肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种影响免疫反应、增殖、分化和凋亡的强大细胞因子(6). TNF-α的这些作用由几种信号转导途径介导，包括半胱氨酸蛋白酶的激活、NF-κB途径和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。TNF-α功能失调与许多疾病的病理学有关，包括类风湿性关节炎、克罗恩病和一些神经病理学。因此，了解TNF-α的信号转导机制非常重要，因为这一知识将有助于为这些疾病设计新的治疗策略。
TNF与TNF受体-1（TNF-R1）的结合导致受体三聚体化，并将适配器蛋白TRADD募集到受体的细胞质域(6). TRADD作为一种支架蛋白，招募FADD、RIP1和TRAF2。相反，TNF-R2直接与TRAF1结合，TRAF1随后招募TRAF2。这些衔接蛋白在与受体结合的复合物中启动信号转导途径。因此，凋亡和抗炎反应是由TRADD激活caspase 8介导的(43). 相反，抗凋亡和炎症反应是通过TRAF2激活MAPK通路介导的(44)TRAF2加RIP1的NF-κB通路(11,19).
细胞对TNF的炎症反应部分通过转录因子AP-1和NF-κB组对基因表达的调节来介导(2). NF-κB信号转导途径由TNF受体直接参与。相反，AP-1转录因子组通过涉及MAPK的间接机制激活。AP-1的激活由至少两个调控事件介导。首先，一些AP-1蛋白（例如c-Jun）由即时早期基因编码，这些基因在TNF处理细胞后转录诱导。其次，一些AP-1蛋白（例如c-Jun）被翻译后修饰以增加转录活性。不同MAPK在这些过程中的相对作用尚不清楚。例如，c-Jun表达的转录诱导可能由启动子中的几个MAPK应答元件介导，包括MEF2，一个结合c-Jun的共识AP-1位点，和一个结合c-Jun/ATF2异二聚体的非共识AP-1部位（Jun2 TRE）(30). p38 MAPK可磷酸化并激活MEF2(15)，c-Jun新罕布什尔州2-末端激酶（JNK）可磷酸化并激活c-Jun(10,20)p38 MAPK和JNK都能磷酸化并激活ATF2(14,22,27,28,37). 总之，这些数据表明TNF对AP-1活性的调节可能涉及MAPK的协同作用。
本研究的目的是检测JNK在TNF处理的细胞中的作用。众所周知，TNF通过TRAF2启动的途径激活JNK(44). 虽然ASK1在肿瘤坏死因子信号传导的后期被认为具有作用，但该途径中的MAPK激酶激酶尚未被定义(33). 已确定MAPK激酶MKK7对TNF引起的JNK活化至关重要(34). 然而，激活的JNK在TNF处理的细胞中的作用尚不清楚。基因中断研究表明，TNF刺激的细胞凋亡不需要JNK(35). 在这里，我们证明JNK对AP-1转录因子组的TNF调节至关重要。JNK缺陷细胞AP-1活性的丧失导致TNF治疗后细胞反应的明显缺陷。
材料和方法
材料。
重组小鼠TNF-α、p38抑制剂PD 169316、髓鞘碱性蛋白和[γ-32P] ATP分别来自R&D Systems、Calbiochem、Sigma和Pharmacia Amersham。重组谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-c-Jun（残基1至79）(10)和GST-ATF2（残基1至109）(14)在细菌中表达并通过亲和层析纯化。
组织培养和细胞提取物的制备。
野生型（WT），Jnk1号机组−/− Jnk2号机组−/−(Jnk公司−/−)、和Mkk4型−/− 市场7−/−(Mkk公司−/−)从胚胎第13.5天的小鼠胚胎中建立成纤维细胞(34,35). 将细胞保存在37°C的Dulbecco改良的Eagle培养基中，该培养基补充有10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（生命科技），温度为37°C，湿度为5%CO2在使用质粒表达载体和脂多卡因试剂（Invitrogen）的瞬时转染试验中，JNK在细胞中表达。利用小鼠干细胞逆转录病毒载体（MSCV）-内核糖体进入位点绿色荧光蛋白载体进行逆转录病毒转导实验，并通过流式细胞术分离转导细胞。JNK1和JNK2逆转录病毒载体是通过将cDNA作为钝端片段亚克隆到生态载体MCSV内部核糖体进入位点-绿色荧光蛋白的RI位点(46).
