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BMC生物技术。2003; 3: 6.
2003年6月11日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1472-6750-3-6
预防性维修识别码：项目经理165584
PMID：12801425

寡核苷酸探针在三维DNA微阵列表面的可及性及杂交时间对表达率准确性的影响

大卫·R·多利斯,1,2 Allen Nguyen（艾伦·阮）,1,三 林恩·吉瑟,1 兰德尔·洛克纳,1,4 安娜·卢布林斯基,1 马库斯·帕特森,1 爱德华·图马,1,4 蒂莫西·森德拉,1,4 罗伯特·埃尔加纳,1,5和Abhijit Mazumder公司通讯作者1,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

DNA微阵列现在被常规用于同时监测数千个基因的转录水平。然而，阵列制造方法、杂交条件和寡核苷酸探针长度会影响DNA微阵列平台的性能。

结果

我们通过显示与微阵列三维矩阵相连的探针中的错配效应与基于溶液的热力学双相熔融研究之间的强烈相关性，展示了探针与靶相互作用的溶液相杂交行为。与微阵列相连的探针中的错配效应也表明，大多数（如果不是全部）寡核苷酸可用于杂交。还研究了动力学参数。正如预期的那样，杂交信号以转录物浓度依赖的方式增加，错配特异性随杂交时间增加。出乎意料的是，杂交时间通过缓解表达比率中观察到的压缩，提高了折叠变化的准确性，而对于较大的折叠变化，这种效果可能更为显著。

结论

综上所述，这些研究表明，三维表面可以使用更短的寡核苷酸探针，杂交时间可能对提高微阵列数据的准确性至关重要。

背景

DNA微阵列已成为同时监测数千个基因转录水平的有力工具[1,2]. 这种平行分析允许肿瘤预后和分类[三,4]，药物靶点验证[5]，毒理学评估[6,7]和功能发现[8,9].

微阵列的制造方法可以在DNA微阵列平台的性能中发挥关键作用。例如，寡脱氧核糖核苷酸探针可以共价连接到表面[10]，合成就地[11-13]或通过与带正电荷表面的静电相互作用而保留[14]. 最近的一项研究检查了沿就地合成的60 mer寡脱氧核苷酸表明，在寡脱脱氧核苷酸的3'（表面）端的前10到15个碱基没有错配效应，这表明这些碱基在杂交反应中可能无法获得[12]. 当寡脱氧核糖核苷酸被吸附到带正电荷的表面时，可能存在其他问题。已发现寡核苷酸探针在带正电的表面上形成具有非螺旋性质的双工体[14]. 这些双工结构高度不对称且未缠绕，可能会在基极堆叠中造成重大损失，从而影响双工结构的能量学。这种非经典结构可能不限于寡核苷酸阵列。将扩增的cDNA斑点到玻璃上是另一种常用于制作阵列的方法[15]. 有趣的是，已经发现这种阵列的表面形成了多品牌DNA结构[16]. 此外，分配板中的低浓度扩增cDNA可以压缩表达率，这突出了该参数的重要性[15]. 虽然PCR制备不是寡核苷酸阵列制作的一个因素，但也存在类似的问题，即表面探针密度。探针密度可能导致空间效应[17]并可能影响双重形成的效率和目标捕获动力学[18].

微阵列杂交条件也会影响DNA微阵列平台的性能。DNA微阵列杂交的早期研究发现，杂交强烈依赖于表面非探针覆盖区域DNA吸附/解吸的速率常数、二维扩散系数、，以及探针和靶的大小，还表明稀疏的探针覆盖可能提供与DNA探针完全覆盖的表面相同或更好的结果[19]. DNA杂交动力学的理论分析表明，扩散在确定达到平衡所需的时间方面很重要，并且与平衡结合常数和结合位点的浓度成正比[20]. 最近对双色体系中竞争性杂交的理论和实验分析表明，两种探针的杂交动力学必须相同[21]. 最近发表了一项关于利用杂交动力学区分特异性结合和非特异性结合的优雅研究[22]. 本研究发现，标记cRNA与表面结合寡核苷酸的特异性和非特异性结合的杂交动力学显著不同，特异性结合比非特异性绑定需要更长的时间才能达到杂交平衡。利用这一特性来估计和校正非特异性结合所贡献的杂交水平，从而能够选择最佳的寡脱氧核苷酸，并减少外显子鉴定中的假阳性。最后，之前的研究表明，较长的杂交时间会略微增加相对荧光，可能会增加对罕见转录物的检测[23].

