与大多数器官不同，乳腺主要在出生后发育，以响应内分泌信号。在胚胎发生过程中，初生乳腺是通过胚胎外胚层的萌芽和邻近间充质的侵入形成的，从而形成原始的导管树，在青春期，随着激素信号的传递，导管树的大小和分支模式都会增加。怀孕期间，乳腺导管分支进一步增加，在导管分支的末端形成分泌性小叶-肺泡隔室，以便生产和分泌乳汁。子代断奶后，母亲的小叶肺泡室恢复到处女状态。因此，乳腺经历了激素依赖性分化和去分化的周期性过程(15,34,40).
成年女性的乳腺树由管腔上皮层的泌乳细胞组成，管腔上皮由肌上皮细胞的基底层包围，肌上皮细胞提供泌乳所需的结构支持和收缩力(18). 肌上皮细胞兼具上皮细胞和平滑肌细胞的特性。它们是真正的上皮细胞，因为它们来源于外胚层，它们表达细胞角蛋白作为中间丝系统的主要成分，它们形成桥粒、半桥粒和钙粘蛋白介导的连接，并且它们通过基底膜与周围的基质永久分离。另一方面，与平滑肌细胞一样，肌上皮细胞的细胞质中含有许多细丝，表达几种平滑肌结构蛋白，并具有收缩能力(10,57). 催产素刺激触发肌上皮细胞收缩，导致牛奶释放(9,34,36). 虽然许多研究都集中在管腔上皮细胞的分化和功能上，但对控制肌上皮细胞发育的机制知之甚少，而且还没有发现控制其分化的转录因子。
SMCs的分化依赖于血清反应因子（SRF），一种结合DNA序列的MADS（MCM1，agaous，deficiens，SRF）盒转录因子，称为CArG[CC（a/T）6与平滑肌结构基因相关的GG]盒，如平滑肌α-肌动蛋白和肌球蛋白重链基因(16,20,23,27,29,30,32). 心肌病转录辅激活因子家族成员与SRF相互作用，并有效增强SRF依赖基因的表达（7、11、26、52、54-56、58）。肌钙蛋白在心脏和平滑肌细胞中特异表达，而肌钙蛋白相关转录因子（MRTFs）MRTF-A/MAL/MKL1和MRTF-B/MKL-2在多种细胞类型中表达(4,5,28,31,42,53).
删除Srf公司小鼠中的基因导致早期胚胎死亡，因此无法分析Srf公司出生后(2). 同样，肌钙蛋白基因敲除小鼠在胚胎第10.5天（E10.5）死于SMC分化明显失败(26)、和MRTF-B型空白小鼠在E13.5左右死亡，主动脉弓动脉内SMC异常(38). 在骨骼肌谱系中，SRF和MRTF对肌纤维的生长和成熟很重要(25).
这里我们描述了MRTF-A型突变小鼠。与缺乏心肌素或MRTF-B型基因，在MRTF-A型基因是可行的。然而，产后MRTF-A型突变雌性无法有效地养育后代。对这种母体异常的分子基础的分析揭示了MRTF-A在维持乳腺肌上皮细胞的分化和功能方面的重要作用，而乳腺肌上皮细胞是哺乳期从乳腺排出乳汁所必需的。维持肌上皮细胞分化的失败会导致该特定细胞群的凋亡。我们的结论是，MRTF-A是乳腺肌上皮细胞发育和存活的高度特异性调节因子，心肌蛋白家族的每个成员都致力于在胚胎发育和成年期间控制特定细胞亚群中的平滑肌基因，尽管它们在某些细胞类型中可能发挥多余的作用。
材料和方法
的生成MRTF-A型击倒老鼠。
基因结构MRTF-A型已在前面描述过(53). 一个MRTF-A型-通过使用pN-Z-TK2载体构建靶向载体以删除外显子9和10，该载体包含一个核LacZ公司暗盒和在RNA聚合酶II启动子控制下的新霉素抗性基因以及两个单纯疱疹病毒胸苷激酶基因暗盒（R.Palmiter，华盛顿大学，西雅图分校的慷慨礼物）。基因组DNA侧翼MRTF-A型从小鼠129SvEv基因组DNA文库（Stratagene）中PCR扩增第9和第10外显子，并将其分别作为短臂和长臂插入靶向载体。将靶向载体电穿孔到129个SvEv衍生胚胎干细胞中，并分别用G-418和FIAU进行选择。500个ES细胞克隆被分离出来，并通过Southern杂交进行同源重组分析。三个克隆被中断MRTF-A型将该基因注射到3.5天龄小鼠C57BL/6胚泡中，将获得的嵌合体雄性小鼠培育成C57BL/6雌性小鼠，以实现突变等位基因的生殖系传递。
逆转录聚合酶链反应。