在用TNF-α（10 ng/ml）治疗前，从缺乏血清的细胞（2 h）中制备细胞裂解物。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并用裂解缓冲液（25 mM HEPES[pH7.5]、0.3 M NaCl、0.2 mM EDTA、0.1%Triton X-100、0.5 mM二硫苏糖醇、20 mMβ-甘油磷酸、0.1 mM钒酸盐、亮氨酸蛋白酶[2μg/ml]、抑肽酶[2μg/ml]、1 mM苯甲基磺酰基氟化物）提取细胞（4°C下10分钟）。使用Eppendorf微型离心机（14000 rpm，4°C下10分钟）对提取物进行澄清。上清液中总可溶性蛋白的浓度通过Bradford方法（Bio-Rad）进行定量。将这些提取物用于免疫印迹分析和蛋白激酶测定。
荧光素酶报告基因分析。
根据制造商的建议，使用脂质体试剂（Invitrogen）进行转染分析。用0.2μg GAL4融合蛋白表达载体pGAL4、pGAL4-ATF2或pGAL4-ATF2-Thr69Ala/Thr-71Ala转染细胞(14)，0.5μg荧光素酶报告质粒pG5E1bLuc(14)和0.05μg控制载体pRL-null（Promega）。与0.2μg pCMV-MEKK1共转染的效果(40)，pCDNA3-标记-MKK6（Ser207Glu/Tr211Glu）(28)，或pCDNA3-HA-MLK3(40)已检查。使用空表达载体进行对照研究。使用Dual-luciferase Reporter分析系统（威斯康星州麦迪逊市Promega公司）进行细胞提取物和荧光素酶定量。
蛋白激酶活性的测量。
使用JNK（FL；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、p38 MAPK、p38和细胞外信号调节激酶（ERK）抗体通过免疫沉淀激酶分析测定JNK、p28和ERK的活性(27)和ERK1/2（C16/C14；圣克鲁斯生物技术公司）。将细胞裂解物与抗体在4°C下孵育3-4小时，然后通过与G蛋白或A蛋白（Pharmacia LKB Biotechnology）-Sepharose珠在4°C下孵育2小时来分离。用含有1×PBS、1%NP-40和2 mM钒酸盐的溶液清洗配合物三次；一次使用100 mM Tris（pH 7.5）-0.5 M LiCl，另一次使用激酶缓冲液（12.5 mM吗啉丙基磺酸[pH 7.5]，12.5 mM-β-甘油磷酸，7.5 mM MgCl20.5 mM EGTA、0.5 mM NaF和0.5 mM钒酸盐）。通过添加30μl含有50μM[γ-32P] ATP（10 Ci/mmol）和1μg GST-c-Jun（JNK）、1μg GST-ATF2（p38 MAPK）或1μg MBP（ERK）。通过添加Laemmli样品缓冲液终止反应。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（12-15%聚丙烯酰胺凝胶）进行解析，并通过放射自显影术进行鉴定。成立[32P] 磷酸盐通过磷成像仪分析进行定量。
电泳迁移率测定。
制备了细胞溶胶和核提取物(1)用寡核苷酸探针检测AP-1和Jun2 TRE的DNA结合活性。AP-1探针是一个双链寡核苷酸（5′-CGCTTGACTCAGCCGGAA-3′），用T4多核苷酸激酶和[γ-32P] ATP。Jun2 TRE探针由5′-AGCTAGCATTACTCATCCC-3′和5′-GATCGGGAGGTATAGCT-3′退火制成，并用Klenow和[α-32P] ATP。进行结合分析（4°C下30分钟），并在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检查。使用100倍多余的未标记探针进行竞争分析。
免疫印迹分析。
蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%聚丙烯酰胺凝胶）分解，并电泳转移到Immobilon-P膜（Millipore，Inc.）。将膜与5%脱脂干乳孵育（在4°C下孵育5 h），然后用ATF2（N-96和F2BR-1；Santa Cruz）、磷酸化（Thr-71）-ATF2（F1；Santa Cruz），C-Jun（h-79；Santa Croz），JunD（329；Santa克鲁兹），磷酸化（Ser-73）-Jun（Upstate Biotechology），JNK 1/2（PharMinen），ERK 1/2（C14/16；Santa Cruz）和p38 MAPK（N-20；圣克鲁斯）。免疫复合物通过增强化学发光（NEN）检测。
免疫荧光显微镜。
将生长在玻璃盖玻片上的细胞固定在−20°C的甲醇（5分钟）和丙酮（2分钟）中。然后在封闭缓冲液（PBS中的3%牛血清白蛋白）中培养细胞（30分钟），然后在含有初级抗体的封闭缓冲液中培养细胞JNK（抗活性JNK[1/100]；Promega）和抗JNK1/2（1/100；Pharmingen）。在阻断缓冲液中用德克萨斯红结合抗兔免疫球蛋白（Ig）和异硫氰酸荧光素（FITC）结合抗鼠免疫球蛋白抗体（1/300；Jackson Immunoresearch，Inc.）检测免疫复合物。使用DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）（Vector Laboratories）将盖玻片安装在Vectashield中，并使用常规Axioplan 2显微镜和MicroImager电荷耦合器件相机（Carl Zeiss）通过免疫荧光显微镜进行检查。
流式细胞术。
用0.53 mM EDTA在PBS中分离细胞，并用1%FBS和106用Fc Block（抗鼠CD16/CD32；BD Pharmingen）处理细胞（冰上5分钟）。然后用TNF-R1抗体（559915；BD Pharmingen）培养细胞（在冰上1小时）。用生物素结合小鼠抗仓鼠IgG抗体（BD Pharmingen）和藻红蛋白结合链霉亲和素（BD Pharmingen）检测TNF-R1免疫复合物。培养细胞（在冰上60分钟），并在两次培养之间用1%FBS在PBS中清洗。在流式细胞仪分析之前，将细胞固定在PBS中的100μl 4%多聚甲醛（Ted Pella，Inc.）中（在25°C下保持20分钟），清洗并用1%FBS重新悬浮于PBS中。
核糖核酸酶保护分析。
按照制造商的建议，使用模板集mCK3、mCK4、mCR4和mFos/Jun，使用多酶体核糖核酸酶保护试验（Pharmingen）检测总RNA（5μg）。产物在5%测序凝胶上分离，通过放射自显影检测，并通过PhosphorImager分析（分子动力学）定量。
结果
WT和Jnk公司−/−培养鼠胚胎成纤维细胞。对照实验表明，RNase保护试验中TNF受体mRNA（TNF-R1和TNF-R2）的表达相等（数据未显示）。此外，流式细胞术在WT和Jnk公司−/−成纤维细胞（数据未显示）。此外，TNF刺激的IκB降解和NF-κB核积累的速率和程度在WT和Jnk公司−/−单元格（未显示数据）。这些数据表明TNF信号通路在WT和Jnk公司−/−成纤维细胞。这与以前的研究结果一致，这些研究表明TNF（在存在蛋白质或mRNA合成抑制剂的情况下）会导致WT和Jnk公司−/−单元格(35). 总之，这些数据表明JNK缺乏不会导致成纤维细胞中TNF受体激活的普遍缺陷。相反，在JNK缺陷细胞中观察到MAPK激活存在明显的选择性缺陷。
用TNF治疗WT成纤维细胞导致ERK、JNK和p38 MAPK活性增加（图。). WT和Jnk公司−/−成纤维细胞表明ERK活性的调节与p38 MAPK活性的调控相似。相反，JNK蛋白和活性在Jnk公司−/−成纤维细胞（图。). 确认JNK在Jnk公司−/−成纤维细胞，我们通过免疫荧光分析检测JNK的表达（图。). 在WT成纤维细胞中，JNK在细胞质和细胞核中均被检测到。TNF治疗导致活化JNK的数量显著增加，使用结合磷酸化-Thr-185/Tyr-185 JNK（图。). 在中未观察到JNK或激活的JNKJnk公司−/−电池（图。). 总之，这些数据表明Jnk公司−/−细胞似乎在JNK信号通路中存在选择性缺陷。
TNF对WT和WT中MAPK活化的影响Jnk公司−/−成纤维细胞。用免疫复合物蛋白激酶法（KA）检测TNF-α（10 ng/ml）处理不同时间的细胞中JNK（A）、p38 MAPK（B）和ERK（C）的活性。免疫印迹（IB）检测MAPK含量。使用磷酸成像仪对激酶测定中的底物磷酸化进行定量，并以相对单位图示。所示数据来自单个实验，代表了三个独立的实验。