最后，寡脱氧核糖核苷酸的长度可以影响DNA微阵列平台的性能。早期对高密度阵列的研究表明使用25聚体就地合成的寡脱氧核苷酸[1]. 最近一项使用共价连接的寡核苷酸的研究发现，30和35 mer寡核苷酸产生的信号比25 mer高2到5倍，从60 mer获得的信号仅比30 mer高两倍，但比从25 mer得到的信号高10倍[24]. 事实上，就地与其他长度和杂交条件相比，合成的60 mer寡脱氧核苷酸在30–32%的甲酰胺中杂交，显示出在最大灵敏度和特异性之间的折衷[12]. 最后，一项研究采用了就地通过无掩模光刻合成表明，信号强度随着寡核苷酸长度的增加而增加，最长可达50 mers，随后在该长度以上出现一个平台[13].

除了对灵敏度和特异性等性能参数的影响外，制作方法也会影响微阵列平台的准确性。最近对Affymetrix平台进行了复杂的分析[25]. 作者使用相对误差计算来描述平台准确性对每个转录本探针对数量的依赖性。此外，收集了数据，但没有提供，将相对误差的增加视为折叠变化（表达比率）的函数。这些问题在所有微阵列平台中都很重要，并影响寡核苷酸设计和微阵列数据解释。

因此，很明显，许多因素会影响微阵列系统的性能，并且在收集大量微阵列数据之前应该评估这些因素。特异性和非特异性结合的杂交动力学不同[22]提出了以下问题：什么是最佳杂交时间？杂交时间会影响微阵列数据的准确性吗？此外，为了在为微阵列设计寡核苷酸探针时利用大量的溶液相杂交数据，以及在优化杂交条件时，附着在微阵列表面或基质上的探针必须显示溶液相杂交特性。在本报告中，我们展示了三维微阵列表面上的溶液相杂交行为[10]并证明杂交条件，特别是杂交所允许的时间，会影响fold-change计算的准确性。

结果

CodeLink平台上的特异性先前被证明，当30聚体寡核苷酸探针中间存在3个碱基错配时，初始信号的保留率小于5%[10]. 我们利用这些信息来测试DNA：RNA双链的形成是否受到探针附着到DNA微阵列表面的影响，并确定探针中有多少可以用于杂交。在30 mer探针长度上设计了一系列2碱基和3碱基错配，以评估其用于杂交的可用性。将从肾脏分离的总RNA制备的标记cRNA与DNA微阵列杂交，该微阵列由一系列2碱基和3碱基错配组成，长度为30个包含错配的探针（图。​（图1）。1). 这些错配的轮廓表明，探针3'（溶液）或5'（表面）端附近的错配几乎同等地影响杂交信号，表明表面在杂交中不产生空间位阻效应。例如，M62388型显示了一个对称的轮廓，在寡核苷酸中间的错配影响最大（图​（图1A）。1安培).M86443型在3'（溶液）端显示了大约八个碱基，只显示了不匹配的小影响（图​（图1B）。1B年). 这种影响的缺乏可能是由于这些位置的失配没有显著破坏双面打印的稳定性，或者是由于表面的影响。后一种可能性不大可能出现，但将在稍后解决。最后，NM013226在5'（表面）端显示出约3个碱基，这对信号强度没有显著影响（图​（图1C）。1摄氏度). 这种影响的缺乏可能是由于图中列出的相同原因造成的​图1B：。1B年共有10个基因以这种方式设计和测试。其中三个如图所示​图1，1，其他七个基因显示出与图中所示相似的模式​图11因此，为了简洁起见，没有显示。

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微阵列杂交与溶液相熔化温度的比较。将含有2碱基（钻石）或3碱基（正方形）错配的DNA微阵列杂交到从肾脏分离的总RNA制备的复杂靶点。三个探针的每个失配的强度，表示为完美匹配信号的百分比，（a）M62388型，（B）M86443型，和（C）NM013226，如图所示。为了在（a）和（B）中的严格清洗缓冲液中进行测量，绘制了DNA寡核苷酸与互补RNA寡核苷酸（三角形）的3-碱基错配的熔化温度变化图。底座从5'端开始编号。寡核苷酸探针的表面（5'）和溶液（3'）端用箭头表示。