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从组织中纯化总RNA。对于逆转录（RT）-PCR，总RNA被用作逆转录酶和随机六聚体引物的模板。可根据要求提供引物序列。
免疫染色和组织学。
如前所述(43)第四对乳腺经手术切除，用卡诺伊氏固定剂（60%乙醇、30%氯仿、10%冰乙酸）固定1h，用70%乙醇和蒸馏水冲洗，然后用胭脂红明矾染色液（0.2%胭脂红、0.5%硫酸铝钾）染色过夜，再次冲洗，并用二甲苯清除，以显示染色的小叶-肺泡结构。
按照标准技术进行组织切片和苏木精/伊红染色。为了进行免疫染色，切片在二甲苯中脱蜡，通过分级乙醇再水化成磷酸盐缓冲液（PBS），并在0.3%Triton X-100中渗透到PBS中。采用标准热抗原回收方法检测抗细胞角蛋白（CK）14、CK18、裂解半胱天冬酶3和增殖细胞核抗原（PCNA）的抗体。在PBS中用1.5%的正常山羊血清阻断非特异性结合，并在4°C的PBS中以1:200的稀释度在0.1%牛血清白蛋白中应用一级抗体过夜。切片在PBS中清洗，荧光素或德克萨斯红结合二级抗体（Vector Laboratories）以1:200的稀释度在1%正常山羊血清中应用1小时。使用的抗体为小鼠SMα-肌动蛋白抗体（克隆1A4；Sigma）、兔细胞角蛋白14抗体（Zymed）、，小鼠CD10（抗常见急性淋巴细胞白血病抗原[CALLA]）抗体（56C6；Labvision）、兔细胞角蛋白18抗体（Santa Cruz）、兔裂解半胱天冬酶3抗体（Cell Signaling）和小鼠PCNA抗体（SantaCruz。
TUNEL染色。
死端荧光末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素缺口末端标记（TUNEL）系统购自Promega（威斯康星州麦迪逊），并根据用户手册进行染色。
RNA原位杂交。
如前所述，对石蜡切片进行原位杂交(52). 拍摄了相同的亮场和暗场图像，银色颗粒使用Adobe Photoshop被伪红色，然后叠加图像。
蛋白质印迹分析。
在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析蛋白质提取缓冲液（50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，pH 7.5）中从乳腺组织中提取总蛋白质。将样品均匀化，然后在冰上培养30分钟，并在4°C下在9500×g下离心20分钟。将上清液转移到新鲜试管中，并使用比新新酸比色法（Bio-Rad）测量蛋白质浓度。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上运行样品（30μg/车道），将其印在聚偏二氟乙烯膜上，并与封闭溶液（5%的牛奶在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中）孵育1小时。将膜与一级抗体孵育（兔子Stat3抗体[Santa Cruz]和兔磷酸化-Stat3-Tyr705抗体[细胞信号传递]）在4°C的封闭溶液中稀释过夜，并使用辣根过氧化物酶偶联二级抗体结合化学发光底物（ECL；AP Biotech）检测特异性结合抗体。
结果
的生成MRTF-A型突变小鼠。
老鼠MRTF-A型该基因位于第15号染色体上，包含14个外显子，分布在约37 kb的DNA上。为了在基因中引入功能丧失突变，我们删除了一个1.7 kb的区域，该区域包含外显子9的一部分和外显子10的全部，编码碱性、富含谷氨酰胺和SAP结构域（图。). 基本结构域是心肌蛋白和MRTFs与SRF相互作用所必需的，SAP结构域赋予靶基因特异性(33,52,54,56). 这些结构域的缺失导致MRTF-A的功能失活。缺失的基因组区域被替换为lacZ公司表达盒与外显子9和新霉素耐药基因融合在框架内。目标MRTF-A型通过基因组DNA的Southern blot分析（图。).