WT和WT中JNK表达和激活的比较Jnk公司−/−成纤维细胞。免疫荧光显微镜检查JNK和活化JNK（磷酸JNK）。在不使用（A）和（B）TNF-α（10 ng/ml，持续15分钟）的情况下处理细胞，将其固定，并用JNK抗体（FITC[绿色]）和磷酸化JNK（德克萨斯红[红色]）染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。细胞通过常规荧光显微镜成像。
JNK是TNF刺激AP-1转录因子表达所必需的。
TNF通过增加Jun和Fos家族成员的表达来调节AP-1转录因子的活性。对WT细胞的研究表明，TNF导致c-Jun、JunB、JunD、c-Fos、Fra1和Fra2的表达增加（图。). 这些转录因子的表达在Jnk公司−/−成纤维细胞，但JunB除外，它在WT和Jnk公司−/−成纤维细胞。TNF刺激的c-Jun、JunD、c-Fos、Fra1和Fra2表达增加在Jnk公司−/−电池（图。). 此外，未经TNF处理的细胞中c-Jun、JunD、c-Fos和Fra2的基础表达在Jnk公司−/−细胞与WT细胞进行比较。这些数据表明，JNK缺陷的成纤维细胞在AP-1转录因子组的表达方面存在严重缺陷。为了证实这一结论，我们在电泳迁移率变化分析中检测了AP-1 DNA结合活性。使用一致的AP-1探针的研究表明，TNF引起AP-1 DNA结合活性的时间依赖性增加，这种活性在Jnk公司−/−成纤维细胞（图。). 在使用非敏感AP-1探针（Jun2 TRE）的实验中也进行了类似的观察，该探针优先将Jun蛋白的异二聚体复合物与ATF2结合（图。). 这些数据表明Jnk公司−/−细胞在TNF刺激的AP-1转录因子表达中表现出严重缺陷。
AP-1转录因子在WT和Jnk公司−/−成纤维细胞。WT和Jnk公司−/−细胞未经（−）和（+）TNF-α（10 ng/ml）处理。不同时间后采集细胞，分离总RNA。在核糖核酸酶保护试验中检测c-Jun、JunB、JunD、c-Fos、Fra1、Fra2和核糖体蛋白L32 mRNA。通过放射自显影术（A）检测mRNA，并通过荧光成像仪分析（B）定量。给出了标准化的AP-1mRNA与L32mRNA的比值。所示数据代表了三个独立实验中获得的数据。
WT和WT中的AP-1转录因子Jnk公司−/−成纤维细胞。（A） WT和Jnk公司−/−分别用TNF-α（10 ng/ml）和TNF-β处理细胞。在不同的时间制备核提取物，并使用含有共识AP-1位点（TRE）和非敏感位点（Jun2 TRE）的探针，通过电泳迁移率变化分析检测DNA结合活性。DNA结合活性通过放射自显影术检测（上面板），并通过磷成像仪分析定量（下面板）。（B） WT和日本−/−分别用TNF-α（10 ng/ml）和TNF-β处理细胞。在不同时间后收集细胞。通过检测ATF2、c-Jun和JunD抗体，通过免疫印迹分析检测细胞裂解物。使用磷酸特异性抗体检测JNK磷酸化位点上这些转录因子的磷酸化。用α-微管蛋白抗体对斑点进行检测，以监测凝胶每条通道上的蛋白质负荷。
JNK是TNF刺激的AP-1转录因子磷酸化所必需的。
据证实，TNF通过增加Jun和Fos家族成员的表达来调节AP-1活性。然而，AP-1活性也可以通过这些转录因子的翻译后修饰来调节，包括MAPK的磷酸化。以前的研究表明NH2-c-Jun、JunD和ATF2的末端磷酸化有助于AP-1的激活(8). 因此，我们检测了WT和Jnk公司−/−成纤维细胞。
TNF导致NH显著增加2-WT成纤维细胞中c-Jun的末端磷酸化，但在WT中未检测到c-Jun磷酸化Jnk公司−/−电池（图。). 这些数据与之前的研究一致，这些研究表明JNK在NH中的作用2-c-Jun的末端磷酸化(8). 与JNK对TNF刺激的c-Jun磷酸化的基本需求相反，NH2-JunD的末端磷酸化在Jnk公司−/−成纤维细胞（图。). TNF刺激的JunD磷酸化在Jnk公司−/−这些细胞尤其引人注目，因为这些细胞表达的JunD蛋白量低于WT成纤维细胞。总之，这些数据表明，TNF处理细胞中的JunD磷酸化部分受JNK非依赖机制（例如ERK或p38 MAPK）控制。然而，JNK对TNF刺激的NH至关重要2-c-Jun的末端磷酸化。