为了表明这些杂交结果与溶液相杂交相似，使用标准温度控制分光光度计在溶液中进行了熔融曲线测量。T型钢米在杂交缓冲液和严格清洗缓冲液中测量了30 mer探针的完全匹配和6个失配扫描。值得注意的是，T的差异米测量值（ΔT米)溶液中完美匹配和不匹配之间的模式与阵列上杂交信号的减少相同（图。​（图1）。1). 数组中的强相关性和图中的解决方案数据​图1B1B年证明寡脱氧核糖核苷酸3′端的错配并没有显著破坏双链的稳定性，这解释了与完美匹配相比，这些错配的信号强度没有降低。此外，ΔT的模式米杂交缓冲液（数据未显示）和严格清洗缓冲液中测量值的计算结果几乎相同，表明杂交和严格清洗条件都产生了等效的严格性。由于寡核苷酸合成的费用，共有两个基因（均如图所示​图1）1)检测微阵列和熔化温度数据的一致性。然而，第一个基因的所有六个数据点和第二个基因的全部六个数据点都显示了这两个测量值之间的良好一致性。我们得出的结论是，三维表面能够实现溶液相型杂交行为，并且大多数（如果不是全部）寡脱氧核苷酸探针可以与溶液中的目标进行杂交。

微阵列表面上的溶液相型杂交行为表明，该表面上的探针应表现出典型的杂交动力学，其中反应速率取决于二级速率常数、靶浓度和探针浓度[19,20]. 换句话说，目标浓度的增加应产生信号强度的成比例增加。因此，我们准备了一系列稀释液，其中四个对照转录物被加入总RNA样本中。在随后的样品中，将该加标总RNA的两倍连续稀释为新鲜总RNA，生成了一个稀释系列，由每种转录物的十个浓度组成，最终范围为1:100000至1:51200000（10微米至20纳米）。我们从每个样本中制备标记的cRNA靶点，并将其与Codelink微阵列杂交。这些微阵列包含三个细菌探针，设计用于与四个加标转录本中的每一个进行杂交，共获得十二个信号（图中显示了六个信号​图2A2安培和图中所示的六个​图2B）2B型)在每次连续稀释时测量。测量中的任何错误都将包括微阵列平台的所有方面。我们将信号强度绘制为寡核苷酸探针在阵列上的峰值转录浓度的函数，该阵列与这些对照转录物互补。我们发现信号强度在转录物浓度为20 nM到10 microM之间呈线性响应，约为三个对数（图​（图2A2安培和​和2B）。2B型). 此信号线性度与Codelink平台上先前发布的报告一致[10]. 平均R2数值为0.998±0.001。所有十二个探针（100%）都证明了这种行为，这表明这种观察是普遍的。然而，我们无法确定用于测量内源性人类转录物的探针的哪一部分显示出这种行为，因为不可能以受控的定量方式改变每个转录物的目标浓度。总之，这些数据证实了阵列信号确实如预期的那样依赖于转录物浓度。他们还证明了整个微阵列过程（靶制备、标记、杂交和检测）的准确性和低可变性。

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CodeLink DNA微阵列的标准曲线。绘制多个探针的2倍系列稀释系列（1:100000至1:51200000=10μM至19.53 nM）的信号(A类)阿拉伯的和entF（entF）、和(B类)修复A和gnd（接地）.

不匹配双工器通常比完全匹配的双工器表现出更大的分离率[27]. 因此，我们研究了在两个不同的探针序列中，作为杂交时间函数的一个、两个和三个碱基错配的影响。通过将相同的cRNA样本杂交到不同的阵列，每个阵列杂交不同的时间，并检查内源性转录物的杂交强度，来执行杂交时间过程。图中的数据​图3三证明当杂交时间等于或大于16小时时，一个和两个碱基失配的影响最大。例如，在探测序列中X69550型（图​（图3A），第3页)单碱基错配的杂交信号在4小时后是完全匹配的72%，而在16小时后仅为完全匹配的39%。同样，四小时后，双碱基错配的杂交信号为完全匹配的杂交信号的35%，但十六小时后仅为完全匹配杂交信号的14%。对于三基失配的影响，得出了相同的结果（数据未显示）。与之前的调查结果一致[10]发现单基错配的影响是可变的，将杂交信号降低到39%（图​（图3A）第3页)或47%（图​（图3B）3B公司)对应的完全匹配信号的完全匹配。也与之前的调查结果一致[10]，双碱基错配的影响更大，将杂交信号降低到14%（图​（图3A）第3页)或9%（图​（图3B）3B公司)对应的完全匹配信号的匹配。我们注意到，由于探针长度或我们实验中使用的cRNA片段为大约100个碱基，其他阵列平台可能会产生不同的失配效应。因此，实际探针/目标双工长度主要取决于30基极探针的长度（两条单线中较短的一条）。