生成和分析MRTF-A型击倒老鼠。（A） 基因靶向策略。小鼠MRTF-A蛋白的示意图位于顶部。氨基酸位置显示，功能域在相应的外显子上以彩色显示。该靶向载体包含一个2.4kb的5′臂和一个5-kb的3′臂，用LacZ-neo盒替换了该基因的1.7kb区域。指示了5′和3′探头的位置。用于基因分型的PCR引物的位置在底部用水平箭头指示。野生型；tk，胸苷激酶；NTD，N端结构域；Q、 富含谷氨酰胺的结构域；++，基础区域；LZ，亮氨酸拉链；TAD，反式激活结构域。（B） 南方分析。从尾部活检中分离ES细胞克隆的基因组DNA，用HindIII消化后用5′和3′探针进行Southern印迹分析。哑巴，突变体。（C） 用于RT-PCR的引物位置。外显子示意图MRTF-A型显示了用于RT-PCR的引物的基因和位置。预期突变将包含外显子9和11之间的LacZ-neo盒。然而，从突变小鼠心脏组织中分离的mRNA进行RT-PCR，结果显示第8外显子与第12外显子拼接，如下图所示。（D） 使用面板C中显示的引物对来自心脏组织的RNA进行RT-PCR。顶部显示了小鼠的基因型。
MRTF-A型根据预测的孟德尔比率，从MRTF-A型杂合突变小鼠，表明MRTF-A型胚胎或出生后发育不需要。杂合和纯合MRTF-A型突变小鼠能够存活和繁殖，而空白小鼠的杂交产生了正常大小的幼崽。
确认基因靶向事件并确定突变等位基因是否编码截断MRTF-A型在转录本中，我们使用代表基因缺失区域内和周围外显子序列的引物，对从不同基因型成年小鼠心脏分离的mRNA进行RT-PCR（图。). 这些分析证实了目标外显子被删除，也表明外显子8剪接到外显子12，从而删除了lacZ-neo公司暗盒（图。). 对突变等位基因的RT-PCR产物进行测序表明，这种异常剪接事件导致了帧内融合，使得突变转录物将产生一个截短的蛋白质，其残基1至209与残基687至929融合，并且缺少SRF相互作用域。如果没有SRF结合区，这个截短的蛋白是无功能的，并且不作为SRF靶基因上的显性阴性突变体(33,52).
MRTF-A型突变雌性无法有效地哺育后代。
尽管MRTF-A型空白小鼠没有表现出明显的异常，我们注意到MRTF-A型空虚的女性无法茁壮成长。幼崽由MRTF-A型无效雌性从出生后第4天开始出现生长迟缓，没有一只存活超过20天（图。). The growth retardation of offspring ofMRTF-A型空白雌性不依赖于其基因型，这表明突变母亲而非后代中存在异常。事实上，野生型幼崽被培育成MRTF-A型空雌性也未能茁壮成长，而MRTF-A型被野生型母亲抚养的幼崽生长正常（图。).MRTF-A型-缺乏营养的雌性会照顾它们的幼崽，让它们从乳头吮吸，这表明它们没有表现出异常的母性哺育行为。这些发现表明MRTF-A型这是女性为有效地哺育孩子而特别需要的。我们在混合129SvEv/C57BL6和等基因129SvEv背景下观察到突变小鼠的相同表型，表明遗传背景不影响表型。
新生儿生长迟缓的护理MRTF-A型−/−母亲。（A） 产后生长曲线。野生型（WT）幼崽的体重(n个= 22; 3窝）和MRTF-A型突变体(n个= 19; 3窝）母亲在出生后连续几天进行测定。幼犬由MRTF-A型变异母亲未能茁壮成长。（B） 图中显示了出生后第5天（上图）和第10天（下图）的小狗。显示了母鼠和幼崽的基因型。野生型和MRTF-A型突变体幼崽与野生型母亲一起繁衍生息，而野生型和MRTF-A型突变体幼崽无法与MRTF-A型变异母亲。
乳腺发育异常MRTF-A型突变小鼠。
与以下概念一致：MRTF-A型突变雌性在哺乳方面表现出缺陷，从突变哺乳雌性的乳腺中分离出来的乳腺含有过多的乳汁，与野生型哺乳雌性的相比，乳腺苍白（图。). 为了观察不同孕期女性乳腺中的导管和肺泡结构，我们进行了整体染色。在突变雌性中，大棒状末端芽在青春期正常形成，乳腺树的伸长和分枝没有明显异常（图。). 在怀孕期间，发生了额外的导管分支，突变体中形成了末端肺泡，就像野生型雌性一样（图。). 在分娩后的第1天，突变雌性也完成了导管-肺泡发育，野生型和突变雌性的乳腺树无法区分（图。). 然而，从哺乳第4天开始，与野生型乳腺相比，突变型乳腺中的肺泡密度显著降低（图。). 野生型乳腺中完全被广泛肺泡包围的大导管在突变体中经常可见（图。). 第12天，野生型乳腺充满肺泡，而突变型乳腺的肺泡之间有空隙（图。). 值得注意的是，在这个阶段，与野生型雌性相比，突变雌性的肺泡更大，组织更少（图。). 断奶后，乳腺会经历一个称为退化的重塑过程，这在野生型和突变型动物中也是以同样的方式发生的。突变体的腺体回归到静止期也正常发生（图。).