NH2-据报道，ATF2转录因子的末端磷酸化受JNK调节(14,22)以及其他MAPK，包括ERK(23)和p38 MAPK(27). JNK在NH中的作用2-因此，ATF2的末端磷酸化尚不清楚。TNF导致WT细胞ATF2磷酸化显著增加，但在WT细胞中仅检测到极低水平的ATF2磷酸化酶Jnk公司−/−细胞。这些数据表明，虽然几种TNF刺激的MAPK在体外能够磷酸化ATF2，但在体内主要的TNF刺激活性是JNK。免疫荧光分析证实了这一结论（图。). 对WT细胞的研究表明，ATF2在细胞质中检测到，但主要定位于细胞核。在中观察到ATF2的类似分布Jnk公司−/−细胞。用TNF处理WT细胞，导致ATF2在细胞核内积聚，并从细胞质中消失。亚细胞定位的改变与NH的显著增加有关2-ATF2的末端磷酸化（图。). 相反，TNF治疗的研究Jnk公司−/−与TNF处理的WT细胞相比，细胞显示出明显不同的ATF2磷酸化和亚细胞定位。首先，在TNF处理的小鼠中检测到细胞质ATF2Jnk公司−/−尽管大多数ATF2定位于细胞核。第二，NH很少2-TNF处理后检测到末端磷酸化ATF2Jnk公司−/−细胞。有趣的是，这种磷酸化的ATF2定位于细胞质中的核周区域，而不是细胞核中（图。). 使用小分子抑制剂PD 169316的研究表明，ATF2的残余磷酸化Jnk公司−/−p38 MAPK对细胞进行计数（数据未显示）。这些数据表明JNK对TNF刺激的NH至关重要2-细胞核中ATF2的末端磷酸化。
JNK缺乏对ATF2磷酸化和亚细胞定位的影响。用免疫荧光显微镜检测ATF2和磷酸化-ATF2。成纤维细胞在不使用（A）和使用（B）TNF-α（10 ng/ml，持续15分钟）的情况下处理，固定，并用ATF2抗体（德克萨斯红[红]）和磷酸化-ATF2抗体（FITC[绿]）染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。细胞通过常规荧光显微镜成像。
JNK在Jnk公司−/−细胞纠正TNF刺激NH的缺陷2-ATF2和c-Jun的末端磷酸化。
测试TNF刺激NH中的缺陷2-ATF2和c-Jun的末端磷酸化Jnk公司−/−细胞是由JNK缺乏引起的，我们通过JNK1和JNK2在Jnk公司−/−细胞。使用激酶阴性的JNK1和JNK2（分别用丙氨酸和苯丙氨酸替换Thr和Tyr磷酸化的激活位点）进行对照实验。这些研究是使用来源于克隆池的细胞进行的，这些克隆池是在使用逆转录病毒载体转导后获得的。WT细胞的免疫印迹分析显示p46和p55形式的JNK1和JNK2的表达（图。). 在中未检测到JNKJnk公司−/−细胞。补充Jnk公司−/−获得表达WT或激酶阴性p46 JNK1或p55 JNK2的细胞。免疫印迹分析显示内源性ATF2和c-Jun NH的缺陷2-末端磷酸化通过WT JNK1或JNK2的表达而得到纠正，而不是通过激酶阴性JNK1或JNK的表达（图。). 这些数据表明，缺陷NH2-ATF2和c-Jun的末端磷酸化Jnk公司−/−细胞是由这些细胞中缺乏JNK引起的。
ATF2和c-Jun的磷酸化在Jnk公司−/−JNK1或JNK2异位表达后的成纤维细胞。（A） 补充分析Jnk公司−/−JNK1或JNK2的异位表达。Jnk公司−/−用表达WT JNK1或JNK2的逆转录病毒转导细胞。还使用表达激酶活性JNK1或JNK2（APF，用Ala-Pro-Phe替换三肽双磷酸化基序Thr-Pro-Tyr）的逆转录病毒进行了研究。WT单元，Jnk公司−/−细胞和四个补体Jnk公司−/−用TNF处理细胞群（15分钟）并收获以制备用JNK、ATF2、磷酸化-ATF2和磷酸化-c-Jun（B和c）WT细胞抗体进行检测的裂解物，日本−/−单元格，以及Jnk公司−/−补充有JNK1或JNK2的细胞在没有（−）和（+）TNF-α（10 ng/ml，持续60分钟）的情况下处理。分离总RNA（5μg），并使用RNase保护试验检测其表达，以测量c-Jun、JunB、JunD（B）和IL-6 mRNA（c）。进行对照分析以测量核糖体蛋白L32的表达。
