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分子细胞生物学。2003年4月；23(8): 2953–2968.
数字对象标识：10.1128/MCB.23.82953-2968.2003
预防性维修识别码：PMC152542型
PMID：12665592

丝氨酸303的磷酸化是热休克因子1的应力诱导SUMO修饰的先决条件

Hietakangas镇，1,2 约翰娜·阿尔斯科格（Johanna K.Ahlskog），1,三 安妮卡·雅各布森，1,三 玛丽亚·海利索，1 尼科·M·萨尔伯格，1 卡琳娜·霍姆伯格，1,† 安德烈·米哈伊洛夫，1 乔尔马·J·帕尔维莫，4 莉拉·皮尔卡拉，1,‡和利亚·西斯顿1,三，*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

热休克反应伴随着热休克蛋白（Hsps）的快速而强烈的上调，是一种高度保守的抵抗蛋白质损伤应激的保护机制。应激诱导热休克因子1（HSF1）主要在转录水平上调节热休克蛋白的诱导。激活后，HSF1三聚化，与DNA结合，集中在核应激颗粒中，并经历显著的多位点磷酸化，这与其转录活性相关。在本研究中，我们发现HSF1以应力诱导的方式被SUMO-1和SUMO-2修饰。赖氨酸298（位于HSF1的调节域，邻近几个关键磷酸化位点）的氨酰化作用迅速短暂增强。HSF1磷酸化位点突变体的Sumoylation分析表明，磷酸化缺陷的S303突变体在体内仍然没有SUMO修饰，而模拟S303磷酸化的突变体在体外促进HSF1的Sumoylation，表明K298 sumoyl化需要S303磷酸。利用S303/7磷酸特异性抗体进行磷酸肽定位和分析进一步支持了这一发现，这表明丝氨酸303是强热诱导磷酸化的靶点，对应于诱导的HSF1 sumoylation。HSF1和SUMO-1在核应激颗粒中的短暂磷酸化依赖性共定位为HSF1与SUMO之间严格调控的亚核相互作用提供了证据。

热休克反应是一种进化上非常保守的细胞应激反应机制，其特征是热休克蛋白（Hsps）的合成和积累增加。Hsps是参与蛋白质折叠和维持蛋白质稳态的分子伴侣，当细胞暴露于各种蛋白质损伤应激时，Hsps水平的大幅增加对生存至关重要（有关综述，请参阅参考文献15和34). 热休克蛋白编码基因的应激诱导表达受一系列热休克转录因子（HSFs）调控，HSFs与热休克基因启动子中的热休克元件（HSE）结合并刺激其转录（有关综述，请参阅参考文献37和62). 哺乳动物中已鉴定出HSF家族的三个成员，HSF1、HSF2和HSF4(41，47，54，56). 在酵母和苍蝇中发现的单一HSF的脊椎动物同源物HSF1是主要的应激反应家族成员，因为没有其他HSF能够在功能上取代HSF1或拯救HSF1缺陷细胞或小鼠的热休克反应(35，44，64).

热休克后热休克蛋白合成增加是由HSF1的多步激活引起的（综述见参考文献45). 在正常生长条件下，非活性HSF1作为单体分布在整个细胞中，在某些丝氨酸残基上构成磷酸化。激活后，HSF1会发生一些改变，例如三聚和定位到特定的核结构，称为核应力颗粒（有关综述，请参阅参考文献25). HSF1的磷酸化在热休克期间强烈诱导，与DNA结合所需的单体到三聚体的转变无关。尽管HSF1体磷酸化水平与其转录活性密切相关，但有关HSF1磷酸化介导调控的数据仍然相对分散。迄今为止，已鉴定出四种磷酸化丝氨酸残基（S230、S303、S307和S363）。在报告基因分析中，S303、S307和S363的组成型磷酸化已被证明在正常生长条件下抑制HSF1的反式激活能力(5，8，31，32). 然而，在HSF1激活-去激活循环期间，对这些位点磷酸化状态的动力学分析缺失。与S303、S307和S363的抑制作用相反，S230最近被证明在热休克时被诱导磷酸化，并对HSF1的转录活性起积极作用(17). 由于大多数HSF1磷酸化位点尚不清楚，HSF1磷酸化度在调节HSF1功能的各个方面的生物学相关性仍有待确定。

已报道了多种蛋白质的sumoylation翻译后修饰，包括一些转录调节因子，如p53、c-Jun、c-Myb、AP-2、雄激素受体、早幼粒细胞白血病蛋白（PML）和IκBα(三，11，46; 查看参考文献36). 这种修饰涉及一种小的泛素样修饰物1（SUMO-1，也称为GMP-1、PIC1、sentrin、Ubl1、Smt3c和hSmt3）通过异肽键与底物的一种或几种赖氨酸共价偶联（有关综述，请参阅参考文献36). SUMO-1结合利用一种独特的E1-激活酶复合物SAE1/SAE2（Aos1/Uba2[24])和一种E2-结合酶，Ubc9(22)以及一组最近表征的E3连接酶，这是一个蛋白抑制活性-STAT（PIAS）蛋白家族(21，23，29，33，50，55，60)和核穿孔蛋白RanBP2(43). SUMO-1修饰已被证明具有不同的底物特异性功能。Sumoylation已被证明通过增强蛋白质稳定性对抗泛素化，如NF-κB抑制剂IκBα的Sumoylate(9). 除了调节蛋白质半衰期外，SUMO-1修饰还可能改变其靶标的其他性质，从而改变其活性。在p53中，SUMO-1修饰被报道影响p53的反式激活能力及其细胞内定位(12，13，39，49，55). SUMO-1以前也被证明定位于PML核小体，在那里它与PML蛋白共价结合(10)这似乎对PML核体的结构和功能完整性至关重要(20，65). 除了SUMO-1，SUMO蛋白家族还有另外两个成员，SUMO-2和SUMO-3，它们彼此高度同源，与SUMO-1的序列同源性约为50%（有关综述，请参阅参考文献36). 尽管有证据表明，与SUMO-1相比，内源性SUMO-2/3至少部分具有不同的底物组(51)SUMO家族成员个体的特异性尚待阐明。