乳腺缺损MRTF-A型突变雌性。（A） 哺乳第12天乳腺的外观。与野生型哺乳雌性相比，突变哺乳雌性的乳腺苍白。（B） 小叶-肺泡网络的整体染色。（a至f）处女、怀孕14天的女性和哺乳1天的女性的乳房发育正常。（g至j）肺叶-肺泡结构MRTF-A型突变雌性在哺乳中后期发育不全。在哺乳第4天，突变体（h，箭头）仍然可以看到大的管状结构。在哺乳第12天的突变乳腺中，与野生型乳腺相比，肺泡增大（j，箭头），肺泡之间有空隙（j，星号）。（k至n）正常外观MRTF-A型正在退化的突变乳腺。（C） 不同发育阶段的乳腺组织切片。（a至f）正常的导管-肺泡发育MRTF-A型休息和怀孕期间以及哺乳期第1天的突变雌性。黑色箭头，乳管；箭头，肺泡；蓝色箭头、奶滴；星号，脂肪细胞。（g和h）哺乳期间MRTF-A型突变体雌性大而壁薄（箭头），乳蛋白和脂类被困在肺泡中（箭头）。肺泡之间有脂肪组织（星号）。（i至l）MRTF-A型突变的乳腺在幼崽断奶后经历正常退化。
组织学分析证实，在休息期和妊娠期，导管-肺泡发育正常（图。). 在野生型和突变型8周龄处女中，乳腺充满脂肪组织，导管由一层上皮细胞排列，上皮细胞被肌上皮细胞和致密基质包围（图。). 怀孕期间，切片上可以看到导管和肺泡，上皮细胞开始在突变型和野生型乳腺中分泌乳蛋白和脂类（图。). 在分娩后的第一天，突变体的导管-肺泡结构的整体外观正常（图。). 然而，在哺乳第12天，组织切片显示，野生型哺乳女性的乳腺充满了肺泡，其内腔由高度组织化的厚肺泡壁界定。相反，在突变泌乳乳腺中，脂肪细胞仍然存在于肺泡之间，肺泡扩张，壁比野生型腺体薄得多（图。). 紫色蛋白染色和脂滴显示，牛奶也被困在突变乳腺的内腔中。幼崽断奶后，野生型和突变型乳腺以类似的方式退化（图。).
肌上皮细胞缺陷MRTF-A型突变小鼠。
确定导致护理缺陷的细胞类型MRTF-A型突变母亲，我们使用RT-PCR分析了8周龄处女和怀孕14天、哺乳4天、哺乳12天和更年期4天的女性乳腺组织的RNA样本，检测了不同乳腺细胞类型的标记。编码乳蛋白（α-乳清蛋白、β-酪蛋白和乳清酸蛋白）的转录物(三,41)在所有阶段均正常表达MRTF-A型突变乳腺（图。). 管腔上皮细胞特异性细胞骨架蛋白细胞角蛋白18(50)在突变体中也以正常水平表达（图。). 因此，突变体乳腺中的管腔上皮细胞分化和功能未受干扰，MRTF-A突变体女性的护理缺陷可能是由乳腺肌上皮细胞缺陷和泌乳缺陷引起的。
乳腺细胞转录本分析。（A） 乳腺基因的RT-PCR分析。MRTF-A转录本在突变中缺失，而MRTF-B在野生型和MRTF-A型突变雌性。乳蛋白（α-乳清蛋白、β-酪蛋白和乳清酸蛋白[WAP]）基因在哺乳期野生型和突变型乳腺中的表达水平相同。分泌上皮特异性CK18基因的表达在突变体中也没有变化。平滑肌（SMα-actin、SM22、SM MHC、SM肌球蛋白轻链激酶[MLCK]和SM钙化单体）基因在突变体哺乳期间特异性下调。其他肌上皮特异性（细胞角蛋白14、CD10和催产素受体[OTR]）基因在哺乳后期特异性下调。GAPDH基因是一种负荷控制。周，周；d、 天。（B） 通过对野生型和野生型乳腺切片进行原位杂交，检测所示平滑肌基因的转录物MRTF-A型哺乳12天的突变雌性。银颗粒呈假红色。
肌上皮细胞同时表达平滑肌基因和某些上皮基因。我们首先检测了肌上皮特异性上皮基因的表达，CK14型和CALLA公司(CD10型)，在乳腺中(14,50). RT-PCR分析CK14型和CALLA公司表明这些基因在泌乳早期（L4）表达降低，在泌乳后期（L12）几乎消失。
在妊娠-哺乳过渡期，野生型女性乳腺中的平滑肌基因上调(19). 乳腺组织中平滑肌基因的表达从MRTF-A型与野生型雌性小鼠相比，突变处女鼠和14天妊娠期小鼠。然而，我们在哺乳期的乳腺肌上皮细胞中观察到平滑肌标志物的明显缺失MRTF-A型突变雌性（图。). 原位杂交证实了突变乳腺肌上皮细胞中平滑肌基因表达的显著下调（图。).