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对错配的特异性随着杂交时间的增加而增加。(A和B)单碱基（菱形，左y轴）或双碱基（正方形，右y轴）失配的强度，作为完美匹配信号的百分比，被绘制为两个不同探针序列的时间函数。(C和D)对于a和B中所示的相同探针序列，将完美匹配（菱形）、单基错配（正方形）或双基错配的强度绘制为时间的函数。

两种情况可能会随着时间的推移产生更高的特异性。首先，在较长的杂交时间内，可能会分离出较大比例的不匹配双工（相对于完全匹配双工），从而导致不匹配的双工的杂交强度较低。其次，完美匹配的强度可能比不匹配的强度增加得更显著。为了确定是否存在一种或两种情况，我们绘制了完美匹配、一个碱基错配和两个碱基失配探针的强度与时间的关系（图​（图3C3C公司和​和3D）。三维). 虽然X69550_1561的完美匹配探针的强度随时间增加而增加，在16小时左右达到稳定，但两个失配探针的强度均随时间降低，在16个小时左右达到平稳（图​（图3C）。3C公司). 相比之下，虽然X79067_3352的完美匹配探针的强度在4到16小时之间增加了80%，但单基错配探针的强度仅在4到16h之间增加了40%，而双基错配探头的强度在4~16小时之间减少了20%（图​（图3D）。三维). 因此，可以用不同的方式产生特异性。这些数据提供了Codelink微阵列系统中溶液相杂交行为的进一步证据，并证明短杂交时间可能导致特异性降低。

值得注意的是，图中的数据​图22和​和3三不要强调微阵列平台的准确性。例如，图中的结果​图22显示出17%的相对误差（[预期的折叠变化-观察到的折叠变化]/预期的折叠改变），与其他地方报告的较高误差相比，该误差较低[25]. 然而，数据显示了比率的低但一致的压缩（通过比较从一个转录物浓度获得的信号与从下一次稀释获得的信号获得）。因此，进行杂交时间过程，以找出在比率中产生最低压缩的时间。一次计算多个基因（>1000个基因）比率的简单方法是改变杂交中使用的cRNA数量，并比较每个探针的计算比率和预期比率。这种方法消除了仅使用对照转录本时可能引入的偏差，并防止了样品制备方法引入的系统性错误。重要的是，总核酸浓度通过改变标记的cRNA的量和用未标记的cRNA补充较低量的标记的cRNA来保持恒定。因此，这些实验中唯一的变量是杂交时间。

使用这种方法，如果将20微克标记cRNA产生的信号强度与4微克标记的cRNA获得的信号强度进行比较，则每个探针的比率预计为5。我们承认这是一个过于简单化的问题，因为一些探针比其他探针更快地达到平衡，并且高信号可能会导致像素饱和。然而，作为一种全局方法，对比率的压缩作为杂交时间的函数进行了研究。24小时的杂交时间产生的比率为5（图。​（图4A）。4A级). 如果杂交时间太短或太长，则会发现明显的压缩。这些结果表明，杂交时间可能通过在较短时间内引入压缩效应而影响比率的准确性。

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表达比率的准确性：（A）表达率的准确性作为杂交时间的函数。对于总共含有20μg cRNA靶（4μg标记cRNA+16μg未标记cRNA）和20μg标记的cRNA的杂交，孵化时间从4小时到42.5小时不等。（B）根据褶皱变化检查两个平台的相对误差。图中显示了来自Zhou和Abagyan的Affymetrix GeneChip数据的相对误差与来自2倍稀释序列的CodeLink数据的相对误差​图2。2。基因芯片数据可从以下网站获得：http://carrier.gnf.org/publications/MOID/spike.html.

杂交时间如何影响小于或大于5的比率？这种压缩效果（或相对误差）是否随比率的增大而增大？最后，这些数据与其他平台相比如何？为了解决这些问题，我们重复了图​图22但进行了24小时的杂交，而不是图中用于生成数据的18小时​图2。2.我们根据周和阿巴扬的方法分析了两组稀释系列数据[25]使用稀释系列的最高浓度，并确定相对误差如何在较大的差异表达比率范围内变化。我们还分析了该格式的Zhou和Abagyan出版物中的Affymetrix数据。我们使用18或24小时杂交时间绘制了相对误差作为Codelink平台折叠变化的函数（图​（图4B）。4B类). 数据点用二阶多项式拟合，R2值（18和24小时杂交时间分别为0.968和0.988）表明数据与曲线拟合良好。最后，当以这种格式绘制来自类似Affymetrix实验的数据时，相对误差也随着褶皱变化而增加。绘制的Affymetrix数据基于每个预期褶皱变化的12到154个数据点，因此总共代表366个数据点。我们注意到，由于用于生成Affymetrix数据的条件非常不同，并且它仅来自一个出版物，因此不应将这些数据与Codelink数据进行比较。然而，这些数据确实表明，相对误差随着折叠次数的增加而增加可能是多个微阵列平台的一个共同特征。