考虑到SUMO蛋白的许多功能，了解SUMO结合的生物学相关性需要进一步阐明调节SUMO接合的机制。磷酸化被认为是泛素化和乙酰化的重要调控机制(1，2). 有趣的是，之前有报道称，磷酸化SUMO底物，如c-Jun、p53、IκBα和PML，可以抑制其sumoylation(9，39，40). 在这项研究中，我们检测了人类HSF1的诱导性磷酸化是否伴随着其他翻译后修饰。我们的结果表明，位于HSF1调控域的赖氨酸298作为体内的酰化位点发挥作用，重要的是，这种酰化与附近丝氨酸303的磷酸化同时发生。S303上的磷酸化和K298上的sumoylation在应激刺激下显著增强，HSF1和SUMO-1在核应激颗粒中以磷酸化依赖的方式短暂共定位。据我们所知，这种严格的协同作用首次证明磷酸化是琥珀酰化的积极调节因子。

材料和方法

质粒构建物。

绿色荧光蛋白（GFP）融合表达质粒SUMO-1 WT和GA(46)，His-SUMO-1（由法国巴黎巴斯德研究所Anne Dejean善意提供[39])、His-SUMO-2（芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学Hetti Poukka赠送的礼物）以及Myc表位标记的人类HSF1表达质粒(17)，已经在前面进行了描述。使用QuickChange定点突变试剂盒（Stratagene）进行点突变，并通过测序确认。

细胞培养和瞬时转染实验。

将人K562红白血病细胞保存在RPMI 1640培养基中，该培养基补充有10%的胎牛血清（FCS）和抗生素（青霉素和链霉素），并将其置于5%的湿化CO中2大气温度为37°C。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），来源于热休克因子1−/−鼠标(热休克因子1−/−MEF公司[35])，保存在Dulbecco改良的Eagle培养基中，该培养基含有10%FCS、10 mM最小必需培养基非必需氨基酸、0.96μlβ-巯基乙醇/100 ml和抗生素（青霉素和链霉素）。HeLa细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中生长，该培养基含有5%的FCS和补充剂。通过电穿孔将总量为20或30μg的DNA转染到细胞中，K562细胞转染250V（975μF），HeLa细胞转染220V（975uF），细胞转染280V（975muF）热休克因子1−/−MEF，带有基因脉冲电穿孔器（生物实验室）。在实验处理之前，将细胞在37°C下培养24至36小时。在指定的时间段内，在42°C下进行热休克。蛋白酶体抑制剂MG132（肽研究所）在20μM下使用5小时。

免疫沉淀和免疫印迹分析。

对于体内免疫沉淀实验，将来自瞬时转染细胞的细胞颗粒重新悬浮在200μl裂解缓冲液中（25 mM HEPES、100 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5%Triton X-100、20 mMβ-甘油磷酸、20 mM对硝基苯磷酸、100μM原钒酸钠、0.5 mM苯甲基磺酰基氟化物、1 mM二硫苏糖醇、1×完整的微预防抑制剂混合物[罗氏诊断]）补充20 mMN个-乙基马来酰亚胺和5μM MG132，然后在15000×克温度为4°C。蛋白质提取后，将500μg总细胞蛋白质与40μl 50%的蛋白g-Sepharose（Amersham）浆液在含有150 mM NaCl和0.1%Triton X-100的TEG缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.5]，1 mM EDTA，10%甘油）中预孵育30分钟，然后在4°C下进行短暂离心。将预先分离的细胞裂解物与抗c-Myc（9E10；Sigma）、抗Flag M2（Sigma，之后，将40μl 50%蛋白G-Sepharose浆液添加到反应混合物中，并在旋转下培养1小时或在4°C下培养过夜。离心后，用补充的TEG缓冲液将Sepharose珠洗涤四次，免疫沉淀蛋白在十二烷基硫酸钠（SDS）-8%聚丙烯酰胺凝胶上运行，转移到硝化纤维素膜（Protran硝化纤维素；Schleicher&Schuell），并用抗SUMO-1（抗GMP-1）免疫印迹抗体（Zymed Laboratories，Inc.），抗HSF1(18)或磷酸肽特异性抗体抗p-S303/7（本研究；见下文）。对于输入控制，用抗HSF1抗体印迹膜，为了控制蛋白质水平，用抗Hsc70 SPA-815或抗Hsp90 SPA-835抗体（StressGen）重新印迹膜。为了分析Hsp70水平，使用了抗Hsp70抗体SPA-810（StressGen）。辣根过氧化物酶结合二级抗体购自Promega和Amersham，免疫复合物通过增强化学发光（ECL；Amerham）显示。

凝胶迁移率变化分析和抗体扰动。

将全细胞提取物（15至30μg）与32代表人类hsp70启动子近端HSE的P标记寡核苷酸(38). 如前所述，在4%天然聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质-DNA复合物(38). 对于微扰试验，在凝胶迁移率变化试验之前，在室温下将抗体与细胞裂解物在指示的稀释液中孵育15分钟。

体内32P标记和磷酸肽图谱。

编码野生型Myc标记的HSF1或突变体的质粒在开始标记前40小时通过电穿孔转染。为了进行标记，细胞被培养在无磷的最小基本培养基中，补充10%的透析FCS和0.3 mCi的[32P] 热休克前3小时正磷酸盐/ml。处理后，用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞一次，并用500μl裂解缓冲液（50 mM Tris[pH7.4]，150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA，100μM原钒酸钠，2 mM氟化钠，1×完整的微型抑制剂混合物[罗氏诊断]）进行裂解。通过离心（15000×克，10分钟，4°C）。使用10μg抗Myc抗体（9E10；Sigma）和蛋白g-Sepharose（Amersham）从上清液中免疫沉淀HSF1 2 h。用裂解缓冲液洗涤Sepharose珠6次后，将沉淀物用3×莱姆利样品缓冲液煮沸，并在SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶上分离。如前所述，进行了色氨酸消化和二维磷酸肽绘图(17). 简单地说，从干燥的凝胶中去除标记的HSF1带，并用我-1-对甲苯酰胺-2-苯乙基氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶（Sigma）。将胰蛋白酶消化物置于纤维素薄层色谱板（Merck）上，并通过电泳和薄层色谱进行二维分离。通过放射自显影术观察磷酸肽。