有趣的是，平滑肌基因表达的消融仅限于哺乳期，而乳腺肌上皮细胞的初始分化在哺乳期表现正常MRTF-A型变种处女。MRTF-A型和MRTF-B型在乳腺发育周期中持续表达（图。)而在乳腺组织中未检测到心肌蛋白基因的表达。人乳腺上皮细胞系Hs578T和肌上皮细胞系Hs578Bst的RT-PCR分析表明MRTF-A型和MRTF-B型均在这两个细胞系中表达（未显示数据）。考虑到这两种转录因子的功能冗余，MRTF-B有可能单独在静止期启动乳腺肌上皮细胞的平滑肌基因表达；然而，妊娠和哺乳期间肌上皮细胞的快速增殖和分化需要MRTF-A。
肌上皮细胞分化异常MRTF-A型变异母亲。
为了进一步检查肌上皮细胞的分化，我们使用抗肌上皮蛋白SMα-actin和上皮蛋白细胞角蛋白18的抗体进行免疫组化（图。). CK18抗体标记乳管和肺泡上皮细胞的内层，其表达在野生型和MRTF-A型检测了所有阶段的突变动物。SMα-肌动蛋白阳性肌上皮细胞在导管周围形成单层。SMα-actin在野生型和MRTF-A型突变的8周龄处女（图。). 然而，在怀孕期间，乳腺导管周围的野生型肌上皮细胞显示出较强且较厚的星状染色模式，而突变的肌上皮细胞保持着类似于8周龄处女的染色模式（图。). 在哺乳的第1天，突变株中SMα-actin的表达与野生型相似（图。). 然而，在突变体的泌乳过程中，SMα-肌动蛋白最终下降（图。)令人惊讶的是，在哺乳后期，突变型肌上皮细胞几乎没有SMα-肌动蛋白的表达，而野生型肌上皮细胞在肺泡腔周围形成了一个不连续的篮状单层（图。). 然而，在退化后（断奶后4天）MRTF-A型突变体恢复到与野生型雌性相当的水平（图。). 用其他平滑肌蛋白如SM钙粘蛋白和SM-肌球蛋白重链（MHC）进行免疫组织化学染色，在MRTF-A型突变乳腺（数据未显示），这与这些基因的mRNA表达一致。
野生型和非野生型乳腺中平滑肌标记物的检测MRTF-A型突变雌性。（A） 在野生型和野生型乳腺组织切片中检测到SMα-actin（绿色）和细胞角蛋白18（红色）MRTF-A型处于指定阶段的突变雌性。细胞角蛋白18在突变体的所有阶段均正常表达。（a和b）野生型和MRTF-A型突变处女。（c和d）在怀孕的野生型女性中，乳管周围光滑的α-肌动蛋白染色变得更厚和更强，而突变的乳腺保持着薄的单层模式（箭头所示）。（e到l）SMα-actin的表达最终在哺乳过程中降低。虽然SMα-actin在第1天的表达处于正常水平，但在第12天突变乳腺的肺泡周围没有表达（箭头所示）。强烈表达SMα-actin的血管平滑肌不受影响（箭头）。（m到p）SMα-actin的表达在突变乳腺的退化过程中恢复，并且在幼崽断奶后4天与野生型相似。蓝色表示细胞核的4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。（B） 哺乳期使用SMα-actin和细胞角蛋白14抗体进行免疫染色。肌上皮细胞最终失去这些蛋白的表达。在哺乳的第12天，这两种蛋白的表达被消除，肺泡周围的细胞数量减少MRTF-A型突变乳腺。在退化过程中，这两种蛋白的表达恢复。（C） CD10的表达也在肌上皮细胞中特异性表达，在泌乳后期，CD10表达减少MRTF-A型突变体。周，周；d、 天。
肌上皮细胞缺乏MRTF-A型哺乳晚期的突变乳腺。
使用CALLA（CD10）和CK14抗体进行免疫染色证实，在哺乳第12天，CALLA和CK14的表达被消除（图。). 用SMα-actin和CK14抗体进行双重免疫染色表明，在哺乳第4天，这两种蛋白仍在哺乳期的大多数肌上皮细胞中表达MRTF-A型突变体，尽管与野生型相比水平有所下降。在第10天，这两个基因的表达进一步减少，而在第12天，SMα-actin和CK14的表达不再检测到（图。). 值得注意的是，在哺乳第4天，突变乳腺中肺泡腔周围的细胞数量与野生型相似，通常有三层细胞，由两层上皮细胞组成，由一层肌上皮细胞隔开。相反，在哺乳的第12天，突变乳腺树内腔周围的细胞数量大大减少，相邻肺泡腔之间的壁仅由两层细胞组成，这导致了这些壁的薄外观（图。).
所有这些结果表明，在泌乳后期，肌上皮细胞被消融MRTF-A型突变雌性。TUNEL分析（专门标记凋亡细胞的DNA）显示，在休息期或妊娠期或哺乳第2、4、7和12天，突变乳腺中的凋亡没有增加，而在哺乳第10天，在突变乳腺中检测到大量凋亡。突变乳腺在退化过程中表现出与野生型相似的凋亡率（图。).