图中的数据​图4B4B类强调了几点。首先，使用加标控制转录本的数据（图​（图4B）4B类)与图中所示数据一致​图4A4A级当比较18小时和24小时的时间点时使用内源性转录物，并证明24小时的杂交时间比18小时的杂交时间产生更准确的数据（更少的压缩或更低的相对误差）。我们注意到图中的42小时时间点​图4A4A级无法与图中的类似时间点进行比较​图4B。4B类其次，就相对误差而言，对于Codelink平台上检测的所有折叠变化，24小时杂交时间始终优于18小时杂交时间。第三，所有三种条件（Codelink 18和24小时以及Affymetrix平台）中的相对误差随比率的增大而增大。这些结论应该包含两个要点。首先，不同的平台使用不同的寡核苷酸长度（长度从25到60个碱基），甚至扩增的cDNA产物[1,2,10,12,13,22,24]，具有不同的阵列结合核酸可及性。因此，不可能概括出在一个平台上最优的时间在第二个平台上也是最优的。其次，需要对Codelink阵列进行更多研究，以验证24小时确实是最佳的。我们只知道它的表现优于18小时的时间点。我们得出的结论是，较长的杂交时间（例如，长33%）可以产生相对误差较小的微阵列数据（而42小时的杂交时间可以产生更多的压缩），作为提高性能（信号强度和失配特异性）的简单方法，该动力学参数值得进一步研究和准确性。

讨论

关于寡核苷酸探针的最佳长度存在很多争议。然而，关于探针长度的一种更实用的思考方式可能是探针中有多少碱基可用于杂交，以及这些碱基是否表现出溶液相生物物理行为。以这种方式，还必须考虑连接器长度和表面效应。例如，一些就地合成的60碱基寡核苷酸探针可能无法用于杂交[12]而其他就地合成探针可能需要连接器才能获得最佳性能[13]. 我们使用30个碱基寡脱氧核苷酸探针提供证据，证明大多数（如果不是全部）探针可用于杂交，并且表面不会引入显著的空间效应。我们注意到，本研究中使用的三维Codelink阵列与标准表面结合阵列不同，因此，本报告中的观测结果与其他阵列平台上的观测结果不同，这一点不足为奇。此外，我们首次在微阵列平台上显示了微阵列杂交失配数据与溶液相双相熔融实验的强烈一致性（图​（图11).

微阵列实验中的另一个重要考虑因素是杂交反应所允许的时间。最近的数据表明，特异性结合比非特异性结合需要更长的时间才能达到平衡[22]这表明较长的杂交时间可能是有益的。这些发现隐含的事实是，随着杂交时间的延长，折叠变化的准确性也可能增加。我们提供的证据表明，杂交时间实际上可以提高表达比率的准确性（折叠变化），减轻观察到的比率压缩，并且对于较大的折叠变化，这种影响可能更为显著（图​（图4）。4). 回想起来，这些数据从生物物理的角度来看是有意义的，因为在较长的杂交时间里，不匹配的双工体会因其更快的分离速率而分离（图​（图3），三)剩下的主要是完美匹配的双工器。不同平台上的最佳杂交时间可能不同，这取决于探针长度和可接近性、扩散系数和检测方法，但随着杂交时间的增加而提高准确性的基本前提应该成立。因此，我们认为该参数值得进一步研究。

已使用各种计算和统计方法来改进和过滤微阵列数据。例如，局部加权线性回归（lowess）归一化已被用于校正对数的系统依赖性2红/绿表达比率对杂交强度的影响[28]. 双色体系中竞争性杂交的发现要求两个靶点的杂交动力学相同[21]可能有助于解释这种规范化的必要性。因此，在微阵列平台中了解探针和靶点的杂交行为可以避免大量数据操作的需要。

此外，最近的一项研究发现，cDNA和寡核苷酸阵列低估了定量逆转录聚合酶链反应测定的实验样品和对照样品之间mRNA表达的相对变化[29]. 这种低估（或比率压缩）随着相对变化的增加而增加，与我们的观察结果一致（图​（图4B）。4B类). 此类比较研究强调了需要了解微阵列平台中比率压缩的根本原因，以便设计有效的解决方案。特定约束需要更长时间才能达到平衡[22]更长的杂交时间可以缓解表达比率的压缩（本报告）是基础研究如何最终改进微阵列数据的一个例子。

