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分子生物学细胞。2003年4月；14(4): 1583–1596.
数字对象标识：10.1091/桶。E02-07-0399号
预防性维修识别码：PMC153124项目
PMID：12686611

人类线粒体核仁的组成和动力学

努里亚·加里多,* 洛伦娜·格里帕里克,† 埃贾·约基塔洛,‡ 乔玛·瓦蒂奥瓦拉,‡ 亚历山大·范德布利克,†和约翰内斯·斯佩尔布林克*§
托马斯·福克斯，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

多个线粒体DNA（mtDNA）分子在称为核仁的离散蛋白-DNA复合体中的组织在酿酒酵母最近通过Twinkle-GFP融合蛋白与mtDNA的共定位，在人类细胞中观察到类似结构。然而，哺乳动物细胞中的类核特征很差，通常被认为是相对简单的结构，尽管有酵母的范例。在本文中，我们使用免疫细胞化学和生化分离程序来表征人类线粒体核仁的组成。结果表明，线粒体转录因子TFAM和线粒体单链DNA-结合蛋白通过溴脱氧尿苷的特异掺入与Twinkle在线粒体内病灶（定义为核仁）共定位。此外，mtDNA聚合酶POLG和其他各种尚未鉴定的蛋白质与mtDNA核仁通过生化分离程序进行共纯化，TFAM也是如此。结果表明，哺乳动物细胞中的mtDNA在线粒体网络中以离散的富含蛋白质的结构组织。类核的体内延时成像显示，它们是能够在线粒体网络中分裂和重新分布的动态结构，并表明类核是线粒体的遗传单位。类核不与线粒体裂变机制蛋白Drp1（dynamin-related protein 1，Drp1）共定位。

简介

哺乳动物线粒体DNA（mtDNA）是一种16.5-kb的环状双链DNA(安德森等。, 1981;比布等。, 1981)每个单元格有一到几千份副本（例如。，高松等。, 2002). 所有参与线粒体DNA维护的蛋白质都由核基因组编码。这些是复制和修复中的传统蛋白质，如mtDNA聚合酶POLG，但也包括直接或间接参与分离的蛋白质。

酵母中的MtDNA酿酒酵母在少数其他物种中，在较小程度上，似乎是在称为核仁的线粒体内组织成离散的病灶(宫川县等。, 1984). 这些被推断为遗传单位，每一个都包含酵母mtDNA的几个拷贝(雅各布斯等。, 2000;MacAlpine公司等。, 2000以及其中的参考）。生物化学纯化和蛋白质分析已经确定了酵母类核的几种成分(宫川县等。, 1995;纽曼等。, 1996;考夫曼等。, 2000). 核心成分之一是Abf2蛋白（Abf2p），它是人类线粒体转录因子TFAM的同源物。Abf2p在酵母中的功能是通过提供mtDNA包装功能来维持mtDNA所必需的。在体外试验中，它也适度刺激酵母转录(帕里西等。, 1993). 小鼠TFAM基因敲除显示胚胎死亡，线粒体DNA完全丢失(拉松等。, 1998)，但这通常被认为是转录起始受损的结果，转录起始会产生mtDNA复制引物。

其他酵母类核成分包括Rim1p，酵母单链DNA结合蛋白，以及一些被认为与类核维持无关的具有独立作用的蛋白质。这些蛋白质包括α-酮戊二酸脱氢酶亚基和乌头糖(考夫曼等。, 2000). 这些具有保守催化核心的双功能核编码酶似乎有可能随机获得额外功能，并在各种真核生物谱系中与线粒体DNA协同进化。这表明，与核仁相关的蛋白质在不同物种中的类型差异很大。

虽然mtDNA的遗传在芽殖酵母和哺乳动物之间存在显著差异，但有遗传和细胞生物学证据表明，哺乳动物的mtDNA也是以类核仁结构组织的(雅各布斯等。, 2000;莱赫蒂宁等。, 2000). 然而，只有我们最近首次证明Twinkle-EGFP与线粒体DNA在点状线粒体内结构中的特异共定位，才清楚地显示出人类线粒体中存在离散的线粒体DNA蛋白质复合物(斯佩尔布雷克等。, 2001). Twinkle与噬菌体T7引物酶/解旋酶基因4蛋白相似。Twinkle基因突变，C10或2与晚发型常染色体显性遗传病、进行性外眼瘫的形式相关，在分子水平上以多个mtDNA缺失的积累为特征。

线粒体是一个高度活跃和灵活的网络。这是通过线粒体的生长、融合和分裂以及向能量需求部位的主动运动来实现的。这确保了线粒体的适当数量和分布。由于缺乏合适的标记物来直接观察线粒体DNA在体内的表达，因此对线粒体DNA在这些过程中的分布和遗传研究相对较少，尤其是在哺乳动物细胞中。然而，近年来，许多参与线粒体分裂和融合机制的蛋白质已经被鉴定出来。果蝇属酵母和哺乳动物Fzo/线粒体融合蛋白是线粒体融合所必需的(Hales和Fuller，1997年;赫尔曼等。, 1998;桑特尔和富勒，2001年). 它们是跨膜GTPase，催化域暴露在细胞质中。

描述的负责线粒体分裂的第一个因素是秀丽隐杆线虫和哺乳动物动力相关蛋白Drp1（也称为Dlp1，Dymple；卡米莫托等。, 1998;斯米尔诺娃等。, 1998;拉布鲁斯等。, 1999;皮特斯等。, 1999)及其酵母同源物Dnm1(布莱扎德等。, 1999;Sesaki和Jensen，1999年). 该蛋白的突变导致线粒体塌陷成由长的相互连接的小管组成的核周聚集物。这可能是裂变和聚变平衡发生变化的结果(斯米尔诺娃等。, 2001). MDV1和FIS1酵母点作为Drp1（Dnm1）伙伴的遗传学筛选(费克斯等。, 2000;Mozdy公司等。, 2000;Tieu和Nunnari，2000年).