S303/7磷酸肽抗体的制备和Western blotting。

为了制备磷酸化抗体，合成了一种肽KEEPPpSPPQpSPRVE，将其与血蓝蛋白偶联，注入兔体内-N个-羟基琥珀酰亚胺柱（Amersham）。为了进行免疫印迹分析，将硝化纤维素膜在5%牛奶-25 mM MOPS（吗啉丙基磺酸）-125 mM NaCl（pH 7.3）中封闭2 h。封闭膜用添加0.3%吐温20（MOPS-TW）的MOPS缓冲液冲洗后，在5%牛血清白蛋白-MOPS-TW中孵育30 min。将一级抗体以1:1000的稀释度添加到牛血清白蛋白溶液中，并在4°C下轻轻摇晃培养过夜。用水冲洗过量的一级抗体10分钟，然后用MOPS-TW洗涤三次10分钟。辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体（Promega）在3%牛奶MOPS-TW中以1:20000稀释并孵育1小时，然后用MOPS-TW洗涤三次10分钟，并用ECL（Amersham）检测。

SUMO-1体外结合。

重组谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-SUMOGG-1、GST-Ubc9、GST-SAE1和GST-SAE2（SAE1及SAE2质粒由英国邓迪大学Ronald Hay善意提供）按前述方法制备和纯化(33). HSF1突变体的体外翻译是在TNT-coupled转录翻译系统（Promega）存在的情况下进行的[35S] 蛋氨酸。如前所述进行结合分析(33). 简言之，在反应缓冲液（50 mM HEPES[pH7.7]、100 mM NaCl、10 mM MgCl）中与GST-SUMOGG-1、GST-Ubc9以及GST-SAE1和GST-SAE2的混合物孵育体外翻译产物2，2 mM ATP，1 mM二硫苏糖醇）在30°C下保持1 h。通过添加3×Laemmli样品缓冲液并煮沸终止反应。样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离，并通过荧光成像进行可视化。

免疫荧光显微镜。

为了进行免疫标记，HeLa细胞生长在盖玻片上。处理后立即固定细胞，并用冰镇甲醇孵育6分钟使其渗透。固定细胞用PBS-0.05%吐温20（PBST）洗涤三次5分钟，然后用20%煮沸的正常山羊血清（GS）在PBST中封闭1小时。在5%GS-PBST中进行一级抗体孵育，抗Myc（Sigma）的稀释度为1:500，抗HSF1（Neocarkers）的稀释率为1:500和抗p-S303/7的稀释度分别为1:40。多余的一级抗体用PBST洗涤三次，每次5分钟。二级抗体（山羊抗鼠Alexa 488和Alexa 568抗Myc或山羊抗兔Alexa 546抗p-S303/7）在5%GS-PBST中稀释1:500，培养细胞1小时，然后进行三次洗涤，并用补充有DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚；Vector Laboratories）的Vectashide进行贴装。免疫荧光分析使用配备数字式哈马松ORCA电荷耦合器件相机的徕卡DMR荧光显微镜。

结果

HSF1经历应力诱导SUMO修改。

为了研究HSF1是否发生sumoylation，将Myc标记的HSF1和GFP融合的SUMO-1转染K562细胞，然后用抗Myc抗体免疫沉淀样品并用SDS-PAGE进行解析。用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹以检测SUMO-1结合的HSF1，显示约200kDa的条带（图。​（图1A）。1安培). 未经处理和热休克样品中均发现SUMO-1修饰的HSF1，但42°C下1h的热休克明显增加了HSF1的sumoylation（图。​（图1A）。1安培). 值得注意的是，HSF1和HSF1-SUMO-1在热休克时迁移较慢是由于磷酸化增加，如前所示(17，53). 正如预期的那样，当HSF1与共轭缺陷型SUMO-1（SUMO-1 GA）共表达时，HSF1-SUMO-1共轭体缺失（图。​（图1A）。1安培). 用抗HSF1抗体对下部面板中的输入对照进行印迹，以验证HSF1的同等表达。也可以从输入裂解物中检测到代表sumoyated HSF1的高分子量带。

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HSF1通过SUMO-1和SUMO-2进行热诱导改性。（A） 将空载体（模拟）或Myc标记的人HSF1（HSF1）与GFP融合的野生型或结合缺陷型SUMO-1（分别为SUMO-1 WT和SUMO-1 GA）瞬时转染人K562红白血病细胞，24小时后，细胞要么未经处理（C），要么在42°C下暴露于热休克1小时（HS）。用抗Myc抗体进行免疫沉淀，用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹分析。输入用多克隆抗人HSF1抗体进行印迹。（B） HSF1 WT与空载体（模拟）、His-tagged SUMO-2和SUMO-1或GFP-fused SUMO-1共转染K562细胞。细胞未经处理（C）或暴露于42°C（HS）下15分钟的热休克。样品通过抗HSF1蛋白印迹法进行分析。Hsc70被用作负荷控制。（C） 过度表达标志性HSF1和野生型GFP-SUMO-1的K562细胞受到单独1小时热休克（HS）、热休克后3小时恢复（R）或使用20μM蛋白酶体抑制剂MG132（MG）进行5小时治疗。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，并按照A组所述进一步分析样品。IP，免疫沉淀；WB、Western blot。面板A和C右侧以及面板B左侧的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。