结论

本报告中的数据首次证明了微阵列三维矩阵探针中的不匹配效应与基于溶液的热力学双相熔化研究之间的强烈一致性。此外，增加杂交时间可以通过减轻表达比率中观察到的压缩来提高折叠变化的准确性，并且对于较大的折叠变化，这种效果可能更显著。这样的研究可能最终有助于提高微阵列数据的质量。

方法

阵列实验

如前所述进行靶点制备、CodeLink™DNA微阵列杂交和处理[26]除非另有说明。在浓度为1.25 mM的cRNA标记反应中使用了一个标记的单核苷酸，生物素11-UTP。未标记的UTP出现在3.75 mM，而GTP、ATP和CTP出现在5 mM。如前所述，cRNA在杂交反应之前被片段化[10,26]. 杂交时间研究遵循上述程序，但以下情况除外。第一个样本由20 ug标记的cRNA靶组成。第二个样本包括4 ug标记的cRNA靶点和16 ug未标记的cRNA靶点，共20 ug cRNA。每个靶点与一个阵列杂交4、8、14、18、24或42.5小时。

通过添加来自大肠杆菌基因阿拉伯的，entF，输入，修复A、和gnd（接地）肾总RNA中每个转录物的最终浓度为10μM。然后将这10μM稀释液稀释为肾总RNA，以2倍系列稀释至每个转录物19.53 nM的最低浓度。假设mRNA群体占总RNA的2.5%，每细胞300000 mRNAs，平均mRNA长度为1000碱基，则78 nM稀释度约等于每细胞1拷贝[10].

阵列设计

数据如图所示​图11使用不匹配扫描阵列生成。该阵列由十个探针组组成，其中每个探针组被设计为与复杂的人类polyA+RNA样本（例如，来自人类肝脏或人脑）中的尖峰细菌转录物或内源性转录物杂交。每个探针集包括与目标转录物的完美匹配和两个子集。第一个子集由三十个探针组成，每个探针都有两个碱基失配。对于该子集中的每个探针，将不匹配的位置移动一个碱基，生成具有两个碱基不匹配的探针子集，扫描30个碱基序列的长度。第二个子集还包括30个探针，每个探针都有一个三基失配。对于该子集中的每个探针，不匹配的位置移动一个碱基，生成一个具有三个碱基不匹配的探针子集，扫描30个碱基序列的长度。

图中显示的数据​图22通过​通过44使用Codelink™Human Uniset I数组生成。这些阵列包含9589个探针（代表大约9200个唯一的登录号），设计用于与polyA+RNA中存在的人类转录物杂交，以及大约386个控制探针（设计用于主要与细菌转录物杂交）。非对照探针（用于测量内源性人类转录物的相对表达水平）均基于每个基因一个探针的范式设计。然而，设计了三到十个细菌控制探针来与每个细菌转录本杂交。当相应的细菌转录物被添加到人类polyA+RNA中时，这些细菌探针可以用作阴性对照或其中的一个子集可以用作阳性对照。后一种情况，即四个细菌转录物添加到polyA+RNA中，用于生成如图所示的数据​图2。2。对阵列上三个细菌探针中的每一个探针的杂交信号进行测量，以获得四个加标转录本中的每个转录本，以及在每次连续稀释时测量的总共十二个信号。此外，控制探针集包含五个探针集，每个探针集都包含与细菌转录本或内源性人类转录本完全匹配的一、二、三和四碱基错配。在不同的阵列杂交时间后测量这些探针集的强度，以生成如图所示的数据​图3。三最后，设计用于测量polyA+RNA中内源性人类转录物的人类Uniset I阵列上的探针在不同的阵列杂交时间和不同数量的标记cRNA后进行测量，以生成如图所示的数据​图4A。4A级。在不同的杂交时间和细菌转录物的连续稀释后，对这些阵列上设计用于与四个加标细菌转录物杂交的12个探针进行测量，以生成如图所示的数据​图4B4B类.