材料和方法

细胞培养和转染

如前所述培养HEK293EBNA、143B骨肉瘤、A549腺癌细胞和原代人成纤维细胞(斯佩尔布雷克等。, 2000). 细胞在转染前1-2天以40-70%的密度接种在六孔板中。根据制造商的方案，转染使用10μl脂质体胺（Lifefectamine，英国佩斯利生命科技公司）对293细胞、A549细胞和用1 ml Optimem（LifeTechnologies）稀释的成纤维细胞进行转染。转染后5小时，我们添加2毫升新鲜培养基，转染24小时后替换培养基。对于143B细胞转染，我们按照制造商的规范使用FuGENE 6（德国曼海姆罗氏公司）。

表达式构造

Twinkle-EGFP、Twinkle-MycHis和GFP-Drp1构造如前所述(斯米尔诺娃等。, 2001;斯佩尔布雷克等。, 2001)

免疫细胞化学结合共焦显微镜和时间推移表观荧光显微镜

Mitotracker Red（俄勒冈州尤金的分子探针）染色和细胞制备如其他地方所述(斯佩尔布雷克等。, 2000). 将细胞在37°C的PBS/3.7%甲醛/5%蔗糖中固定20分钟，用PBS洗涤两次，并使用Vectashield安装介质（Vector Laboratories，Burlingame，CA）安装。对于ICC，固定细胞在室温下在PBS/0.5%Triton X-100中裂解15分钟，在PBS中洗涤两次，并在PBS/3%BSA中封闭。对于Drp1和mtSSB的共定位研究，我们在ICC之前对样品进行脱水和再水合，如下所述，用于（5-溴-2-脱氧吡啶）BrdU标记。抗体在PBS/3%BSA中稀释。盖玻片与载玻片上的抗体溶液在室温下孵育1h。稀释如下：小鼠抗c-Myc mAb 9E10（Roche）1:1000稀释5 mg/ml储备液；兔抗人TFAM（R.Wiesner博士馈赠）1:200；兔抗mtSSB（M.Zeviani博士的礼物）1:100；兔抗POLG（加州圣克鲁斯圣克鲁斯，sc-5930）1:50；和兔子抗POLG2（P.Lestienne博士的礼物）1:400。用PBS清洗玻片三次，并用1:200倍稀释的次生生物素化抗体（抗鼠IgG或抗兔IgG，Vector Laboratories，Inc.；抗羊IgG（DAKO，Glostrup，Denmark））培养，如上清洗，并用1:200稀释的链霉亲和素-德克萨斯红/罗丹明或链霉亲和物-荧光素（Vector Laboratories Inc.）培养。所有固定样品均使用Perkin Elmer-Cetus/Wallac UltraView LCI系统（马萨诸塞州韦尔斯利）通过共聚焦扫描激光显微镜进行检查。共焦图像由UltraView 4.0软件处理，并使用Microsoft Photo Editor 3.01和Adobe Photoshop 6.0进一步处理，以获得具有最佳对比度/亮度和分辨率的适当部分。使用Microsoft Powerpoint组装单个图像，并再次使用Adobe Photoshop 6.0进行进一步处理，以获得最终打印的最佳分辨率。

对于延时成像，COS-7细胞在补充有10%胎牛血清的DMEM中生长。将细胞接种到玻璃底培养皿（Mat-Tek，Ashland，MA）上进行体内观察，并根据制造商的程序使用FuGENE转染试剂（Roche）进行转染。观察前，细胞在37°C下与0.1μM MitoTracker Red孵育10分钟。这些图像是在转染开始后18小时通过由Isee Inovision Corporation软件提供动力的冷却CCD相机（PXL；Photometrics）获得的。使用Plan 100×/12.5 NA油浸物镜在室温下每隔15秒采集一次时间推移图像。将各个延时帧导入UltraView 4.0软件，以获取“感兴趣区域”的图像，这些图像再次导出，并按上述方式进行进一步处理。为了测量线粒体和Twinkle-GFP运动，将所有单个帧导入NIH图像1.62。对于每个选定的线粒体，每15秒跟踪一个尖端，持续7分钟以上。根据测量的距离计算平均速度，包括线粒体未移动的点。结果表示为平均值±SE。

利用BrdU对线粒体DNA进行代谢标记

BrdU和单链DNA中BrdU特异性单克隆抗体来自罗氏公司。在BrdU标记缺乏细胞质胸苷激酶（TK−）的143B骨肉瘤细胞前1或2天，将其以低密度接种在盖玻片上。将BrdU添加到最终浓度为10μM，并将细胞孵育2–24小时。随后将细胞固定并裂解，如上所述进行免疫细胞化学。然后使用70、90和100%乙醇的连续洗涤进行脱水。使用多个PBS洗涤液对细胞进行再水化。DNA按说明变性(Davis和Clayton，1996年). 抗体孵育前，使用PBS中的3%BSA封闭盖玻片15分钟。使用抗BrdU单克隆抗体作为PBS/1%BSA中1:50的稀释液。使用马抗鼠-荧光素IgG作为二级抗体，PBS/3%BSA中1:200稀释液。随后将玻片用于ICC或直接安装。为了在ICC中使用抗Myc单克隆抗体检测Myc-tagged Twinkle，将BrdU-ICC载玻片在25°C的PBS/3.7%甲醛/5%蔗糖中固定10分钟，并在Myc-ICC之前在PBS中洗涤三次。抗Myc单克隆抗体孵育后，将载玻片与1:200生物素化抗鼠IgG作为二级抗体进行孵育，然后接种链霉亲和素-德克萨斯红。这导致生物素化抗鼠IgG与BrdU mAb的交叉反应很小或没有交叉反应，这可能是由于交联马抗鼠荧光蛋白IgG而无法实现的（对比图​图3，三、D和E、左下角和未发布的数据）。