由于许多SUMO-1基板也可以被SUMO-2修饰(30，50，52)，我们测试了共表达SUMO-2是否能够与HSF1偶联。在His标记SUMO-1或His标记的SUMO-2与HSF1共表达的细胞中检测到类似的慢迁移HSF1反应宽带（图。​（图1B）。1B年). 即使没有SUMO过表达（模拟），我们也能够检测到HSF1反应带，对应于His-SUMO结合HSF1的迁移率（图。​（图1B）。1B年). 然而，由于修饰物的化学计量比较低，推测的内源性SUMO结合物无法用当前可用的抗体进行进一步检查。在His-tagged SUMO-1和SUMO-2的情况下，在120至170 kDa的分子质量区域检测到修饰的HSF1，对应于迁移率下降>50-kDa，这远远大于SUMO分子的计算分子质量（11 kDa）。sumoylated HSF1在几个不同的细胞系中的迁移率相似（数据未显示），并且与其他SUMO底物的早期研究一致，显示出比11kDa大得多的迁移率变化(33，52，59). 此外，His-SUMO和GFP-SUMO-1共轭物之间电泳迁移率的差异大于基于GFP分子量（28 kDa）的预期（图。​（图1B）。1B年). 我们认为表观分子量的大幅增加可能是由于HSF1中心区域存在共轭SUMO多肽，形成分支蛋白质结构，从而导致异常电泳迁移。值得注意的是，HSF1在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的迁移也受到磷酸化的强烈影响，这是一种不能用改变的分子量来解释的迁移率变化（图。​（图1）1) (17，53). 此外，凝胶条件也会影响流动性。

为了检验热诱导的HSF1 sumoylation增加在恢复到常温后是否会持续，热休克细胞在常温下经历了3小时的恢复期。如图所示。​图1C，1摄氏度，恢复后HSF1的酰化量恢复到控制水平，表明热诱导HSF1酰化是一个可逆事件。已知用蛋白酶体抑制剂MG132处理K562细胞可诱导热休克反应，包括HSF1的磷酸化和活化(18，44). 为了研究蛋白酶体抑制对HSF1 sumoylation的影响，用MG132处理HSF1和SUMO-1共存的K562细胞。如图所示。​图1C，1摄氏度MG132处理诱导了与热休克相似的SUMO-1修饰，表明HSF1的SUMO修饰并不是热应激所独有的。

赖氨酸298是HSF1的体内SUMO修饰位点。

在大多数蛋白质中，SUMO修饰发生在一致序列ψKxE上，包括目标赖氨酸和某些周围氨基酸（ψ表示疏水残基，“x”表示任何氨基酸）。优化修饰可能需要额外的序列，事实上，据报道，核定位信号的存在非常重要，因为SUMO修饰主要发生在细胞核中(48). 我们分析了HSF1的氨基酸序列，发现了三个SUMO共有序列，即K91、K126和K298，以及三个部分共有位点，即K150、K162和K381（图。​（图2A）。2安培). 在赖氨酸突变为精氨酸后，HSF1突变体与SUMO-1在K562细胞中共表达，并通过免疫沉淀分析。除了一个K298R外，所有突变体都能够形成SUMO-1缀合物（图。​（图2B），第2页)表明K298是体内SUMO结合的主要位点。SUMO-2获得了相同的结果（数据未显示）。如图所示。​图2C，2摄氏度，人类HSF1上的sumoylation靶序列在包括青蛙在内的脊椎动物中是保守的非洲爪蟾还有斑马鱼达尼奥雷里奥而果蝇的HSF黑腹果蝇此区域中不包含目标序列。

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赖氨酸298是HSF1体内主要的酰化位点。（A） 对HSF1的氨基酸序列进行分析，以鉴定与共有SUMO-1修饰序列相对应的可能的sumoyalization位点。完全一致的序列基序用开放框标记（K91、K126和K298），部分一致的位点用阴影标记（K150、K162和K381）。（B） K→R突变体与K562细胞中的野生型GFP-SUMO-1共表达，并进行1h热休克，然后进行免疫沉淀分析，如图所示。​图1A：。1安培突变体的sumoylation强度的变化反映了个体实验之间的差异。野生型；免疫沉淀；WB、Western blot。右边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。（C） 人类HSF1（hHSF1）SUMO-1修饰序列与小鼠HSF1（mHSF1）、大鼠HSF1（rHSF1），鸡HSF1（cHSF1）和斑马鱼的比对斑马鱼HSF1（zHSF1），蛙式X·莱维斯HSF1（XHSF1）和果蝇黑腹果蝇HSF（DrHSF）。SUMO-1共有序列在各个物种中装箱。利用ClustalW多序列比对进行比对。

HSF1的Sumoylation被磷酸化位点S303的突变所抑制。

由于HSF1的sumoylation位点位于调控域中，调控域对控制HSF1的转录活性至关重要，并且已经确定了几个关键的磷酸化位点（图。​（图3A）3A级) (5，14，17，31，32，42，58，66)，我们被要求研究HSF1的磷酸化和sumoylation之间是否存在协同作用。通过将所有表征的HSF1磷酸化位点的突变体（S230A、S303A、S307A和S363A）与SUMO-1一起共转染到K562细胞中，测试其体内sumoyalization。S303A和S303/7A突变都有效地阻止了HSF1的sumoylate化，因为没有检测到HSF1的sumoylated形式，而S307A和其他突变与野生型HSF1一样被sumoyleted化（图。​（图3B）。3B公司). 此外，S303A突变抑制了SUMO-2结合（数据未显示）。这些结果表明，S303可能是HSF1 sumoylation的关键决定因素。

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丝氨酸303的磷酸化位点突变为丙氨酸可阻止HSF1的sumoylation。（A） 示意图显示了K298（▿）在HSF1调控结构域中几个关键磷酸化位点附近的位置（星号）。显示了DNA-结合域（DBD）、N-末端亮氨酸拉链（HR-A/B）、调节域（RD）、C-末端亮氨酸链式（-C）和激活域（AD）。（B） HSF1磷酸化位点的Myc-tagged S→A突变体与GFP-SUMO-1共转染到K562细胞中，然后进行1h热休克，细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析。用抗HSF1抗体进行Western blot分析，检测与sumoylated HSF1相对应的高分子量HSF1带的存在。抗Hsc70免疫印迹证实负载量相等。野生型；WB、Western blot。右边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。