T型米决心

使用安捷伦8453 UV-VIS光谱系统测量溶液相熔化温度，并使用1.5 ml石英试管添加珀尔贴恒温单细胞支架。每个探针-目标集包含一个完美的DNA:RNA30-mer匹配和6个DNA:RNA对，其中3个碱基错配并入寡核苷酸中。寡核苷酸（IDT Technologies）在室温下与等摩尔量的寡核苷酸在严格清洗溶液（75 mM Tris-Cl，112.5 mM NaCl）或杂交缓冲液（50%甲酰胺/6×SSPE）中孵育，然后以1°C的增量进行熔化曲线分析，并在260 nm下进行持续监测。T型钢米通过计算A的一阶导数来确定每个DNA:RNA对260轮廓。

作者的贡献

DD和AN进行了数据分析，并帮助进行了实验设计。LG、AL、MP、ET和RE执行了所有实验。RL和TJS进行了所有的生物信息学，设计了探针，并帮助制造了所用的阵列。AM撰写了论文，生成了大部分数据，建议了大部分实验，并提供了总体技术指导。所有作者阅读并批准了最终手稿。

工具书类

  • Lockhart DJ、Dong H、Byrne MC、Follettie MT、Gallo MV、Chee MS、Mittmann M、Wang C、Kobayashi M、Horton H、Brown EL。通过杂交到高密度寡核苷酸阵列的表达监测。国家生物技术。1996;14:1675–1680.[公共医学][谷歌学者]
  • Schena M、Shalon D、Davis RW、Brown PO。用互补DNA微阵列定量监测基因表达模式。科学。1995;270:467–470.[公共医学][谷歌学者]
  • Pomeroy SL、Tamayo P、Gaasenbeek M、Sturla LM、Angelo M、McLaughlin ME、Kim JY、Goumnerova LC、Black PM、Lau C、Allen JC、Zagzag D、Olson JM、Curran T、Wetmore C、Biegel JA、Poggio T、Mukherjee S、Rifkin R、Califano A、Stolovitzky G、Louis DN、Mesirov JP、Lander ES、Golub TR。基于基因表达的中枢神经系统胚胎性肿瘤预后预测。自然。2002;415:436–42. doi:10.1038/415436a。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • van t Veer LJ、Dai H、van de Vijver MJ、He YD、Hart AAM、Mao M、Peterse HL、van der Kooy K、Marton MJ、Witteveen AT、Schreiber GJ、Kerkoven RM、Roberts C、Linsley PS、Bernards R、Friend SH。基因表达谱预测乳腺癌的临床结局。自然。2002;415:530–536. doi:10.1038/415530a。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Marton MJ、DeRisi JL、Bennett HA、Iyer VR、Meyer MR、Roberts C、Stoughton R、Burchard J、Slade D、Dai H、Bassett DE，Jr、Hartwell LH、Brown PO、Friend SH。药物靶点验证和使用DNA微阵列识别二级药物靶点效应。自然医学。1998;4:1293–1301. doi:10.1038/3282。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Waring JF、Ciurlionis R、Jolly RA、Heindel M、Ulrich RG。体外肝毒素的微阵列分析揭示了基因表达谱与毒性机制之间的相关性。毒物快报。2001;120:359–68. doi:10.1016/S0378-4274（01）00267-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hamadeh HK、Bushel PR、Jayadev S、Martin K、DiSorbo O、Sieber S、Bennett L、Tennant R、Stoll R、Barrett JC、Blanchard K、Paules RS、Afshari CA。基因表达分析揭示了化学特异性。毒理学。2002;67:219–231. doi:10.1093/toxsci/67.2.219。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hughes TR、Marton MJ、Jones AR、Roberts CJ、Stoughton R、Armour CD、Bennett HA、Coffey E、Dai H、He YD、Kidd MJ、King AM、Meyer MR、Slade D、Lum PY、Stepaniants SB、Shoemaker DD、Gachotte D、Chakraburtty K、Simon J、Bard M、Friend SH。通过表达谱概要进行功能发现。单元格。2000;102:109–126.[公共医学][谷歌学者]
  • Iyer VR、Eisen MB、Ross DT、Schuler G、Moore T、Lee JCF、Trent JM、Staudt LM、Hudson J，Jr、Boguski MS、Lashkari D、Shalon D、Botstein D、Brown PO。人类成纤维细胞对血清反应中的转录程序。科学。1999;283:83–87. doi:10.1126/science.283.5398.83。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ramakrishnan R、Dorris DR、Lublinsky A、Nguyen A、Domanus M、Prokhorova A、Gieser L、Touma E、Lockner R、Tata M、Shippy R、Sendera T、Mazumder A。摩托罗拉CodeLink™微阵列在基因表达谱应用中的性能评估。核酸研究。2002;30：e30.doi:10.1093/nar/30.7.e30。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Fodor SP、Read JL、Pirrung MC、Stryer L、Lu AT、Solas D.光定向、空间寻址并行化学合成。科学。1991;251:767–773.[公共医学][谷歌学者]