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mtSSB或Twinkle阳性的线粒体内病灶是BrdU掺入的位点。将143B（TK−）细胞接种在低密度下24–48小时后，用BrdU标记MtDNA 24小时（A–C）或2小时（D–F）。BrdU特异性单克隆抗体（a和D）检测到BrdU掺入。随后处理A中显示的细胞用于mtSSB-ICC（B），而D中显示的在BrdU标记前24小时用Twinkle-MycHis构建物转染的细胞用于Twinkle-MycHis-ICC（E）。（C和F）分别是A+B和D+E的合并图像。结果显示，在大多数病灶中都有丰富而特异的BrdU标记，也对mtSSB或Twinkle进行了特异性染色，表明这些病灶是类核细胞。

免疫电子显微镜

为了进行免疫电子显微镜检查，HEK 293细胞生长在Termanox塑料皿上，用0.01%戊二醛和3.5%多聚甲醛固定在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH值7.2，并嵌入Lowicryl HM 20（英国斯坦斯特德Agar Scientific公司）。根据标准方法，用兔抗人TFAM抗体（1:400）和5-或10nm蛋白A-金通过间接免疫金标记对薄片进行染色，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。

线粒体的分离

将HEK293EBNA细胞在冷却的5ml Duonce匀浆器中以中速进行25次划动，以分离线粒体，基本上如所述(斯佩尔布雷克等。, 2000).

通过等密度梯度离心进一步纯化线粒体：将颗粒重新悬浮在1 mM EDTA、0.1%BSA和10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，其中含有0.8 M蔗糖，在同一缓冲液中从1到2 M蔗糖的连续蔗糖梯度上分层，并在80000×克收集线粒体，用2 vol的1 mM EDTA、10 mM Tris-HCl、pH 7.4稀释2 h，并在16000×克纯化的线粒体颗粒在−80°C下保存15分钟。

线粒体DNA核仁的分离与表征

我们修改了一个公开的酵母mtDNA核仁分离程序(纽曼等。, 1996). 简单地说，将纯化的线粒体在冰上解冻，再悬浮在NE2缓冲液中（0.25 M蔗糖、20 mM Tris-HCl、pH 7.6、2 mM EDTA、7 mMβ-巯基乙醇），并用0.5×NE2缓冲溶液等量稀释至最终浓度为5-7 mg线粒体蛋白/ml。将精胺（1.0 M）添加至最终浓度3 mM，通过添加20%的NP40至最终浓度0.5%来溶解线粒体。轻轻搅拌15分钟后，以12000×克在上清液（S0）和颗粒（P0）组分中放置20分钟。如上所述，重新悬浮颗粒部分。

接下来，将上清液和颗粒部分分层在梯度缓冲剂（20 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM EDTA，1 mM亚精胺，7 mMβ-巯基乙醇，1 mM-PMSF）中由3.5 ml 20%/2.5 ml 40%/1.8 ml 60%/0.9 ml 75%蔗糖组成的梯度上，并在111000×克对梯度进行分割并分析mtDNA和蛋白质的分布。含mtDNA的样品来自最初NP40提取的S和P组分，下文分别称为S-1和P-1。收集P-1样品，用2 vol冰冷梯度缓冲液稀释，用0.5%NP40再次处理15 min，然后以49000×克持续3小时，得到S-2和P-2。

在使用SDS-PAGE进行分析之前，将蔗糖梯度样品在4°C下与NE2缓冲液进行透析数小时，以降低蔗糖浓度

类核分析

通过聚合酶链式反应测定mtDNA在梯度中的分布。蛋白酶K处理后，通过乙醇沉淀提取mtDNA，并用特异性引物FR6 5′GGTGCACGCTATAAAGGTCG 3′和FR7 5′CCGATCAGGCGTTTG 3′扩增，扩增出与剑桥参考序列的碱基对3013–3698相对应的人类mtDNA的685碱基对片段（如上所述，斯佩尔布雷克等。, 2000).

通过SDS-PAGE在10%或14%聚丙烯酰胺凝胶上根据莱姆利（1970）或根据Schägger和Von Jagow（1987）.PAGE标记来自美国伯乐（加利福尼亚州赫拉克勒斯）。装载前，将所有样品在95°C的SDS样品缓冲液中加热5分钟（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，12%甘油，4%SDS，0.01%Serva Blue G，0.1 M DTT）。电泳后，用0.1%考马斯亮蓝在40%甲醇、10%醋酸中染色30分钟。在40%甲醇，10%醋酸中脱色，然后在10%甲醇、10%乙酸中脱色。考马斯染色凝胶是下一个银染色凝胶(莫里西，1981年). 免疫印迹分析基本上按照所述进行(斯佩尔布雷克等。, 2000). 使用的主要抗体和稀释液如下：小鼠抗c-Myc mAb 9E10（Roche）1:15000；小鼠抗COXII和鼠抗COXIV单克隆抗体（R.Capaldi博士馈赠）1:10000；兔抗人TFAM 1:10000；兔抗mtSSB 1:5000；兔抗POLG（Santa Cruz，sc-5930）1:2000；兔抗POLG2 1:10000；小鼠单克隆抗-EF-Tu（F.Henkler博士馈赠）1:500；和山羊抗组蛋白H2A（Santa Cruz，sc-8648）1:500。POLG阻断肽（Santa Cruz，sc-5930p）的使用量是抗体的10倍。如前所述，进一步处理印迹(斯佩尔布雷克等。, 2000). 对于较大的13cm凝胶，如图所示​图4，4C和D，所有样品都在相同的凝胶上运行，但由于凝胶的大小，它被切成两块，每一半被吸干到一个单独的膜上。两种膜总是与抗体一起孵育。

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内源性TFAM和mtSSB在rho-zero细胞中的分布和表达水平。（A） ICC用于A549 rho+和rho-zero（C）细胞内源性TFAM。（B） ICC用于A549 rho+和rho-zero（D）细胞内源性mtSSB。结果显示可检测的TFAM蛋白水平显著降低。请注意，C的曝光和图像增强与A中的不同，以便在每种情况下获得信息最丰富的图像。