哺乳期肌上皮细胞死亡、过早退化和退化期肌上皮增殖增加MRTF-A型突变乳腺。（A） 过度凋亡细胞死亡MRTF-A型TUNEL检测到哺乳第10天的突变乳腺。凋亡细胞的红色、TUNEL标记；细胞核DAPI染色。（B） 野生型和野生型细胞凋亡的量化MRTF-A型哺乳期和退化期的突变乳腺。（C） 抗SMα-肌动蛋白（红色）和裂解半胱天冬酶3（绿色）抗体的双重免疫荧光。（a和b）SMα-actin和裂解caspase 3双阳性细胞（箭头）占MRTF-A型哺乳第10天时乳腺发生突变。（c和d）野生型和突变退化乳腺中的大多数凋亡细胞都是SMα-肌动蛋白阴性上皮细胞（箭头所示）。蓝色表示细胞核的DAPI染色。（D） 退化相关基因的RT-PCR分析。GAPDH是装载控制。LBP，脂多糖结合蛋白。（E） STAT3表达和磷酸化的Western blot分析。STAT3在野生型和突变型中的表达水平相当。STAT3在哺乳中期突变株中是过磷酸化的（P-STAT3），其磷酸化水平在野生型和退化期突变株中相当。（F） 抗SMα-肌动蛋白（红色）和增殖细胞标记物PCNA（绿色）抗体的双重免疫荧光。（a和b）在MRTF-A型退化过程中的突变乳腺组织（箭头）。（c和d）面板a和b.d相应部分的DAPI染色，天；周。
为了确定突变乳腺组织中哪个细胞群在哺乳后期死亡，我们使用标记凋亡细胞的裂解caspase 3抗体和SMα-actin进行双重免疫荧光。在哺乳第10天发生凋亡的突变动物中，约50%的细胞SMα-actin阳性，而在野生型和突变动物退化的乳腺中，不到10%的凋亡细胞SMα-actin阳性（图。; 表). 这些数据表明，许多肌上皮细胞在哺乳后期死亡，由于严重的乳汁积累，突变的乳腺在一定程度上退化，一些上皮细胞也死亡。我们推测，哺乳早期残留的平滑肌蛋白足以维持低水平的乳汁排出，从而使MRTF-A型突变雌性。然而，在哺乳后期，当突变乳腺树中的肌上皮细胞几乎完全消融时，牛奶无法排出，牛奶淤积导致过早退化，导致后代饥饿。
表1。
| 小鼠表型 | %凋亡细胞中SMα-肌动蛋白阳性细胞的数量：
| 退化第4天的总增殖率（%） | %退化第4天所有增殖细胞中SMα-肌动蛋白阳性细胞的数量 |
|---|
| 哺乳第10天 | 退化的第4天 |
|---|
| MRTF-A型+/+ | ND（无损检测）一 | 8.9 ± 0.9 | 7.5 ± 1.3 | 3.1 ± 0.6 |
| MRTF-A型−/− | 50.4 ± 1.7 | 9.8 ± 0.9 | 8.2 ± 1.6 | 12.7 ± 1.0 |
泌乳期乳汁淤积对某些退化相关基因的上调MRTF-A型突变的乳腺。
众所周知，乳汁淤积以及泌乳激素的下降会导致乳腺退化，其特征是乳汁合成停止，上皮细胞凋亡，肺泡崩塌，最终重塑为与成年处女相似的形态状态。封口实验证明，牛奶积累产生的局部信号足以诱导细胞凋亡和牛奶合成的下调；然而，通过哺乳维持系统性催乳激素可以防止这种封闭的乳腺完全退化(24). 哺乳期MRTF-A型乳腺突变后，由于肌上皮细胞缺陷，乳汁无法有效释放并积聚在肺泡腔内。尽管在哺乳期间观察到乳汁积聚、肺泡扩张、脂肪组织过多以及细胞凋亡的短暂爆发MRTF-A型通过对主要乳蛋白基因的RT-PCR分析显示，突变的乳腺保持了小叶-肺泡结构的完整性，整个哺乳期的乳合成正常。过早退化不太可能是丧失的主要缺陷MRTF-A型并导致肌上皮基因表达减少，因为肌上皮基因在野生型乳腺组织退化期间正常表达（图。).
