中，发现该条带的迁移没有变化（图。). 相比之下，添加识别p65的抗体导致放射性带完全超移位，因此表明这种NF-κB代表可能的p65同聚体。添加非放射性标记的URE DNA有效地竞争NF-κB的结合。总之，这些结果表明，抑制一般翻译或转录可以通过需要eIF2α磷酸化的机制诱导NF-κB。放线菌素D或放线菌酮诱导eIF2α磷酸化不仅发生在MEF细胞中，也发生在其他细胞类型中，包括NIH 3T3和人类胚胎肾293细胞（数据未显示）。eIF2α磷酸化的增加并不依赖于PEK或GCN2，因为北京−/−和通用条款2−/−MEF细胞对环己酰亚胺处理的反应（数据未显示）。此外，根据eIF2激酶伴随自身磷酸化的迁移移位判断，PEK的激活(25,41)，不会对这种蛋白质合成抑制剂产生反应。因此，替代eIF2α激酶可能被激活以响应环己酰亚胺暴露，或者eIF2β磷酸酶活性可能降低。
p65对eIF2α激酶依赖性表达自动变速箱4和印章.
eIF2α激酶诱导包括bZIP转录因子ATF4和Chop在内的基因表达级联反应以应对不同的应激条件(22,23,35). 鉴于eIF2α磷酸化也促进NF-κB的激活，我们询问p65功能是否是诱导eIF2β激酶应激途径所必需的。eIF2α的诱导磷酸化是对thapsigargin处理MEF细胞的反应，因此有助于提高自动变速箱4和印章（图。). p65功能的缺失并不影响eIF2α磷酸化的诱导，尽管在非应激p65中eIF2β磷酸化−/−细胞比野生型细胞略高。ER应力诱导自动变速箱4和印章两个p65都有表达+/+和p65−/−细胞。thapsigargin暴露3小时后，诱导自动变速箱4和印章p65的表达稍低−/−细胞与p65的比较+/+当内质网应激6小时时，这些转录因子的水平相当（图。). 这些结果表明，eIF2α激酶应激反应可以独立于p65功能发生。
p65功能对于内质网应激反应中eIF2α激酶途径基因的表达增加是必不可少的。第65页(RelA公司)+/+（泳道1至3）和p65−/−（4至6道）MEF细胞暴露于thapsigargin（Tg）3或6小时，或不受应激（0小时）。用SDS-PAGE分离等量的全细胞裂解物，并用针对所示蛋白的抗体通过免疫印迹法测量p65、磷酸化eIF2α、总eIF2β、ATF4和Chop的水平。
讨论
eIF2α磷酸化介导NF-κB对不同应激条件的诱导。
NF-κB是应激反应途径的中心调节器，用于协调其产物有助于缓解潜在应激条件的基因的转录。在这项研究中，我们表明eIF2α的磷酸化是监测各种生理应激并将其传递给NF-κB激活的过程的基础。例如，为了响应ER中受损的蛋白质折叠和组装，PEK对eIF2α的磷酸化对于NF-κB活性的诱导至关重要（图。,,，以及). 内质网应激期间NF-κB激活的机制包括IκB的释放，但不包括该抑制蛋白的降解（图。和). 在氨基酸饥饿期间，GCN2蛋白激酶对eIF2α的磷酸化表示NF-κB的激活（图。). 此外，环己酰亚胺和放线菌素D分别抑制一般翻译或转录，从而引发NF-κB诱导所需的eIF2α磷酸化（图。). 总之，这些研究表明，eIF2α激酶识别并被一系列对转录、蛋白质合成和组装有影响的应激条件激活，由此产生的eIF2α磷酸化是NF-κB激活的核心。eIF2α磷酸化和NF-κB活化之间的这种联系也为eIF2β激酶缺乏在WRS等疾病中导致细胞凋亡提供了重要的解释。在大多数细胞类型中，NF-κB激活具有抗凋亡功能的基因，包括IAP家族、TRAF1和TRAF2，以及Bcl-2同源物Bfl-1/A1和Bcl-XL（左）(2,4,19,26,38,60,62-64,75). 在应激条件下，eIF2α磷酸化和定向NF-κB介导的转录的缺失，例如导致内质网蛋白错误折叠增加的情况，将显著增加程序性细胞死亡。
eIF2α磷酸化在NF-κB功能调节中的作用。