TNF刺激JNK、ERK和p38 MAPK的观察结果（图。)还有那个Jnk公司−/−细胞在ATF2 NH中存在严重缺陷2-末端磷酸化（图。到)很有趣。这一发现表明，虽然其他MAPK可以磷酸化ATF2，但TNF处理细胞中的生理相关激酶是JNK。这一结论促使我们重新审视p38 MAPK和JNK在ATF2调控中的作用。用GAL4报告基因分析法研究ATF2转录活性(14)使用WT和Jnk公司−/−成纤维细胞（图。). 使用JNK信号通路激活剂（MEK激酶1或混合-连锁反应激酶3）的共转染检测强烈增加了WT细胞中ATF2依赖性报告基因的表达，并且这种转录活性在WT细胞内受到抑制Jnk公司−/−电池（图。). 补体分析表明，ATF2转录活性缺陷在Jnk公司−/−细胞可以通过异位表达JNK1或JNK2来纠正（图。). 总之，这些数据与JNK信号通路在ATF2激活中的作用一致。使用p38 MAPK通路强激活剂（MKK6）进行的研究也表明ATF2依赖性转录活性增加，但这种活性在Jnk公司−/−电池（图。). 这些数据证实了先前的结论，即ATF2的转录活性可以由JNK非依赖性机制调节，包括p38 MAPK信号通路。因此，JNK对TNF作用的选择性要求似乎反映了生理相关的信号转导特异性。
WT和WT中ATF2转录活性Jnk公司−/−成纤维细胞。使用融合到GAL4 DNA结合域的ATF2激活域在荧光素酶报告分析中检测ATF2活性(14). 研究了用丙氨酸（GAL4/ATF2A）取代磷酸化激活位点（Thr-69和Thr-71）的效果。测量了萤火虫荧光素酶的相对活性，并将其归一化为检测到的共转染对照的活性量雷尼利亚荧光素酶报告质粒。（A） 检测了MEK激酶1（MEKK1）、MKK6（Ser208Glu/Thr-211Glu）和混合利尿激酶3（MLK3）共表达的影响。（B） 补充分析Jnk公司−/−JNK1或JNK2的异位表达。细胞与JNK1或JNK2表达载体共转染。通过共转染空表达质粒进行对照研究。
JNK是TNF刺激的细胞因子基因表达所必需的。
细胞对TNF反应的一个特征是细胞因子表达增加。为了研究JNK在这一过程中的作用，我们测量了WT和Jnk公司−/−使用RNase保护分析的细胞（图。). TNF可增加WT细胞中TNF、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）、白血病抑制因子（LIF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和巨噬细胞集落激励因子（M-CSF）的表达。JNK缺乏导致GM-CSF和M-CSF表达无明显变化，但确实导致TNF刺激的LIF表达有所下降。相反，在JNK缺陷细胞中，TNF刺激的IL-6和IFN-γ的表达严重降低。这些数据表明，JNK是TNF刺激的炎症细胞因子IL-6和IFN-γ选择性表达所必需的。为了证实这一结论，我们检测了TNF刺激的IL-6和IFN-γ在Mkk公司−/−缺乏功能性JNK信号转导途径的细胞(34). 与JNK缺陷细胞一样，MKK缺陷细胞在TNF刺激的IL-6和IFN-γ表达方面表现出明显缺陷（图。). 总之，这些数据表明JNK信号通路对TNF刺激的IL-6和IFN-γ的表达至关重要。
JNK在TNF刺激的细胞因子表达中的作用。（A） WT和Jnk公司−/−成纤维细胞饥饿3h，然后用TNF-α（10 ng/ml）处理。纯化总RNA，并用5μg进行RNase保护试验，以测量TNF-α、IL-6、IFN-γ、LIF、GM-CSF、M-CSF和核糖体蛋白L32 mRNA的量。所示数据代表了三个独立的实验。（B） RNase保护试验用于测量WT和WT表达的TNF-α、IL-6和IFN-γmRNA的量Mkk公司−/−细胞。
JNK信号通路在TNF-α的TNF-刺激表达中的作用也被确定，但似乎JNK只需要持续的信号传导（图。). JNK均无缺陷（图。)也没有MKK缺陷（图。)防止TNF-α表达因TNF治疗细胞而立即增加。然而，在WT细胞中观察到由TNF引起的TNF-α表达持续增加（24小时），但在JNK缺乏或MKK缺乏的细胞中没有观察到（图。). JNK信号通路对持续TNF-α表达的选择性需求（图。)与IL-6和IFN-γ表达研究中的观察结果不同，在这些研究中，细胞对TNF的持续反应和即时反应都需要JNK信号（图。).