结果

虽然mtDNA-蛋白复合物是多年前从哺乳动物细胞中分离出来的（参见。，阿尔布林等。, 1977)，这些络合物的特征仍然很差。Twinkle是一种与噬菌体T7基因4蛋白（T7 gp4）相似的蛋白质，是第一个在哺乳动物细胞中与线粒体DNA在体内特异性共定位的蛋白质(斯佩尔布雷克等。, 2001)从而证实哺乳动物中存在高度组织化的类核。在此之前，仅观察到线粒体融合和裂变装置的蛋白质，如动力学相关蛋白1（Drp1；斯米尔诺娃等。, 2001)尽管迄今为止，这些蛋白质尚未显示与线粒体DNA共定位。其他蛋白质，如线粒体转录因子TFAM和线粒体聚合酶POLG似乎均匀分布在线粒体内(斯佩尔布林克等。, 2000和未发表的观察结果），但这些结果仅基于GFP报告分析。

内源性TFAM和mtSSB，但不包括POLG和POLG2，它们在人类线粒体中的核仁中特异性地与Twink结合

作为进一步确定类核蛋白组成的第一种方法，我们检测了具有已知mtDNA维持功能的各种内源性线粒体蛋白的体内定位。为此，我们使用免疫细胞化学（ICC）和抗TFAM、线粒体单链DNA结合蛋白mtSSB、POLG及其辅助亚单位POLG2（也称为β亚单位）的抗体。对未转染细胞或瞬时转染Twinkle-GFP构建物的细胞进行了研究。除POLG抗体外，所有抗体都显示出高度特异性，并且在带有分离线粒体的Western blot上几乎没有背景染色（参见斯佩尔布雷克等。, 2000和未发布的数据）。

图​图11显示内源性TFAM和mtSSB都有点状线粒体染色模式，用Mitotracker Red进行反染后，这些细胞中的线粒体网络结构不典型​（图1，1（C和F）表明，TFAM和mtSSB都集中在线粒体内的特定病灶中，这与Twinkle-GFP观察到的情况类似。对于骨肉瘤和肺癌细胞以及原代或转化的成纤维细胞等各种人类细胞系来说，情况都是如此，在小鼠3T3细胞（未发表的数据）和COS7细胞（见下文）中也观察到了这种情况。尤其是TFAM，虽然集中在点状结构中，但也显示出较弱、更均匀的线粒体荧光，揭示了线粒体网络，如Mitotracker染色后所观察到的那样（另请参见图​图2A）。2A） ●●●●。

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内源性TFAM和mtSSB在线粒体内病灶中的定位。143B骨肉瘤细胞在盖玻片上生长1-2天，用Mitotracker Red（B和E）染色。ICC使用多克隆兔抗体和次级荧光素标记抗体检测TFAM（A）和mtSSB（D）。（C；TFAM，F；SSB）合并荧光图像。（G） HEK293细胞线粒体中TFAM的免疫标记。七个金粒子沿着300 nm的线粒体聚集。线粒体（圆形）外的背景标记很少。（H） G中方框区域的放大，显示横切嵴（C）附近线粒体基质中的TFAM标签（箭头）。

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用内源性TFAM、mtSSB和POLG2对Twinkle-EGFP进行染色。143B骨肉瘤细胞（或A549肺癌细胞）生长在盖玻片上，并转染Twinkle-EGFP构建物。转染ICC后1至2天进行TFAM、mtSSB或POLG2检测。二级抗体具有罗丹明或德克萨斯红荧光基团。（A、D和G）分别用于TFAM、mtSSB和POLG2的ICC。（B、E和H）与显示Twinkle-EGFP表达的A、D和G的细胞相同。（C、F和I）合并荧光图像，分别显示Twinkle-EGFP与TFAM、SSB和POLG2的共定位。如G和H中箭头所示，一些但并非所有含有明显最高POLG2浓度的病灶也含有Twinkle-EGFP，但总体POLG2荧光比TFAM或mtSSB荧光更均匀。

与TFAM和mtSSB相比，内源性POLG和POLG2显示出几乎一致的线粒体荧光，与Mitotracker染色非常相似。POLG2确实在线粒体内显示出一些浓度较高的明显病灶（见图​图22和以下）。很难检测到高浓度POLG的可能病灶，因为抗体只发出微弱的线粒体荧光，而ICC中有一些背景（未公布的数据）。

作为研究类核蛋白组成和以更高分辨率定位类核的另一种方法，我们使用免疫电子显微镜。用TFAM抗体染色后，免疫金标记通常集中在线粒体基质内的区域（图​（图1，1、G和H）。大多数线粒体上都有补丁，几个金颗粒紧密相连，长时间伸展，没有标记。在一些情况下，无嵴区域的金颗粒与可能含有核酸的丝状结构有关（未公布的数据）。

为了更精确地确定TFAM和mtSSB的定位，我们用Twinkle-GFP转染骨肉瘤细胞，并在转染后第2天将细胞置于ICC。结果表明，Twinkle-GFP与TFAM和mtSSB都有明显的共定位（图​（图2，2，A–F）强烈表明内源性TFAM和SSB优先存在于线粒体核仁中。POLG2浓度明显最高的Foci似乎也与Twinkle-GFP共定位（图​（图2，2，G–I，用箭头表示）。