为了进一步研究S303的磷酸化是否对启动HSF1 sumoylation至关重要，我们进一步检测了S303在K562细胞中的磷酸化状态。这一点尤其重要，因为之前已经通过发现S303可以被糖原合成酶激酶-3磷酸化，但只有当S307首先被另一个激酶磷酸化时，S303和S307位点之间的合作性才得以证明(4，5). 丝氨酸303和307的S→A突变体在体内转染到K562细胞32P标记，并通过胰蛋白酶磷酸肽图谱进行分析（图。​（图4）。4). 在野生型HSF1中，大多数磷酸化分子在S303和S307上被磷酸化（白色箭头），因为对应于单一磷酸化状态的磷酸肽无法检测到（黑色箭头）。S307A突变体中S303被强烈磷酸化，如出现与单个磷酸化肽（黑色箭头）对应的斑点所示。S307的磷酸化似乎不需要启动S303磷酸化，因为S307A图中代表单个磷酸化肽（黑色箭头）的点与S303A图中的相应点一样强。正如所料，当S303和S307突变为丙氨酸时，该斑点消失。总之，S303A和S303/7A突变体中S303磷酸化的抑制作用（图。​（图4）4)对应于这些突变体中缺乏sumoylation（图。​（图3B）。3B公司). 此外，S303在S307A突变体中被有效磷酸化（图。​（图4），4)也是SUMO-1改性的良好基质（图。​（图3B3B公司).

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S303在野生型和S307A突变型HSF1中被强烈磷酸化。为了获得二维胰蛋白酶磷酸肽图谱，将野生型（WT）、S303A、S307A或S303/7A HSF1转染到K562细胞中，然后在体内用[32P] 正磷酸盐，并暴露于热冲击（42°C，1 h）下。标记的HSF1用胰蛋白酶消化并通过二维绘图解析。白色箭头表示在S303和S307上磷酸化的磷酸肽。黑色箭头表示磷酸肽在S303或S307上磷酸化。起点表示为“x”

S303/7磷酸抗体的特性。

为了更好地描述S303磷酸化和HSF1琥珀酰化的动力学和相互作用，我们制备了一种针对S303/7磷酸表位的抗体。该抗体识别来自对照和热处理K562裂解物的蛋白带，分别对应于正常和超磷酸化HSF1的大小，可通过将抗体与磷酸肽抗原预孵育来竞争（图。​（图5A）。5A级). 为了进一步评估磷酸化抗体的特异性，通过Western blotting分析S303和S307的免疫沉淀S→A突变体。磷酸抗体特异性地识别在S303和S307上磷酸化的分子，因为磷酸抗体只能有效检测到野生型HSF1，而抗HSF1抗体同样能识别野生型HSF和所有突变体（图。​（图5B）。5亿). 此外，磷酸化抗体识别转染到热休克因子1−/−MEF，表明K298突变没有抑制S303和S307的磷酸化（图。​（图5C）。5摄氏度). 为了阐明在S303/7上磷酸化的HSF1分子在热休克时是否能显示与HSE的结合活性，对K562细胞进行了抗体扰动试验。如图所示。​图5D，第五天在磷酸化抗体1:10稀释后，HSF1-HSE复合物发生超转移，表明在S303/7上磷酸化的HSF1能够与HSE结合。

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磷酸化S303/7特异性抗体的特征。（A） 对K562细胞进行热休克（HS；42°C下1小时）或不处理（C），用SDS-PAGE溶解细胞裂解物并用抗p-S303/7-HSF1抗体进行印迹。通过将抗体与500M过量的游离磷酸肽预孵育来验证特异性（右图）。（B） 用Myc标记的野生型HSF1、S303A、S307A或S303/7A转染K562细胞，并在42℃下对细胞进行1h热休克。HSF1用抗Myc抗体免疫沉淀，免疫沉淀用SDS-PAGE溶解并用抗p-S303/7-HSF1抗体印迹。通过用抗HSF1抗体印迹细胞膜来控制等量的HSF1。（C）热休克因子1−/−用空质粒（模拟）、野生型HSF1或K298R突变体转染MEF。将细胞暴露于1h热休克下，用SDS-PAGE溶解细胞裂解产物，并用抗p-S303/7、抗HSF1和抗Hsc70抗体进行印迹。（D） 按照指示处理K562细胞，将细胞裂解物与免疫前血清（Pre）或磷酸化S303/7-HSF1或总HSF1特异性抗体预先孵育。通过凝胶迁移率变化分析HSE结合HSF1复合物。CHBA，构成性HSE结合活性；NS，非特异性蛋白-DNA相互作用；野生型；免疫沉淀；WB、Western blot。

HSF1的Sumoylation对应于S303/7的热诱导磷酸化。

为了更详细地分析HSF1 sumoylation与S303/7磷酸化的关系，我们在42°C下进行了热休克时程分析。在15分钟的时间点已经观察到HSF1的sumoylation显著增加，此后，sumoylion水平逐渐降低，并在4小时后恢复到对照水平（图。​（图6A）。6A级). 有趣的是，S303/7上的磷酸化也显示出对热应激的强烈而快速的诱导作用，这一点可以通过Western blot中S303/7磷酸化抗体的免疫反应性增加来揭示（图。​（图6B）。6亿). 然而，HSF1 sumoylation的衰减比S303/7磷酸化的衰减发生得更快，S303/7磷酸化仅在2小时后开始下降，在热休克6小时时仍高于对照水平。值得注意的是，S303/7磷酸化和HSF1 sumoylation的信号强度在不同的实验中有所不同，但始终显示出密切的相关性。用较短时间点进行的进一步分析表明，诱导型HSF1 sumoyalization和S303/7磷酸化在6至10分钟时已经被诱导，并在热休克10至15分钟时达到最大水平（数据未显示）。

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S303/7的磷酸化与HSF1的琥珀酰化同时发生。（A） 用Myc标记的野生型HSF1和GFP-SUMO-1共同转染K562细胞，并在指定的时间段内进行热休克。细胞裂解产物用SDS-PAGE溶解，并用抗HSF1抗体进行免疫印迹分析，以确定HSF1的sumoylation水平。抗Hsp90免疫印迹法证实负载量相等。（B） 用单克隆抗HSF1抗体从与A组相同的样品中免疫沉淀HSF1，用SDS-PAGE溶解免疫沉淀，并用抗p-S303/7-HSF1和抗HSF1的抗体进行免疫印迹。（C） 将Myc标记的野生型HSF1、S303/7A或S303/7D与GFP-SUMO-1共转染到K562细胞中，然后在42°C下进行15分钟的热休克。细胞裂解产物用SDS-PAGE溶解，并用抗HSF1抗体进行免疫印迹分析。抗Hsp90免疫印迹法证实负载量相等。野生型；WB、Western blot；IP，免疫沉淀。面板A和C右侧的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。

