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基因发育。2002年4月15日；16(8): 919–932.
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SETDB1：一种新的KAP-1相关组蛋白H3，赖氨酸9特异性甲基转移酶，可通过KRAB锌指蛋白促进HP1介导的常染色体基因沉默

大卫·C·舒尔茨,1,2 卡西拉詹·艾亚纳坦,德米特里·内戈列夫,格德·摩尔（Gerd G.Maul），以及Frank J.Rauscher，三世2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

组蛋白的翻译后修饰已成为真核基因表达的关键调控信号。最近的遗传学和生物化学研究将H3-赖氨酸9（H3-K9）甲基化与HP1介导的异染色质形成和基因沉默联系起来。然而，针对特定基因并协调这些活动的机制尚不清楚。在这里，我们报道了转录沉默子KRAB-ZFP超家族的KAP-1共表达子与SETDB1结合，SETDB1是一种具有组蛋白H3-K9特异性甲基转移酶活性的新型SET域蛋白。虽然H3 N末端尾部的乙酰化和磷酸化深刻影响了SETDB1对H3-K9甲基化的效率，但我们发现H3-K4甲基化并不影响SETDB1介导的H3-K8甲基化。SETDB1对组蛋白H3 N末端尾部的体外甲基化足以增强HP1蛋白的结合，这需要完整的色域和色影域。间期细胞核的间接免疫荧光染色主要将SETDB1定位于常染色区，而常染色区与HP1染色在染色质的非常染色区重叠。此外，KAP-1、SETDB1、H3-MeK9和HP1在KRAB–KAP-1阻遏系统沉默的常染色基因的启动子序列中富集。因此，KAP-1是一种分子支架，由KRAB-ZFPs靶向特定位点，并协调组蛋白甲基化和HP1蛋白沉积以沉默基因表达。

关键词：组蛋白甲基化，SET结构域，染色质，KRAB结构域

含有修饰核心组蛋白N末端尾部的酶活性的大分子蛋白质复合物已成为真核生物基因表达的关键调节器。组蛋白修饰的星座，包括乙酰化、磷酸化、泛素化和甲基化，产生与基因转录活性相关的协同和拮抗信号。这种新出现的组蛋白密码被假设为在染色质中创建一个被非组蛋白染色体蛋白识别的结构，从而影响转录活性染色质域与转录沉默染色质域之间的动态转换(Jenuwein和Allis 2001). 此外，这些组蛋白修饰和识别这些信号的染色质相关蛋白的组合性质可能代表了一个表观遗传标记系统，该系统负责在细胞分化和有机体发育期间设置和维持基因表达的可遗传程序。

组蛋白乙酰化和磷酸化在转录调控中的作用已被广泛描述(Cheung等人，2000年;斯特拉尔和艾利斯2000;伯杰2001). 虽然组蛋白的精氨酸和赖氨酸甲基化在体内发生已经得到很好的证实，但这些特定修饰的功能仍有待全面描述(Strahl等人，1999年). 与组蛋白乙酰转移酶（HATs）和脱乙酰化酶（HDACs）的发现类似，组蛋白甲基化在染色质结构和基因表达调控中的作用已通过识别相关酶而大大促进。发现核受体共激活物相关蛋白CARM1是H3特异性精氨酸甲基转移酶黑腹果蝇异染色质蛋白Su（var）3-9是H3特异性赖氨酸甲基转移酶，显著支持组蛋白甲基化参与基因调控(Chen等人，1999年;Rea等人，2000年). 在后一种情况下，甲基化对Lys 9具有高度选择性，甲基转移酶功能映射到进化上保守的SET结构域同源性(Rea等人，2000年). H3-K9甲基化（H3-MeK9）标记为异染色质蛋白HP1家族通过其色域招募建立了一个高亲和力结合位点(Jacobs等人2001;Jacobs和Khorasanizadeh，2002年). 此外，遗传实验将Swi6和HP1在浓缩染色质序列中的定位分别与Clr4和SUVAR39H1的组蛋白甲基转移酶活性联系起来(Bannister等人，2001年;Lachner等人，2001年;Nakayama等人，2001年). 因此，大量的遗传学、生物化学和细胞学证据将组蛋白H3-K9的选择性甲基化和HP1蛋白的沉积与转录被表观遗传学沉默的染色质序列联系起来。其他研究表明，H3-MeK9表位在整体上区分体内转录沉默和活性染色质结构域，组蛋白H3 Lys 9的甲基化代表X失活期间X染色体上的早期分子标记(Heard等人，2001年;Litt等人，2001年;Noma等人，2001年;Boggs等人，2002年). 然而，靶向H3-K9甲基化并协调HP1沉积的机制顺式体内的调控序列尚待完全确定。

能够协调这些活动的分子的主要候选物是KAP-1辅阻遏物。该蛋白作为人类基因组编码的>220 KRAB域锌指蛋白（ZFPs）的通用、强制性辅抑制剂(Friedman等人，1996年). 每个KRAB-ZFP包含一个直接与KAP-1结合的N端75氨基酸KRAB盒和一个C端阵列2H（H）2锌指介导序列特异性DNA结合(Mark等人，1999年). KAP-1的三部分RBCC区域作为一个完整的结构单元发挥作用，这对于齐聚和KRAB结合是必要和充分的（图。​（图1A；1A；Peng等人，2000a,b条). KAP-1的PHD指和溴代多巴胺形成一个协同转录抑制单位，该单位招募NuRD HDAC复合物(Capili等人，2001年;Schultz等人，2001年). KAP-1中包含核心PxVxL基序的单独阻遏结构域直接与HP1蛋白家族的色影结构域结合(Ryan等人，1999年;Lechner等人，2000年). 从这些数据中，我们假设KAP-1起到支架的作用，进而协调大分子复合物的活动，这些大分子复合体修饰染色质结构，使基因表达沉默。由于HP1色域可以与组蛋白H3的甲基化Lys 9结合，我们推断体内KAP-1阻遏复合物可能含有组蛋白H3-K9甲基转移酶活性，其功能是协调HP1介导的对KRAB-ZFP靶基因转录的阻遏。