  • Hughes TR、Mao M、Jones AR、Burchard J、Marton MJ、Shannon KW、Lefkowitz SM、Ziman M、Schelter JM、Meyer MR、Kobayashi S、Davis C、Dai H、He YD、Stephaniants SB、Cavet G、Walker WL、West A、Coffey E、Shoemaker DD、Stoughton R、Blanchard AP、Friend SH、Linsley PS。使用喷墨寡核苷酸合成器制作的微阵列进行表达谱分析。国家生物技术。2001;19:342–347. doi:10.1038/86730。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Nuwaysir EF、Huang W、Albert TJ、Singh J、Nuwaysier K、Pitas A、Richmond T、Gorski T、Berg JP、Ballin J、McCormick M、Norton J、Pollack T、Sumwalt T、Butcher L、Porter D、Molla M、Hall C、Blattner F、Sussman MR、Wallace RL、Cerrina F、Green RD。使用无掩模光刻技术产生的寡核苷酸阵列进行基因表达分析。基因组研究。2002;12:1749–1755. doi:10.1101/gr.362402。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lemeshko SV，Powdrill T，Belosludtsev YY，Hogan M.寡核苷酸在带正电荷的表面上形成具有非螺旋性质的双链。核酸研究。2001;29:3051–8. doi:10.1093/nar/29.14.3051。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yue H、Eastman PS、Wang BB、Minor J、Doctolero MH、Nuttall RL、Stack R、Becker JW、Montgomery JR、Vainer M、Johnston R。cDNA微阵列检测全球基因表达变化的性能评估。核酸研究。2001;29：e41.doi:10.1093/nar/29.8.e41。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shi SJ、Scheffer A、Bjeldanes E、Reynolds MA、Arnold LJ。DNA在玻璃微阵列上表现出多品牌的结合识别。核酸研究。2001;29:4251–6. doi:10.1093/nar/29.20.4251。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shchepinov MS，Case Green SC，Southern EM。影响核酸与寡核苷酸阵列杂交的立体因素。核酸研究。1997;25:1155–1161. doi:10.1093/nar/256.1155。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Peterson AW，Heaton RJ，Georgiadis RM。表面探针密度对DNA杂交的影响。核酸研究。2001;29:5163–5168. doi:10.1093/nar/29.24.5163。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chan V，Graves DJ，McKenzie SE。用固定化寡核苷酸探针进行DNA杂交的生物物理学。生物物理学杂志。1995;69:2243–2255. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Livshits MA，Mirzabekov AD。凝胶固定化寡核苷酸DNA杂交动力学的理论分析。生物物理学杂志。1996;71:2795–2801. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang Y，Wang X，Guo S-W，Ghosh S.双色微阵列中确保竞争性杂交的条件：理论和实验分析。生物技术。2002;32:1342–1346.[公共医学][谷歌学者]
  • Dai H，Meyer M，Stepaniants S，Ziman M，Stoughton R.利用杂交动力学来区分寡核苷酸微阵列的特异性和非特异性结合。核酸研究。2002;30：e86.doi:10.1093/nar/gnf085。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chudin E、Walker R、Kosaka A、Wu SX、Rabert D、Chang TK、Kreder DE。Affymetrix基因芯片阵列信号强度和转录物浓度之间关系的评估。基因组生物学。2001;三:0005.1. doi:10.1186/gb-2001-3-1-research0005。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Relogio A、Schwager C、Richter A、Ansorge W、Valcarcel J.基于寡核苷酸的DNA微阵列优化。核酸研究。2002;30：e51.doi:10.1093/nar/30.11.e51。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zhou Y，Abagyan R.高密度寡核苷酸阵列分析的匹配积分分布（MOID）算法。BMC生物信息学。2002;三：3.数字对象标识代码：10.1186/1471-2105-3-3。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dorris DR、Ramakrishnan R、Trakas D、Dudzik F、Belval F、Zhao C、Nguyen F、Domanus M、Mazumder A.一种高度可重复、线性和自动化的DNA微阵列样品制备方法。基因组研究。2002;12:976–984. doi:10.1101/gr.227402。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Young S，Wagner RW。近生理条件下磷酸二酯或修饰寡核苷酸与RNA的杂交和分离率。核酸研究。1991;19:2463–2470. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Quackenbush J.微阵列数据规范化和转换。自然遗传学补遗。2002;32:496–502. doi:10.1038/ng1032。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yuen T，Wurmbach E，Pfeffer RL，Ebersole BJ，Sealfon SC。商业寡核苷酸和定制cDNA微阵列的准确性和校准。核酸研究。2002;30：e48.doi:10.1093/nar/30.10.e48。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
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