NF-κB的转录活性是通过DNA结合和转录激活来调节的。IκB家族成员的锚蛋白重复域与NF-kB的Rel同源域相关，从而掩盖了NF-κB核定位信号和DNA结合域。某些应激可以激活IKK复合物，促进IκBα、Ser-32和-36以及IκBβ、Ser-19和Ser-23中两个残基的磷酸化，从而触发26S蛋白酶体的泛素化和IκB降解(32). 在内质网应激激活NF-κB的例子中，我们没有发现IκBα的Ser-32磷酸化，也没有观察到IκBα或IκB-β水平的任何明显降低（图。). 然而，内质网应激确实发出了NF-κB释放IκB的信号，从而导致NFκB移位到细胞核并增强转录激活（图。到). 我们尚不清楚eIF2α磷酸化如何促进IκB的释放。先前的研究已经观察到，IκBα的酪氨酸磷酸化可以发生在缺氧细胞的复氧或暴露于酪氨酸磷酸酶抑制剂过碘酸盐的细胞中，诱导NF-κB的分离，而不会导致IκBα的蛋白水解降解(29). 酪氨酸磷酸化促进IκB从NF-κB中清除的机制尚不清楚，但可能涉及通过修饰的IκB与磷脂酰肌醇3-激酶的调节亚基（p85α）的相互作用来隔离(5). 增强NF-κB活性的另一种机制涉及p65羧基末端多个残基的直接磷酸化(15,32,39). p65的这种磷酸化通过调节NF-κB与转录调节物（如CREB-结合蛋白（BCP）/p300或组蛋白脱乙酰酶HDAC-1）的关联，增强其反式激活潜能。
eIF2α的磷酸化对一般mRNA和蛋白质合成的抑制反应介导NF-kB活化。
我们发现，激活NF-κB需要eIF2α磷酸化来响应放线菌素D和放线菌酮对转录或翻译的普遍抑制（图。). 鉴于所观察到的诱导NF-κB活性的应激条件范围很广，我们可以推测，直接或间接降低基因表达的应激因子通过诱导eIF2α激酶或阻断eIF2β磷酸酶来调节NFκB的功能。有趣的是，在内质网应激期间，eIF2α磷酸化增强了p65/p50和p50/p50二聚体与DNA的结合（图。和)，在放线菌酮或放线菌素D处理期间，eIF2α磷酸化升高仅增强了p65同型二聚体的活性（图。). NF-κB二聚体诱导的这种差异表明，eIF2α磷酸化可以与其他应激因子协同作用，以编程NF-κ的B活性。这些额外的应激因子可能由独立于eIF2α磷酸化的替代应激途径控制。组合相互作用将提供不同的基因表达模式，因为p65同型二聚体被认为与p65/p50二聚体相比，对κB相关位点具有不同的结合特性(37,47).
eIF2α激酶和NF-κB在应激诱导凋亡调节中的作用。
WRS患者有与许多分泌组织相关的特征性疾病。受影响的细胞类型包括导致糖尿病早期发作的胰岛β细胞、导致骨骺发育不良的成骨细胞、导致消化系统疾病的胰腺腺泡细胞和促进甲状腺功能减退的甲状腺细胞(6,8,58). 人们认为，出生后发生的正常发育过程会导致细胞内质网应激，这种应激在具有广泛分泌细胞器的组织中被放大。许多这些病理学也在北京(珀克)−/−老鼠(21,72). 内质网应激激活内质网受体促凋亡半胱氨酸蛋白酶caspase 12的加工(44). 治疗北京(珀克)−/−与野生型细胞相比，含有内质网应激因子（例如，衣霉素或毒霉素）的ES细胞有助于积累更高水平的活化caspase 12并增加程序性细胞死亡(24). PEK的缺失如何增加这种半胱天冬酶的激活和凋亡尚不清楚。事实上，Chop是内质网应激期间由eIF2α磷酸化诱导的最有文献记载的转录因子之一，具有强大的促凋亡功能(43,46,74).
关于PEK活性的丧失如何促进细胞凋亡的一个解释集中在以下观点上：北京−/−与野生型细胞相比，细胞不能磷酸化eIF2α，因此导致翻译起始水平持续较高。内质网应激期间分泌蛋白的持续合成会加剧内质网中的蛋白质组装负荷，并阻碍细胞修复蛋白质错误折叠的能力。有趣的是，据报道，环己酰亚胺与内质网应激联合治疗可引起细胞凋亡的部分抑制北京−/−ES细胞(24). 这一观察结果表明，蛋白质合成减少是内质网应激的必然反应。我们的结果表明，NF-κB活性的缺失及其在许多细胞类型中的强大抗凋亡功能，也是许多eIF2α激酶缺乏细胞中程序性细胞死亡加剧的重要原因。
奇怪的是，eIF2α激酶PKR被认为作为抗病毒防御途径的一部分促进细胞凋亡(1,17,67). 另一个区别是PKR被认为与IKK有物理联系，并增强IκB磷酸化和泛素介导的降解(7,16,18,30,70). PKR激活NF-κB的机制被认为与eIF2α磷酸化无关。PKR和PEK的表观促凋亡和抗凋亡功能之间的差异可能反映了它们不同的生理应激环境以及与这两种eIF2α激酶协同工作的相关应激因子。这些差异也可能解释PKR和PEK调节NF-κB的不同机制。