用一个带负电荷的S303/7D突变体进一步测试了S303/7A突变体对HSF1 sumoylation的抑制作用，该突变体的电荷与磷酸化S303/7的电荷相似。与S303/7A突变体不同，S303/7D突变体被SUMO-1很好地修饰，尽管它没有达到野生型HSF1的sumoylation水平（图。​（图6C），6摄氏度)可能是因为天冬氨酸残基不能完全模拟磷酸化丝氨酸残基的构象。

HSF1 S303/7D在体外优先被酰化。

为了更好地理解磷酸化介导HSF1 sumoylation调控的机制，我们研究了在无细胞系统中模拟S303磷酸化是否也会影响HSF1 sumo ylation。体外苏门答腊酰化试验通过在体外翻译的培养液中进行35S-标记HSF1突变体与SAE1/SAE2（E1）、Ubc9（E2）和SUMO-1的ATP和纯化GST融合。如图所示。​图7，7HSF1在SAE1/SAE2、Ubc9和SUMO-1的存在下被酰化，但如果Ubc9缺失或赖氨酸298突变则不会。GST-标记的SUMO-1附着引起的迁移率变化与体外检测到的雄激素受体的迁移率相当（图。​（图7）7) (46)以及GFP-SUMO-1在体内引起的（图。​（图1）。1). 有趣的是，通过S303/7D突变模拟S303/7磷酸化增加了体外HSF1的sumoylation。这些结果表明，丝氨酸303的磷酸化通过改变HSF1构象，从而暴露sumoylation位点，介导其促sumoylation-促进作用，尽管我们不能排除网织红细胞裂解物中存在磷酸特异性结合伙伴的可能性。

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HSF1 S303/7D在体外优先被酰化。在vitro-translated中，35如图所示，在存在或不存在GST-Ubc9的情况下，将S标记的HSF1突变体和雄激素受体（AR）与纯化的GST-SUMOGG-1（SUMO-1）或GST-SAE1/GST-SAE2（SAE1/SAE2）孵育。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，信号通过荧光成像进行可视化。随着缓慢迁移带的出现，检测到Sumoylation。WT，野生型。

非sumoylated HSF1能够与HSE结合并诱导Hsp70表达。

确定未经处理或热休克时，琥珀酰化对HSF1 DNA结合活性的可能作用热休克因子1−/−通过凝胶迁移率变化分析转染野生型HSF1或K298R突变体的MEF。K298R突变体能够在热休克时与野生型HSF1结合HSE（图。​（图8A），8安)，表明sumoylation对HSF1 DNA结合活性不是必需的。自热休克因子1−/−MEF没有显示热休克诱导Hsp70（图。​（图8B，8B类，右侧面板）(17，35，44)，我们将野生型HSF1或K298R突变体转染到这些细胞中，并分析热休克时Hsp70诱导的挽救。首先，我们确认HSF1在热休克因子1−/−与K562细胞中的MEF相同，K298R突变阻止了sumoylation（数据未显示）。如图所示。​图8B，8B类野生型HSF1和K298R HSF1在热休克反应中同样表达并过度磷酸化，能够在相同程度上挽救Hsp70诱导。

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野生型和K298R HSF1同样能很好地挽救热冲击响应热休克因子1−/−MEF公司。（A） 凝胶迁移率变化测定（上图）在热休克因子1−/−转染野生型或K298R突变型HSF1的MEF未经处理（C）或遭受1小时热休克（HS）。输入的裂解产物通过SDS-PAGE进行解析，并用抗HSF1和抗Hsc70抗体进行印迹（下面板）。（B）热休克因子1−/−用空载体（模拟）或野生型或K298R突变型HSF1转染MEF，不进行处理（C），或进行1h热休克（HS）或1h热冲击，然后进行3h恢复（R）。用抗HSF1和抗Hsp70抗体进行Western blotting分析热休克反应的诱导。抗-Hsc70抗体用于负荷控制。右侧面板显示了在没有HSF1（模拟）的情况下缺乏Hsp70诱导。野生型；WB、Western blot；CHBA，构成性HSE结合活性。

热休克反应开始时HSF1和SUMO-1对核应力颗粒的瞬时共定位。

最后，我们讨论了S303上的磷酸化是否对HSF1的细胞定位有影响，以及HSF1和SUMO-1在热应激下亚核结构的动态形成中的时空关系。为了研究在S303/7上磷酸化的HSF1是否会形成不同于HSF1总库的亚细胞群，HeLa细胞被瞬时转染Myc标记的HSF1，并用p-S303/7-和c-Myc特异性抗体进行双重免疫标记。在正常生长条件下，总HSF1和磷酸抗体反应的HSF1均在细胞核内广泛定位（图。​（图9A，9安，上部面板）。在15分钟的热休克后，HSF1分子的主要部分定位于被称为核应力颗粒的明亮染色的不规则亚核结构，这与几项早期研究一致，这些研究表明应力诱导人类细胞中HSF1颗粒的形成(6，16，18，26，27，28，53). 磷酸化的HSF1定位于与总HSF1相同的颗粒（图。​（图9A，9安，上部面板），表明S303/7上磷酸化的HSF1确实存在于核应激颗粒中。为了验证磷酸化抗体信号的特异性，我们将重组人HSF1与一级抗体一起孵育，这阻断了抗HSF1抗体的功能，但未能影响抗p-S303/7免疫反应性（图。​（图9A，9安，下部面板）。