测试观察到的基因表达缺陷是否存在于Jnk公司−/−细胞是由JNK缺乏引起的，我们通过JNK1和JNK2在Jnk公司−/−细胞。在对照研究中，检测了Jun家族成员的表达（图。). JNK缺乏导致JunB表达无变化，但导致c-Jun和JunD表达降低。c-Jun和JunD表达中的这些缺陷通过JNK1或JNK2在Jnk公司−/−电池（图。). 同样，TNF-刺激的IL-6表达在Jnk公司−/−通过异位表达JNK1或JNK2恢复细胞（图。). 总之，这些数据表明JNK是TNF暴露细胞中AP-1依赖性基因表达的重要调节器。
讨论
TNF-α是影响免疫细胞功能、增殖、分化和凋亡的应激反应的关键介质(6). TNF-α可通过激活胱天蛋白酶引起细胞凋亡。然而，TNF-α也可以通过一种涉及NF-κB和AP-1转录因子组的机制来抑制凋亡，从而促进炎症(2). 由于TNF-α表达或信号的失调与许多疾病的病理学有关，包括类风湿性关节炎、克罗恩病和一些神经病理学（例如中风、多发性硬化症和阿尔茨海默病），了解TNF-α的促炎信号机制对于设计新的治疗策略至关重要。
大量证据表明AP-1转录因子组在许多非凋亡细胞对TNF-α的反应中发挥作用(2). AP-1激活的机制包括增加表达(5)和磷酸化(20,32,39)AP-1蛋白。TNF调节AP-1蛋白这些功能的机制尚不清楚。然而，已经提出JNK信号通路在TNF激活AP-1中的重要作用(8). 我们提供的研究旨在验证这一假设。我们的方法是比较TNF对WT成纤维细胞和复合敲除成纤维细胞的影响，两者都缺乏表达Jnk1号机组和Jnk2号机组JNK缺陷的成纤维细胞表达相似数量的TNF-R1，并且在TNF-刺激的NF-κB活化方面没有缺陷。此外，TNF在WT和JNK缺陷细胞中都引起了有效的凋亡反应（在存在蛋白质或mRNA合成抑制剂的情况下）。这些数据表明JNK缺陷的成纤维细胞对TNF治疗有反应。然而，这些细胞在TNF刺激的JNK激活和AP-1转录因子表达、磷酸化和功能方面表现出明显缺陷。这些数据证实了JNK对TNF-α处理的细胞中AP-1的激活至关重要的假设。
JNK在AP-1转录因子表达中的作用。
WT和JNK缺陷的成纤维细胞显示出相似的JunB基础表达和TNF刺激表达（图。). JNK对JunB表达没有要求，这与以前的研究结果一致，这些研究表明ERK调节的Ets转录因子在JunB的表达中起着关键作用(7). 同样，在JNK缺陷细胞中AP-1相关转录因子ATF2的表达没有改变。然而，JNK缺陷细胞在TNF刺激的c-Jun、JunD、c-Fos、Fra1和Fra2的表达中表现出明显缺陷（图。). 这些AP-1表达缺陷通过TNF处理细胞中AP-1 DNA结合活性的测量得到证实（图。). 这些数据表明，JNK是TNF正常调节AP-1转录因子表达所必需的。
有趣的是，JNK不是TNF刺激的JunB表达所必需的，JunB是一种AP-1蛋白，以前被认为是c-Jun转录活性的拮抗剂(9). c-Jun拮抗剂JunB的表达和其他AP-1蛋白的选择性缺失表明，TNF处理的JNK缺陷细胞在AP-1功能方面存在严重缺陷。
JNK在NH中的作用2-AP-1转录因子的末端磷酸化。
TNF-α治疗WT成纤维细胞导致NH显著增加2-c-Jun、JunD和ATF2的末端磷酸化（图。). 有趣的是，JNK缺陷对每个转录因子的磷酸化作用是不同的。在JNK缺陷细胞中未检测到磷酸化c-Jun，表明JNK是生理相关NH2-TNF处理细胞中的末端c-Jun激酶。这一发现与先前研究得出的结论形成对比，这些结论表明多重MAPK在NH中的作用2-c-Jun的末端磷酸化，包括MAPK的JNK和ERK基团的成员(21,26). JNK在NH中的选择性作用2-TNF处理的细胞中c-Jun的末端磷酸化为体内MAPK蛋白磷酸化的特异性提供了证据。
在缺乏JNK的情况下，JunD磷酸化仅受到部分影响。因此，JNK不是NH的主要贡献者2-TNF处理细胞中JunD的末端磷酸化。因此，这种磷酸化在很大程度上由其他蛋白激酶介导。可能磷酸化JunD的候选蛋白激酶包括MAPK的ERK组。JNK在NH中缺乏重要作用2-JunD的末端磷酸化与之前的研究结果一致，这些研究证明NH需要c-Jun中的对接位点2-JNK末端磷酸化(10,17). 这种对接位点在JunD中不存在，体外研究表明，尽管c-Jun磷酸化位点在Jun D中是保守的，但Jun D是一种较差的JNK底物(13,18).