我们之前使用溴化乙锭染色来寻找Twinkle与mtDNA的共定位(斯佩尔布雷克等。, 2001)，但这种染色不像Twinkle定位那样离散，可能是因为线粒体RNA的共染色。我们现在使用BrdU代谢标记mtDNA，然后免疫检测含有BrdU的变性DNA，ICC用于mtSSB或ICC用于与MycHis表位标签共转染的Twinkler。BrdU是一种胸苷类似物，一旦被胸苷激酶磷酸化，就可以特异性地并入DNA中。在细胞质胸苷激酶（TK−）缺乏同时保留线粒体同工酶的细胞中，可以很容易地检测到特定的mtDNA染色（见Davis和Clayton，1996年以及其中的参考）。然而，BrdU标记的一个缺点可能是，这种类似物在mtDNA中的掺入以前被证明主要发生在核周线粒体中，这表明mtDNA复制的空间调节(Davis和Clayton，1996年). 据推测，这是由于细胞核编码的一个或多个因子受到限制，需要线粒体输入。为了测试143B（TK−）细胞中的BrdU标记，我们标记细胞2和24小时，并使用单克隆BrdU特异性抗体检测BrdU掺入。我们发现，即使在标记2小时后，BrdU掺入仍然非常有效，mtDNA在整个细胞中的标记或多或少是一致的（参见图​图3）。三). 这意味着BrdU标记可以作为一种高度特异的DNA“染色剂”，以证明病灶中的特异性结合，我们目前暂时将其称为核仁。这些实验的结果如图所示​图3。三在这个特殊的实验中，mtSSB ICC显示出更均匀的线粒体荧光，但病灶仍然很容易被发现。这种更均匀的染色在我们用这种抗体观察到的正常变异范围内（未公布的数据）。然而，mtSSB和Twinkle-MycHis与BrdU掺入位点有很好的共定位，明确证明Twinkle和mtSSB与mtDNA共定位。Tfam也获得了类似的结果（未公布的数据）。由于BrdU标记是代谢性的，所以一些病灶染色对Twinkle或mtSSB呈阳性并不奇怪，但对BrdU无阳性。标记24h后mtSSB或Twinkle阳性和BrdU阴性的病灶数量通常小于标记2h后的病灶数量。然而，即使在2小时后，大多数mtSSB或Twinkle阳性病灶在相当大比例的培养细胞中已呈BrdU阳性。这方面的一个例子如图所示​图3，三，D–F，用于转染细胞。在rho-zero细胞中未观察到BrdU掺入（未发表数据）。因为在24小时的标记期后，大多数BrdU掺入位点仍与mtSSB或Twinkle共定位，结果强烈表明，类核相关蛋白不仅仅是复制和/或修复后分离的DNA合成/修复工厂。在控制良好的实验条件下进行进一步的BrdU标记研究，对于揭示线粒体DNA合成和维持机制的动力学非常有用。

类核蛋白在rho-zero细胞中不再形成类核结构

类核可以通过蛋白质和蛋白质与DNA的相互作用结合在一起。因此，在没有mtDNA的细胞（rho-zero细胞）中，可能会出现核仁结构的破坏。由于mtDNA的缺失，ICC测试的各种蛋白质给出了不同的结果（图​（图4）。4). TFAM水平出现严重下降（图​（图4，4，A和C，比较相同遗传背景的rho+和rho-zero细胞），尽管剩余染色确实有点点状。尽管大多数剩余的TFAM染色是线粒体染色，但它并没有严格地与Twinkle-GFP共定位（未发表的数据）。ICC很容易检测到线粒体SSB。rho-zero细胞的染色（比较图​图4，4与rho+细胞染色形成鲜明对比的是，B和D）显示出更均匀的线粒体荧光，显示出与Mitotracker染色后观察到的线粒体网络相似的线粒体网络（未发表的数据）。POLG和POLG2均显示出一致的线粒体荧光，与含有线粒体DNA的细胞相比，似乎没有下调或上调（未公布的数据）。

从培养的人类细胞中生化纯化类核表明TFAM、mtSSB、POLG和POLG2与mtDNA部分共纯化

ICC结果确定了纯化线粒体核仁中应存在的一些蛋白质。为了生化纯化类核，我们使用等密度颗粒纯化的线粒体，然后进行两个连续的NP40裂解和蔗糖密度梯度离心步骤（见图​图5A）。5A） ●●●●。使用mtDNA PCR扩增监测初始纯化步骤和梯度组分，TFAM作为Western blots上的核蛋白标记。细胞色素c氧化酶亚基II（COXII）和IV（COXIV）被用作可能的内膜污染的标记物。第一个裂解步骤的典型结果显示了大多数蔗糖梯度级分，如图所示​图5B。5B.在大型SDS-PAGE Schägger-von Jagow凝胶上，仅使用具有代表性的蔗糖梯度组分，通过Western blotting和总蛋白染色进行更广泛的后续分析。除了TFAM和COXII外，我们还检查了mtSSB、POLG、POLG2和线粒体延伸因子Tu（mtEF-Tu）的纯化情况，作为另一个阴性对照，因为它参与翻译，据我们所知不参与mtDNA复制或修复。因此，毫不奇怪，发现mtEF-Tu主要存在于S1组分中，这也很好地说明了我们观察到的各种蛋白质的差异富集。如前所述，采用我们的程序的酵母核仁分离程序，含有大多数mtDNA和铜纯化蛋白的蔗糖梯度组分是从使用0.5%NP40溶解线粒体后的不溶性颗粒组分中提取的。含有mtDNA的可溶性NP40组分在低密度梯度中持续纯化。此外，正如对酵母核仁的观察，第一个NP40颗粒梯度仍然显示出大量COXII和COXIV与mtDNA和TFAM的铜净化作用，这表明受到了膜蛋白复合物的污染。对这些含有mtDNA的组分进行第二次NP40处理，并对所得NP40颗粒进行第二个蔗糖密度梯度处理后，mtDNA组分中只剩下很少或没有COXII和COXIV，但现在在可溶组分中检测到。此外，各种蛋白质，如我们假设的腺嘌呤核苷酸转运体亚型（ANT），在第一个“颗粒”梯度P1中仍高浓度存在（图​（图5D）。5D） ●●●●。这些在第二次裂解和梯度步骤后不再被检测到，这与核仁的进一步纯化和非特异性蛋白质的损失相一致。与此形成鲜明对比的是，在第二个NP40裂解步骤中，几乎没有任何TFAM从类核部分中丢失（图​（图5，5，C和D），表明与COXII、ANT和其他蛋白质相比，该蛋白质与线粒体DNA紧密相关并特异性保留。