系统微阵列分析显示，内卷化还与一系列基因表达的特征性变化相关，尤其是与细胞死亡和免疫反应相关的基因(8,47). 为了进一步研究退化相关基因是否是由乳汁淤积诱导的MRTF-A型突变乳腺，我们通过半定量RT-PCR分析了一系列与退化有关的基因的表达（图。). 信号转导子和转录激活子3（STAT3）是乳腺退化的关键调节因子，参与程序性细胞死亡和急性期反应(6,17). STAT3在野生型和MRTF-A型乳腺周期不同阶段mRNA和蛋白质水平的突变。众所周知，STAT3在退化时高度磷酸化。使用抗磷酸化Stat3抗体通过Western blotting检测Stat3的磷酸化状态，这表明在哺乳后期，Stat3确实在突变乳腺中过磷酸化（图。). 作为STAT3靶点的CEBPδ基因在哺乳期也上调。在哺乳期间，突变乳腺组织中的其他几个退化相关基因上调。这些基因包括单核细胞分化抗原CD14、血清淀粉样蛋白A2和中性粒细胞标记物LRG1（富含白细胞的α2-糖蛋白1），它们都参与免疫反应；IGFBP5（胰岛素样生长因子结合蛋白5），对诱导细胞凋亡很重要；和酪氨酸激酶3（protein-tyrosinekinase3），其在乳腺退化中的作用尚未完全明确。有趣的是，编码脂多糖结合蛋白的基因参与急性期反应，也是STAT3的靶点(47)，以正常水平表达MRTF-A型突变体。这些数据表明，乳汁淤积诱导免疫反应和某些退化基因的上调MRTF-A型突变的乳腺，而荷尔蒙水平由持续哺乳幼崽维持，控制乳汁分泌和其他退化相关基因的表达。
有趣的是，幼崽断奶几天后，肌上皮细胞基因表达恢复到相对正常的水平。为了检测过度增殖是否产生更多的肌上皮细胞，对PCNA和SMα-肌动蛋白抗体进行双重免疫染色。在怀孕和哺乳期间，突变乳腺的增殖率没有受到影响（数据未显示）。然而，在退化过程中，突变体的总增殖率稍高，更重要的是，突变体中有大量SMα-actin阳性的增殖细胞，这表明断奶后可能从祖细胞生成新的肌上皮细胞（图。; 表).
讨论
这项研究的结果揭示了MRTF-A在乳腺肌上皮细胞分化中的重要作用，这是一种特殊的平滑肌肉样细胞类型，需要从乳腺排出乳汁。由于肌上皮细胞分化失败，MRTF-A型突变母亲无法有效地哺育后代。这些发现揭示了控制平滑肌和肌上皮细胞分化的分子机制的共同点，这两种细胞都依赖于SRF辅活化因子肌钙蛋白家族成员激活收缩蛋白基因。
肌上皮发育。
肌上皮细胞存在于大多数腺体的分泌和导管部分。它们的收缩功能由激素和神经信号控制，对导管分泌至关重要。肌上皮细胞还将代谢物运输到分泌细胞，并通过与基底膜的结合为腺组织提供结构完整性。肌上皮细胞的超微结构、基因表达模式和收缩特性与平滑肌细胞惊人地相似。然而，与来源于中胚层前体和神经嵴细胞的SMC不同，乳腺的肌上皮细胞来源于外胚层。据我们所知，负责肌上皮细胞分化的分子机制之前尚未明确。
乳腺导管树在MRTF-A型突变小鼠，但肌上皮细胞在泌乳时无法分化，如泌乳期间编码SMα-actin、SM MHC和SM钙化蛋白的平滑肌收缩蛋白基因缺乏表达。因此，突变母亲无法分泌乳汁。催产素是一种神经垂体激素，对刺激肌上皮细胞收缩和排乳至关重要，在MRTF-A型突变体（数据未显示）。催产素受体只在乳腺内的肌上皮细胞中表达(12,13). 泌乳早期（第4天），当肌上皮特异性平滑肌蛋白和细胞角蛋白已经下调时，突变乳腺中催产素受体转录物的表达没有变化。泌乳第12天，催产素受体表达减少，因为肌上皮细胞因过度凋亡而丢失。因此，催产素循环或信号传导缺陷不太可能导致MRTF-A型突变雌性。
奇怪的是MRTF-A型突变小鼠仅限于乳腺的肌上皮细胞。肌上皮细胞也与唾液腺和泪腺相关，但我们没有检测到这些腺体组织中的异常，这增加了心肌蛋白家族其他成员可能替代这些组织中MRTF-A功能的可能性。在这方面，值得注意的是MRTF-B型在乳腺中以正常水平表达MRTF-A型突变雌性。MRTF-A型和-B类也分别在乳腺上皮和肌上皮细胞系Hs578T和Hs578 Bst中表达。这可能表明，MRTF-A是乳腺肌上皮细胞分化所必需的，或者MRTF-A-的缺失将心肌蛋白家族成员的水平降低到肌上皮细胞诱导分化所需的临界阈值以下。有趣的是MRTF-A型突变小鼠仅限于妊娠和哺乳期，而平滑肌基因在静止的乳腺中表达正常。可能在休息期，MRTF-B能够取代MRTF-A并维持平滑肌程序，而在妊娠和哺乳期，当需要广泛增殖和分化肌上皮细胞时，MRTF-B无法弥补MRTF-A.的损失。研究MRTF-A和-B的转录活性在乳腺发育过程中是否受到女性激素的差异调节也很有趣。