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HSF1和SUMO-1在热休克反应开始时暂时形成小颗粒。（A） （上面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟或不处理（C）。用抗p-S303/7抗体对甲醇固定细胞进行双重染色，检测磷酸化HSF1和抗Myc抗体定位总HSF1。免疫染色用荧光显微镜分析。在合并的图像中，彩色化可以被视为黄色。DAPI用于核染色。（下面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟。在存在或不存在150μg重组人HSF1（rHSF1）的情况下，用抗p-S303/7和抗HSF1抗体对细胞进行双重染色(17)/ml.（B）HeLa细胞瞬时转染野生型HSF1-Myc和GFP-SUMO-1，并在42°C下热休克指定时间或不处理（C）。用单克隆抗Myc抗体结合红色荧光二级抗体检测HSF1，绿色通道显示GFP-SUMO-1。（C） 将S303A或K298R HSF1突变体与GFP-SUMO-1瞬时转染HeLa细胞。将细胞在42°C下热冲击15分钟，并如上所述进行分析。

除HSF1外，SUMO-1已被证明定位于不同的核体中（有关审查，请参阅参考文献61)这使我们研究了HSF1和SUMO-1亚核定位之间的关系。用Myc-tagged HSF1和GFP-fused SUMO-1共转染HeLa细胞，对其进行不同时间段的热应激，并用荧光显微镜进行分析。在常温下，SUMO-1部分局限于核体，部分扩散分布，但主要是核（图。​（图9B）。9亿). 免疫标记的HSF1也主要是核细胞，但仍呈弥散状态，不集中于含有SUMO-1的体内。热休克反应的诱导导致HSF1的快速重组，因为在热应激5分钟后，一些HSF1定位于染色明亮的核应激颗粒。SUMO-1也显示出颗粒定位，与HSF1部分重叠，因为在大多数细胞中观察到共定位颗粒和非共定位颗粒的混合物。15分钟后，HSF1几乎完全定位于应力颗粒，与SUMO-1的共定位更为显著（图。​（图9B）。9亿). 令我们惊讶的是，HSF1和SUMO-1的共定位在热休克30分钟后就被取消了；虽然SUMO-1表现出点状定位，但HSF1和SUMO-1颗粒之间没有重叠（图。​（图9B）。9亿). 在较长的热处理过程中，HSF1一直处于应力颗粒中，直到数小时后缓慢分解（数据未显示）。

为了探讨S303A突变对HSF1 sumoylation的抑制作用是否反映在HSF1和SUMO-1共粒的形成中，对非磷酸化突变体进行了如上所述的类似实验。S303A HSF1在热休克时定位于核应力颗粒，类似于野生型（图。​（图9C；9摄氏度; 以及9A和B）。这一结果强调了S303的磷酸化不调节HSF1的定位，并排除了S303磷酸化通过亚细胞定位促进HSF1 sumoyalization的可能性。然而，在热冲击15分钟后，S303A HSF1和SUMO-1之间未检测到共定位（图。​（图9C），9摄氏度)表明靶向核应力颗粒的HSF1可以独立于SUMO-1结合发生，而共价SUMO-1偶联需要用于共定位。K298R突变体进一步支持了这一发现，该突变体也定位于应激颗粒，但没有显示与SUMO-1的任何共定位（图。​（图9C）。9摄氏度). 正如预期的那样，在正常生长条件下，S303A和K298R显示出与野生型HSF1相似的扩散核定位（数据未显示）。总之，我们的免疫荧光分析表明，在热休克反应开始时，应激诱导HSF1和SUMO-1显著但短暂地共定位于同一亚核室。HSF1对应激颗粒的定位与S303的磷酸化状态无关，但短暂的HSF1-SUMO-1共定位需要S303磷酸化。

讨论

HSF1是转录因子在严格翻译后控制下的典型例子。尽管有大量证据表明HSF1经历了一个多步骤激活-去激活循环，但我们对HSF1翻译后修饰的调控功能的理解仍然不完整。例如，已经很好地确定HSF1在几个丝氨酸残基上被磷酸化，体磷酸化的诱导与其转录活性正相关，但只有关于单个磷酸化位点的抑制和激活作用的稀少数据可用。最近，琥珀酰化已成为另一种常见的翻译后修饰，主要针对核蛋白，如转录因子。在过去几年中，SUMO靶点的数量迅速增加，但SUMO修饰的功能和调节明显因底物而异。本研究旨在探讨SUMO修改及其对HSF1调控的影响。我们的结果表明，HSF1是调控域内几个磷酸化位点附近赖氨酸298快速和短暂应激诱导的sumoylation的底物。重要的是，发现应激诱导的丝氨酸303磷酸化是SUMO修饰的先决条件，证明了这两个修饰事件的动态协同作用。一种显著但短暂的SUMO-1-HSF1共定位，严格依赖S303磷酸化，表明在热休克反应开始时，SUMO需要在核应激颗粒中发挥某些尚未确定的功能。

热休克反应不同阶段HSF1磷酸化的体内研究受到了多个磷酸化位点的极大挑战，其中大多数位点仍然未知。研究单个磷酸化位点的动态变化的另一个限制因素是体内复杂的重复性差32P标记和磷酸肽定位实验。为了避免这些技术警告，我们生成了一种识别丝氨酸303和307磷酸化状态的磷酸表位特异性抗体。S303/7磷酸化的动力学分析显示，热休克后磷酸化迅速显著增加，持续暴露于热休克期间，在衰减阶段逐渐去磷酸化。这一结果令人惊讶，因为此前的几项研究表明丝氨酸303和307被组成性磷酸化，以在正常生长条件下保持该因子的活性(4，31，32). 此外，我们的实验使用了丝裂原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶信号传导的药理激活剂和抑制剂，这些药物已被证明针对S303/7(4，31，32)，未显示这些位点磷酸化状态的重大变化（数据未显示）。因此，可能有几种激酶能够在体内以细胞特异的方式磷酸化丝氨酸303和307。