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从培养的人类细胞中生化分离类核。HEK 293细胞生长至～80%汇合处，并通过低速离心分离。线粒体分离程序和核仁分离程序的后续步骤如A所示。还指出了其他面板中使用的各种组分的缩写。（B） A.（C）中所示的各种纯化步骤的蔗糖梯度分析。使用针对线粒体蛋白质的各种特定抗体，对分离程序每个步骤的组分进行更彻底的分析。本例中使用的S1部分来自蔗糖梯度的顶部。请注意，观察到一种主要的交叉反应非POLG蛋白（用星号表示），其迁移率略高于POLG本身（用空心箭头表示）。交叉反应物种在组分mt、S0、P0和S1中突出，而在P1中仅微弱可见，在P2中不再可见。POLG在P0中非常微弱，而在P1和P2中更为显著，表明其富集。两个星号表示TFAM分解产品（有关进一步说明，请参阅正文）。（D） 与C使用的样品相同，但凝胶是考马斯胶，随后银染以显示所有蛋白质。右侧以kDa表示蛋白质标记。我们根据其分子量和丰度，通过比较凝胶与C和腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）中显示的免疫印迹，初步确定了TFAM蛋白。还应注意，由于凝胶负载限制，最终P2组分中的总蛋白浓度显著低于P1组分，还应注意P2中的条带可能略有上移，这可能是因为不完全透析去除多余的蔗糖。

我们使用的TFAM抗体识别出两种TFAM，其中较低的一种被部分降解，因为当我们在纯化过程中加入蛋白酶抑制剂混合物时，很难检测到它（未发表的数据）。此外，与mtDNA共纯化的TFAM大多为全长，与其他部分中发现的TFAM形成对比。线粒体裂解物的DNAseI处理导致TFAM对降解的敏感性增加，并进一步导致形成额外的低分子量物种（未发表的数据）。在第二次裂解和梯度步骤后，MtSSB主要从类核部分中丢失。

尽管有ICC的研究结果，但结果也表明，TFAM不仅与mtDNA核仁发生最后一步的共纯化，而且还与少量POLG2发生共纯化。有趣的是，POLG几乎完全与核仁铜纯化，这与该蛋白的ICC结果相矛盾。然而，商业POLG抗体似乎与线粒体组分中的其他几种蛋白质发生交叉反应，其浓度远高于POLG（见图​图5C）。5C） ●●●●。然而，用于免疫的POLG肽（未发表的数据）可在Western blot上特异性抑制对一种具有预期大小的蛋白质的识别，从而有可能对POLG进行阳性识别（如图中箭头所示​图5C，5C、 另请参见图图例）。

最后，作为核仁制剂纯度的控制，我们检查了核染色质蛋白污染的可能性。使用商业多克隆抗体，我们无法在线粒体制剂中检测到任何人类组蛋白2A（H2A），而在核提取物中明确检测到该蛋白（未发表数据）。第二，我们在等密度梯度纯化后固定的线粒体制备物显示出DAPI染色的线粒体内斑点，可能是核仁，但没有任何线粒体外DNA物质表明存在染色质。

活细胞中的类核动力学

由于首次能够使用GFP标记的Twinkle可视化哺乳动物的类核，我们试图通过时间推移荧光显微镜来解决活细胞中类核动力学的基本问题。延时结果首先表明，Twinkle-GFP点状突起不是静态的，而是移动的，遵循线粒体动力学。在室温下观察时，大多数线粒体（93%）表现出短波振荡运动。这种运动并不局限于一个方向，而是由多条轨迹组成。它还表现为线粒体形状的改变和/或其部分的拉伸和收缩。在我们的实验系统中，线粒体在任何方向上位移的计算速度为0.01±0.0007μm/s（7个线粒体，149个时间点）。一小部分（7±0.8%）线粒体的运动速度超过0.05μm/s，主要是跳跃式单向运动。每个线粒体有～2.3±0.4个Twinkle-GFP斑点（n=58）。它们的运动在数量和质量上都与线粒体的运动相似。非分裂和分裂的Twinkle GFP病灶都在线粒体内振荡，其位移速度为0.01±0.0008μm/s（5个Twinkle GFP点，110个时间点），与线粒体的整体速度相似。这些结果强烈表明核仁的膜结合，与之前关于线粒体DNA通过D-loop区域的膜结合的建议一致（另见阿尔布林等。, 1977). 使用Twinkle-GFP和ICC，我们还观察到了Twinkle、TFAM和mtSSB的最小尺寸，其中包含直径为-0.1–0.3μm的斑点。最大的含有Twinkle的斑点直径通常高达0.8–1.0μm，并且通常是不对称的。最重要的是，这些较大尺寸的结构在几次被观察到分裂成几个较小尺寸的包含斑点的闪烁体（如图中的实心箭头所示​图6A），6A） 表明核仁分裂事件。虽然我们有时确实看到较小的斑点明显地结合在一起形成较大的斑点，但这通常是以前在较大的集合中聚集在一起的类核元素的明显重新结合（另请参见图​图6A）。6A） ●●●●。第三个观察结果是，在没有线粒体分裂的情况下，可以进行核仁分裂（另请参见实心箭头图​图6A）。6A） ●●●●。然而，在67%的分裂线粒体中，核仁似乎位于线粒体分裂部位或附近，并可能显示出明显的伴随分裂或向子线粒体的再分配（图中的开放箭头​图6A）。6A） ●●●●。另外，在细胞外周，我们确实观察到了清晰的线粒体分裂事件，没有核仁分裂，核仁分布在线粒体的整个长度上，因此每个子线粒体都会有一个或多个核仁（图​（图6B，6B、 箭头表示裂变事件）。综合结果表明，线粒体融合或分裂后，线粒体DNA被分配或重新分配，以确保适当的遗传。尽管我们用于延时成像的细胞在细胞外周有效地是二维的（L.G.和A.M.vdB.，未发表的数据），我们试图通过对线粒体分裂机制的一个组成部分Drp1、，使用mtSSB。在这种情况下，我们使用GFP-Drp1，而mtSSB是使用ICC可视化的。此实验如图所示​图7，7，明确证明mtSSB-核型病灶与Drp1基本上没有共定位。Drp1-GFP可以在线粒体收缩的部位观察到，线粒体收缩的任何部位都有mtSSB病灶（图中放大的部分用实心箭头表示​图7C）。7C） ●●●●。此外，Drp1也经常出现在线粒体尖端的最近裂变事件的位置（如箭头所示），与报告的Drp1结果非常相似秀丽线虫(拉布鲁斯等。, 1999). 通过将GFP-Drp1和Twinkle与c-Myc表位标签（可由ICC和Tfam ICC检测到）共转染，并通过转染Twinkle-GFP结合使用多克隆Drp1特异性抗体检测内源性Drp1，也进行了同样的观察（未公布的结果）。使用不同荧光标记的Drp1和Twinkle进行的时间推移实验应能阐明核仁和线粒体分裂事件的确切顺序。