MRTF-A是维持乳腺肌上皮细胞分化和存活所必需的。
在哺乳期的乳腺中MRTF-A型突变女性，不仅平滑肌基因，而且其他肌上皮细胞特异性基因，如细胞角蛋白14和CALLA基因，表达下调。在这些基因的转录起始位点上游40 kb范围内没有保守的SRF结合位点，也没有报道这些基因的表达可能受SRF的控制。由于平滑肌结构蛋白和细胞角蛋白共同构成了这些细胞的细胞骨架结构，我们推测平滑肌蛋白的丢失导致细胞角蛋白的可有可无，进而导致这些蛋白的降解或其表达的抑制，尽管我们不能排除MRTF-A具有除SRF之外的伙伴来控制这些肌上皮特异性基因的表达的可能性。泌乳第10天凋亡细胞显著增加；在第12天，尽管整个肺泡结构仍然保持不变，但肺泡壁更薄，细胞更少。值得注意的是，平滑肌和肌上皮特异性基因的表达减少先于凋亡细胞死亡。因此，平滑肌和肌上皮特异性基因表达失败导致的肌上皮细胞功能受损似乎导致了肌上皮细胞的程序性细胞死亡。
此前有报道称，排乳失败会促进乳腺退化(39,51). 在小白鼠中，乳汁的排出被乳头的封闭破坏，乳汁合成减少，程序性细胞死亡可以在不破坏肺泡结构的情况下进行，尽管这些小白鼠还没有进行基因表达谱分析(24). 观察到乳滞留在肺泡内MRTF-A型泌乳早期乳腺突变。然而，直到哺乳第10天才检测到过度凋亡，与正常退化不同，肌上皮细胞占凋亡细胞的很大一部分。此外，突变乳腺的小叶-肺泡结构在整个哺乳期保持泌乳外观，乳蛋白表达维持在正常水平。突变上皮细胞仍能产奶并保持其完整性的原因可能是，微量平滑肌收缩蛋白仍能释放少量奶，正如幼崽存活到哺乳后期所表明的那样，而且，牛奶积累的压力没有断奶或封闭乳头造成的压力严重。然而，应激能够诱导免疫反应，并且在基因转录水平上，一些（但不是全部）退化相关基因上调。我们不能排除MRTF-A具有抗退化或抗炎作用的可能性；然而，鉴于我们观察到的明显的肌上皮缺陷和乳汁堆积，退化基因的上调很可能是继发于乳汁淤积。
心肌蛋白家族和SRF对细胞迁移和细胞骨架发育的调节。
我们之前表明，心肌蛋白基因缺失小鼠在E10.5时因明显缺乏分化的SMC而死亡(26). 然而，这种突变表型的解释因以下事实而变得复杂：心肌素在这个发育阶段，该基因仅在SMC的一小部分中表达。此外，心肌素基因突变胚胎在卵黄囊发育过程中表现出异常，这使得很难区分心肌蛋白基因缺失对胚胎血管发育的影响是原发性还是继发性的卵黄囊异常。
中的空突变MRTF-B型由于一系列心血管缺陷，该基因还导致胚胎在～E12.5时死亡(38). 因此，肌球蛋白基因家族的每个成员都是激活平滑肌基因表达所必需的，但在不同发育阶段的不同细胞类型中，每个成员都是唯一需要的。为了确定是否存在功能冗余的细胞类型，以及是否存在导致平滑肌基因在细胞类型子集中表达的替代途径，将心肌病家族基因突变的不同组合制成小鼠将是一件有趣的事情。
MRTF-A已被证明能介导Rho信号传导和肌动蛋白细胞骨架变化对SRF-依赖性转录的影响(21,33). 在骨骼肌中过度表达MRTF-a显性阴性形式的小鼠表现为骨骼肌病和发育不全(25). 同样，MRTF-B/MKL2的显性阴性突变体在体外抑制骨骼肌细胞的分化(44). 然而，值得注意的是，MRTF-A型突变小鼠骨骼、心脏或平滑肌未见明显异常，可能是由于MRTF-A和MRTF-B之间存在冗余。
启示。
除了在泌乳中的作用外，肌上皮细胞也被认为具有抑制肿瘤的活性(1,22,48,49). 肌上皮细胞产生抗侵袭性蛋白酶抑制剂和抗血管生成分子，如蛋白酶nexin II、α1-抗胰蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂1、血小板反应蛋白1和可溶性碱性成纤维细胞生长因子受体(35,45,46). 因此，肌上皮细胞可以通过干扰肿瘤细胞的侵袭行为和抑制血管生成来诱导乳腺癌细胞的生长停滞和凋亡。考虑到SRF和MRTF在控制生长反应基因的表达中的作用，如c-福斯和废气再循环-1(5,37)，确定MRTF-A是否在乳腺癌中起作用将是很有意义的。