ATF2的研究表明NH中存在明显缺陷2-TNF处理的JNK缺陷细胞中该转录因子的末端磷酸化。因此，JNK对TNF刺激的ATF2磷酸化至关重要。这个结论令人惊讶，因为我们之前报道过ATF2被JNK和p38 MAPK磷酸化并激活(27,28). 此外，这些成纤维细胞中的JNK和p38 MAPK都被TNF激活（图。). 事实上，对照研究表明，活化的p38 MAPK可以在WT和JNK缺陷细胞中刺激ATF2（图。). 总之，这些数据表明，虽然p38 MAPK可以磷酸化ATF2，但JNK是生理相关的TNF刺激的ATF2 NH2-末端激酶。在TNF处理的细胞中，JNK对ATF2磷酸化的选择性需求的机制尚不清楚。然而，有几个机制可以解释这种观察结果。在这些可能性中，最简单的假设似乎是，当p38 MAPK被显著激活时，p38 MAPK只会导致ATF2磷酸化，而较低水平的p38 MAPK-激活不足以实现ATF2的磷酸化。这种机制可以解释以下观察结果：持续高水平的p38 MAPK激活（例如，在使用MKK6的转染分析中）导致ATF2磷酸化，但用TNF处理细胞（仅导致短暂低水平的p28 MAPK激活）不会导致显著的ATF2磷酸化。以前曾报道过p38 MAPK对Ets蛋白Elk-1进行磷酸化时，p38 MAPK对转录因子进行高活性依赖性磷酸化的机制(42). 该假设预测TNF会导致JNK缺陷细胞中p38 MAPK依赖的ATF2磷酸化水平较低。与这一预测一致，TNF在JNK缺陷细胞中引起的低水平的残余ATF2磷酸化被p38 MAPK的小分子抑制剂阻断。p38 MAPK在ATF2磷酸化中的生理作用仍有待严格测试。然而，我们提供的数据坚定地证明了JNK是TNF处理细胞中一种生理相关的ATF2激酶。
JNK对TNF诱导的炎症细胞因子的表达至关重要。
对TNF-α的反应的一个重要方面是产生反应细胞分泌的细胞因子。这些细胞因子通过向其他类型的细胞发出信号来发挥作用，并放大最初的反应。先前的研究强烈暗示NF-κB和AP-1转录因子组的作用(2)和MAPK途径(45). 然而，JNK在细胞对TNF-α的细胞因子反应中的具体作用尚不清楚。WT和JNK缺陷细胞的比较表明，JNK对于TNF刺激的炎症细胞因子IL-6和IFN-γ的表达至关重要。
IL-6启动子包含顺式-作用元件，包括NF-κB、C/EBPβ、AP-1和CRE(38). NF-κB的激活对于IL-6基因的表达很重要，但还不够(24,31). p38 MAPK在IL-6表达中的作用也已被报道(4,41). 本研究结果表明，JNK对TNF刺激的IL-6表达至关重要。JNK的这种作用可能包括激活与IL-6启动子AP-1和CRE位点结合的因子。由于ATF2与CRE位点的结合对IL-6的表达至关重要，因此ATF2可能是这种反应的主要促因(12)ATF2缺乏细胞中IL-6表达严重降低(29). ATF2的一个重要作用也与JNK缺陷细胞在TNF刺激的IFN-γ表达中表现出明显缺陷的观察结果一致，因为IFN-γ启动子包含两个顺式-结合ATF2的作用元件（CRE和AP-1）(25).
JNK也被发现影响TNF-刺激的TNF-α表达（图。). JNK不影响TNF引起的TNF-α表达的立即增加，但JNK是TNF-β持续刺激表达所必需的。解释JNK这种选择性要求的机制尚不清楚。TNF-α启动子是复杂的，已经证明在与Ets/Elk-1、Egr-1、Sp1和ATF2/c-Jun的复合物中包含NFAT的结合位点和与CBP/p300的增强子(36). JNK对持续TNF-刺激的TNF-α表达的需求可能部分由与启动子结合的ATF2和AP-1转录因子的磷酸化介导。
结论。
本研究证实JNK是细胞对TNF反应的重要组成部分。JNK是TNF调节的AP-1转录因子表达和磷酸化以及AP-1相关转录因子ATF2磷酸化所必需的。JNK的缺失导致TNF诱导促炎细胞因子表达的作用明显缺陷。因此，抑制JNK是治疗TNF介导的炎症性疾病的潜在疗法(三,16).