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核仁和线粒体动力学。研究了MitoTracker红染色和Twinkle-GFP转染COS7细胞的类核动力学。Mitotracker显示为均匀的线粒体染色，而Twinkle-GFP显示为较亮的线粒体内斑点。（A） 细胞的一部分，有几个核仁分裂，用实心箭头表示。此外，它还显示了一个明显的核仁重新分布，移动到一个似乎即将分裂的子线粒体中（用开放箭头表示）。在A和B中，每隔15秒显示一帧，从左到右，从上到下。（B） 两次线粒体分裂事件（实心箭头），其中核仁的位置使每个子线粒体至少有一个新的核仁元素。尽管核仁在分裂后看起来接近尖端，但它们似乎并不积极参与分裂事件本身。

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Drp1不与线粒体核仁共定位。为了进一步证明核仁被排除在线粒体分裂位点之外，我们观察了mtSSB ICC（A）染色的核仁在人类骨肉瘤细胞中与线粒体分裂蛋白Drp1（此处用作GFP融合蛋白（B））的共定位。合并图像（C）显示Drp1-GFP与mtSSB病灶普遍缺乏共定位。在C所示的细胞放大切片中，显示了一个含有Drp1-GFP的线粒体收缩位点，mtSSB位于这个推测的未来裂变位点的任一位点（实心箭头）。由开放箭头指示的是线粒体尖端的两个微弱的Drp1 GFP焦点，提示最近的分裂事件。

讨论

本文的结果为研究培养的人类细胞中线粒体DNA核仁的组织和动力学提供了许多有价值的见解。通过原位细胞生物学方法和生物化学方法首次明确表明，哺乳动物细胞中的核仁是多个线粒体蛋白与线粒体DNA的稳定组合。此外，研究结果表明，类核是分裂并遵循线粒体网络动力学的动态结构，可能是为了确保线粒体生长和分裂过程中mtDNA传递给子线粒体。MtSSB没有与Drp1共定位，Drp1通常集中在过去或未来线粒体裂变的部位。除了对哺乳动物线粒体DNA组织的基本考虑外，核仁结构和动力学的研究也有助于我们更好地理解线粒体DNA维护的重要方面，例如人类线粒体疾病中线粒体DNA的分离和互补。

人类细胞中的线粒体核苷酸是多种蛋白质与线粒体DNA的组装体

核仁是包含线粒体DNA和蛋白质的离散结构的第一个建议来自主要涉及酵母的研究酿酒酵母直到最近，只有DAPI染色才表明哺乳动物细胞中存在类似的组织(佐藤和黑泽明，1991年). Twinkle是第一个在体内被明确鉴定为与mtDNA核仁相关的人类线粒体蛋白的蛋白质(斯佩尔布雷克等。, 2001).

在使用GFP标记对人类线粒体复制蛋白（如POLG、POLG2和TFAM）进行定位研究的基础上，我们先前得出结论，这些蛋白都没有与线粒体DNA特异性共定位(斯佩尔布雷克等。, 2000和J.N.S.，未发表的意见）。然而，出于各种原因，我们特别质疑TFAM的结果。首先，GFP方法通常会高度过度表达感兴趣的蛋白质，而GFP标签可能会掩盖参与特定核仁相互作用的蛋白质区域或干扰适当的蛋白质折叠。其次，令人信服的是，酵母TFAM同系物Abf2p被证明是酵母线粒体类核蛋白(纽曼等。, 1996;考夫曼等。, 2000). 第三，酵母Abf2p和人TFAM对DNA的结合特异性低，但结合亲和力高，并且与细菌组蛋白样蛋白HU和真核生物高迁移率群蛋白相似(Diffley和Stillman，1991年,1992;费希尔等。, 1992;纽曼等。, 1996)，表明DNA包装中的功能类似于核组蛋白。第四，哺乳动物线粒体中的TFAM蛋白水平最近被认为比以前认为的要高得多，假设TFAM以30个碱基对的间隔结合，就足以完全包裹线粒体DNA(高松等。, 2002). 最后，两种相关的哺乳动物线粒体转录因子，类似于酿酒酵母线粒体RNA聚合酶特异性因子（Mtf1p）最近被鉴定出来，并在体外实验中显示可以极大地刺激TFAM依赖的转录激活(麦卡洛赫等。, 2002;法尔肯伯格等。, 2002). 研究表明，新的转录因子与线粒体RNA聚合酶相互作用，进一步的实验表明它们对转录起始很重要(法尔肯伯格等。, 2002)，类似于Mtf1p(卡洛克等。, 2002). 这些发现首次表明了哺乳动物mtDNA转录中除TFAM以外的转录因子的明显必要性。然而，通过TFAM包装mtDNA也可能对转录和复制很重要，类似于组蛋白对核基因的调节，组蛋白本身通过蛋白质修饰进行调节（参见。，Marmorstein，2001年).

因此，我们首次证明了内源性TFAM和mtSSB与Twinkle在线粒体内病灶（也包含mtDNA）中的共定位。TFAM和mtSSB也集中在病灶中，没有转基因表达的Twinkle-EGFP，表明它们是类核的固有部分。这也与我们的免疫电镜结果显示的TFAM的集中定位相一致。此外，线粒体中免疫标记区域的大小与酵母中核仁的报告大小相符(宫川县等。, 1987).