在本研究过程中，发表了另一份报告，描述了K298上的严格热诱导HSF1 sumoylation(19). 尽管基本发现相似，但仍存在重大争议。Hong和他的同事们在来自热休克细胞的HSF1免疫沉淀物中显示了一个尖锐的～80-kDa SUMO-1反应带，称为内源性sumoylated HSF1。令人惊讶的是，该条带与超磷酸化HSF1结合。相反，我们发现了一个新的HSF1反应带，其电泳迁移率显著降低，即使SUMO过度表达也会以亚化学计量比出现。Hong和他的同事推测，SDS-PAGE上的迁移率减慢是由热诱导的sumoylation引起的，这是激活HSF1的特征。在我们的研究中，热休克后野生型HSF1和K298R的主要谱带之间的电泳迁移率没有差异，这表明热诱导的80kDa左右的延迟是由过度磷酸化引起的(7，17，31，53，63)而不是苏美化。早期的研究表明(19)体外的sumoyalization将HSF1转化为DNA结合形式，并且通过HeLa细胞中的荧光素酶报告基因测定测量的转录能力被K298R突变完全消除。我们对K298R突变体的DNA结合分析，当转染到热休克因子1−/−MEF不支持SUMO-1调节体内DNA结合的结论，因为在热休克反应中，sumoylation-deficient突变体与野生型一样能够与HSE结合。同样，当野生型HSF1和K298R突变体在缺乏内源性HSF1的MEF中表达时，Hsp70的表达同样被诱导。根据另一项研究(19)HSF1和SUMO-1在长时间暴露于热休克期间也在核体内显示完全共定位。在我们的实验中，显著的共定位仅短暂发生，并且在SUMO-1-HSF1复合物解离后，HSF1仍定位于应力颗粒。此外，S303A和K298R突变体定位于HSF1应激颗粒的能力，尽管缺乏SUMO-1结合和共定位，但不符合sumoylation将调节HSF1定位于应激颗粒的假设。值得注意的是，我们在HeLa细胞中进行了免疫荧光分析，因为我们在热休克因子1−/−MEF公司。事实上，洪和同事的研究(19)据我们所知，这是在小鼠细胞中检测到HSF1颗粒的唯一报告。根据我们的结果，HSF1的sumoylated群体可能具有不同于热休克基因表达调控的应激诱导功能。或者，sumoylation可能有利于HSF1的反式激活能力，这种变化过于微妙和动态，不允许使用现有技术进行检测。总之，HSF1的sumoylation似乎是一个比最初预期的更为复杂和动态的过程，因此，关于SUMO共轭在HSF1的多步激活中的作用的陈述应谨慎对待。

描述各种蛋白质（包括转录调节因子、剪接因子和SUMO底物）的亚核区隔化的报告清单正在快速增长。尽管在许多情况下，功能意义仍然缺失，但预计需要在细胞核的同一限制性隔室中存在某些调节蛋白，以增强同一调节单元的不同成员之间的相互作用和串扰。SUMO-1已在其他地方被证明将其许多底物靶向核结构，称为PML体或POD（有关审查，请参阅参考文献57). 这似乎不是HSF1的情况，因为我们使用sumoylation-deficient HSF1突变体进行的分析提供了证据，证明当结合被阻断时，SUMO-1和HSF1定位于不同的结构。由于这些HSF1突变体定位于与野生型类似的核应激颗粒中，很可能HSF1的SUMO-1修饰不需要用于颗粒形成。这与科托及其同事的早期研究一致(6)表明HSF1不与PML体共定位。然而，我们在热休克反应开始时的5到15分钟时间窗内观察到的HSF1-SUMO-1小颗粒证明了亚核结构的高度动态性。这些结果强调了核体对特定刺激的巨大重组潜力，因此，被视为不同实体的核结构的组成可能会以条件依赖的方式发生变化。鉴定亚核小室的新成员虽然具有挑战性，但应能提供更多关于这些核结构的生物学作用和相互作用的机制性见解。

磷酸化和琥珀酰化的协同调控似乎是几个SUMO靶点的共同特征。Desterro和同事(9)表明SUMO-1修饰可拮抗泛素化，从而降解IκBα。泛素化和sumoylation模式之间的转换由磷酸化调节，因此未磷酸化的IκBα有利于SUMO-1的并入，而磷酸化触发泛素化与降解。同样，对PML和c-Jun的研究表明，在诱导磷酸化时抑制了琥珀酰化(39，40). 在c-Jun的情况下，丝氨酸63和73的非磷酸化状态促进赖氨酸229的sumoylation，表明一级结构中修饰位点的相互接近不一定是协同调控的必要条件(39). 有趣的是，我们对HSF1的研究提供了一个与上述相反的例子，表明磷酸化也可以积极调节淀粉酰化。sumoylation位点和调节性磷酸化位点的空间邻近性表明磷酸化可以改变HSF1构象，从而使SUMO靶赖氨酸暴露于修饰机制。这一假设得到了以下发现的支持：S303/7D突变体模拟磷酸化HSF1是体外sumoylation试验中的首选底物，该试验仅使用纯化的E1和E2酶以及SUMO-1。此外，我们没有检测到野生型HSF1和S303A突变体的定位之间的任何差异，排除了磷酸化通过亚细胞靶向调节HSF1 sumoylation的可能性。对HSF1特异性sumoylation机制的体内成分以及磷酸化介导的信号级联的持续研究有望进一步阐明这两种翻译后修饰之间的相互关系，并最终揭示HSF1 SUMO-1修饰的调控。

致谢

我们感谢Ivor J.Benjamin（西南医学中心）热休克因子1−/−MEF和Anne Dejean、Ronald Hay和Hetti Poukka为质粒。洛伦斯·波林格（Lorenz Poellinger）、努拉·科塔亚（Noora Kotaja）和约翰·埃里克森（John E.Eriksson）因富有成果和令人鼓舞的讨论而受到表彰，海伦娜·萨伦托（Helena Saarento）因技术娴熟而受到表扬。我们感谢Minna Poukkula和Pia Roos-Mattjus对手稿的评论。

这项工作得到了芬兰科学院、芬兰癌症组织、Sigrid Jusélius基金会和Borg基金会（奥博阿卡德米大学）的支持。V.H.和M.H.得到了图尔库生物医学研究生院的支持。

参考文献

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文章来自分子和细胞生物学由以下人员提供泰勒和弗朗西斯