TFAM和SSB均具有良好的DNA结合蛋白特征（参见上文TFAM和。，库尔特等。, 1994)在我们的类核制剂中，用mtDNA进行铜提纯，尽管程度不同。TFAM在第一步和第二步梯度纯化中都得到了特异性保留，而我们认为受到污染的其他蛋白质在第二步纯化中丢失了。SSB保留得不太好，在我们的最终类核制剂中很难检测到。因为mtSSB是一种对单链DNA具有特异性的结合蛋白，它在类核中的原位存在可能是单链DNA区域（如D环）的结果(泽维亚尼语等。, 1995). mtSSB的损失可能是纯化过程中这些单股结构部分损失的结果。值得注意的是，根据ICC，大多数（如果不是全部的话）类核都含有TFAM、mtSSB和Twinkle，这表明这三种蛋白质都是类核的结构成分，可能也稳定和保护mtDNA。

POLG和POLG2的结果不太直观。POLG2 ICC的荧光基本一致，但也有一些病灶的POLG2浓度明显较高。大多数但并非所有这些病灶也包含Twinkle。一个有吸引力的假设是，POLG2病灶代表着积极复制的线粒体基因组。这种情况下的ICC结果与生化纯化数据一致，生化纯化数据表明大多数POLG2不存在于类核部分中。相反，POLG ICC显示出均匀的线粒体荧光，而生化纯化显示，在核仁组分中POLG显著富集。这种不一致性可以用POLG抗体的低亲和力非特异性结合来解释，推测在ICC期间也能识别至少一种非核线粒体蛋白。尽管核仁富集，但POLG浓度可能较低，因为在对核仁组分进行SDS-PAGE后，在总蛋白染色中无法清楚区分正确大小的蛋白质。这些数据可能表明，POLG与POLG2一样，主要存在于DNA合成或修复的位点。因为POLG和POLG2已被证明具有物理交互作用，并且通常具有铜化作用(王等。, 1997)，结果也表明POLG2大量过剩。这可能是一种保护机制，以确保POLG始终能找到其合作伙伴，这已被证明可以提高聚合酶的保真度和处理能力(卡罗德瓜斯等。, 1999;林等。, 1999). 这也可能表明POLG2在线粒体内除了作为加工因子的作用外，还有其他功能。尽管POLG和POLG2至少部分与mtDNA共纯化并不奇怪，因为它们显然与mtDNA的维持有关(1989年4月;艾扬格等。, 1999,2002;斯佩尔布雷克等。, 2000)，我们在这里提供的数据不支持这些是结构类核蛋白的假设。

在没有线粒体DNA的情况下，核仁完整性丢失，这表明Twinkle、TFAM和SSB与线粒体DNA的相互作用对于它们在线粒体内的离散病灶中的共定位至关重要。最清楚的证明是，mtSSB在rho-zero细胞中几乎均匀的线粒体分布。TFAM水平与mtSSB或POLG和POLG2水平相比严重降低。这与之前的研究一致，这些研究表明TFAM蛋白水平和mtDNA水平之间存在着密切的相关性，使用rho-zero细胞系、二脱氧胞苷治疗后部分耗尽的细胞系、来自mtDNA缺失患者的材料和杂合TFAM敲除小鼠(拉松等。, 1994;波尔顿等。, 1994;拉松等。, 1998). 这强烈表明，TFAM蛋白的稳定性和周转取决于其与mtDNA的相互作用，并且我们观察到TFAM降解产物的出现明显依赖于DNA结合的缺乏，这也支持了这一观点。

类核动力学

在酵母线粒体遗传学中，已经证明分离单元的数量明显小于mtDNA分子的数量，但或多或少等于DAPI染色观察到的mtDNA-核仁结构的数量。这不仅证明了类核含有一个以上的线粒体DNA分子，而且清楚地表明类核是线粒体DNA遗传的单位。

这里我们展示了Twinkle-GFP的体内行为和分布，这表明人类线粒体中含有Twinkle的元素，我们在这里显示含有mtDNA，是mtDNA的可遗传元素。大多数线粒体含有多个Twinkle-GFP点，似乎在分裂时分布在“子”线粒体之间。

我们很容易推测，我们观察到的最小大小的核仁是含有线粒体DNA单拷贝的蛋白质-DNA结构。有趣的是，最近根据线粒体DNA特异性FISH实验得出结论，线粒体DNA的多个拷贝通常聚集在线粒体网络内(马吉安图等。, 2002). 同样在这种情况下，可以看到可能由单个线粒体DNA分子组成的单个小点。然而，在这一点上，无论是以前发表的结果还是我们的结果都不能排除这样的可能性，即最小可见结构实际上是核仁的最小尺寸，但仍然包含多个mtDNA拷贝。

正如FISH实验所观察到的，也可以在我们之前发表的图片中看到(斯佩尔布雷克等。, 2001;马吉安图等。, 2002)，mtDNA类核经常定位在线粒体的尖端或收缩位点或附近，这表明可能与Drp1有关。Drp1在线粒体内外循环，但在线粒体外膜上时，它定位于过去和未来发生断裂的地方(范德布利克，2000). 我们没有注意到SSB（或Twinkle）和Drp1之间有任何显著的协同定位。这表明类核蛋白不是分裂机制的活跃参与者。然而，Twinkle遵循线粒体动力学，可能在线粒体DNA的主动分离中发挥重要作用。

致谢

J.N.S.感谢Howy Jacobs、Ian Holt和Anu Wartiovaara的许多有益评论和讨论。这项工作得到了芬兰科学院卓越中心项目、芬兰科学院Life2000项目的部分支持，芬兰科学院向J.N.S.提供了80939和80936笔资金，Sigrid Jusélius基金会向J.W.提供了资金，美国心脏协会向L.G.提供了博士后奖学金。

使用的缩写：

图纸1动力相关蛋白1
溴化铀5-溴-2-脱氧尿苷
（E） GFP公司（增强）绿色荧光蛋白
国际协调委员会免疫细胞化学
MtSSB/SSB型线粒体单链DNA结合蛋白
POLG公司聚合酶γ
POLG2型POLG的辅助亚单位
TFAM公司线粒体转录因子A

脚注

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc。E02–07–0399。文章和出版日期为www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E02–07–0399。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会