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KAP-1共抑制剂与假定的组蛋白甲基转移酶SETDB1相互作用。(A类)KAP-1增压器示意图。齐聚和KRAB结合域映射到KAP-1的RBCC区域。染色体蛋白HP1家族的染色体阴影结构域直接与KAP-1中的PxVxL基序结合。PHD指和KAP-1的溴代多巴胺形成协同抑制结构域，与Mi-2α和SETDB1相互作用。(B类)KAP-1 PHD指和溴代多巴胺与Mi-2α（KIP54）和SETDB1（KIP21和KIP 41）相互作用。(C类)削弱KAP-1转录抑制的PHD指和溴结构域的突变削弱了与SETDB1（KIP21）的关联。(D类)来自转染HEK293细胞的抗Flag免疫纯化SETDB1的考马斯蓝染色。MS/MS肽鉴定，最终鉴定出11个KAP-1重叠肽，如右图所示，为单字母氨基酸缩写。(E类)HEK293转染的核提取物中Flag免疫沉淀物的抗KAP-1蛋白免疫印迹。

结果

KAP-1与一种新的SET域蛋白SETDB1相关

为了确定KAP-1定向转录抑制的效应器，我们在双杂交筛选中使用了KAP-1的PHD指和溴代多巴胺作为诱饵。我们之前报道了NuRD组蛋白去乙酰化酶复合物的Mi-2α亚基的一种新的亚型的鉴定，该亚基与该二分抑制结构域结合(Schultz等人，2001年). 在这里，我们报道了KAP-1与两个独立重叠氨基酸序列（KIP21和KIP41）特异性相关，这两个氨基酸序列由假定的组蛋白甲基转移酶（HMTase）基因编码设置DB1（图。​（图1B；1B类；Harte等人，1999年). 如图所示​图1C，1C、 对KAP-1 PHD指和溴代多巴胺的抑制活性有害的突变显著损害了KAP-1和SETDB1或Mi-2α之间的联系(Schultz等人，2001年). 注意，一些突变对Mi-2α和SETDB1结合有不同影响，这增加了Mi-2α与SETDB1可能结合到KAP-1蛋白不同表面的可能性。为了在体内确认KAP-1和SETDB1之间的关联，我们从转染的HEK293细胞中生成了一个全长Flag-epitope-tagged表达载体和免疫纯化的SETDB1。多肽的光谱经过MS/MS肽分析，最终确定KAP-1是一种非化学计量的相关多肽（图。​（图1D、E）。1D、 E）。在KAP-1开放阅读框的重要部分（氨基酸239–790）中鉴定出11种KAP-1多肽。从这些数据中，我们得出结论，KAP-1辅升压因子在体内与SETDB1蛋白相互作用。

SETDB1是一种新型组蛋白H3特异性甲基转移酶

SETDB1的一级氨基酸序列揭示了几个有趣的特征基序，包括MeCP2家族的CpG-DNA甲基结合域，以及与SET的同源性(S公司uVar3-9，E类Zeste的nhancer，T型rithorax）域（图。​（图2A）。2A） ●●●●。有趣的是，SETDB1的SET结构域同源性被347-氨基酸插入中断，从而产生一个分叉结构域(Harte等人，1999年). 从人类蛋白质到低等真核生物，这种独特的插入在进化上是保守的，包括秀丽隐杆线虫和D.黑腹果蝇，表明SET结构域可能具有功能可分离的结构域。先前已经证明，SUV39H1的SET域同源性和两个相邻的富含半胱氨酸的区域（SET前和SET后）具有内在组蛋白甲基转移酶（HMTase）活性，该活性依赖于所有三个域的完整性(Rea等人，2000年). 为了测试SETDB1是否具有内在HMTase活性，我们表达并纯化了两种不同的重组GST–SETDB1融合蛋白，它们编码整个假定的催化域（氨基酸分别为585–1291和661–1291）。与重组PRMT1、SUV39H1和G9a蛋白不同，重组SETDB1蛋白未能显示核心组蛋白的任何明显甲基化（图。​（图2B）。2B） ●●●●。然而，从瞬时转染的HEK293细胞中免疫纯化的SETDB1（图。​（图1D）1D） 显示了核心组蛋白和单核小体底物的组蛋白H3特异性甲基转移酶活性（图。​（图2C）。2C） ●●●●。从杆状病毒感染的Sf9细胞提取物中表达并亲和纯化到接近同质性的SETDB1蛋白，观察到相同的酶活性（图。​（图2E）。2E） ●●●●。因此，我们假设SETDB1可能需要翻译后修饰或小分子量细胞辅因子才能发挥组蛋白甲基化酶的功能。

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SETDB1是组蛋白H3特异性甲基转移酶。(A类)SETDB1蛋白质的示意图。指出了C末端SET前、SET和SET后（C）同源物的位置。SET结构域中347个氨基酸的插入由灰色方框表示。（MBD）CpG DNA甲基结合域。最小KAP-1相互作用域（KID）由双杂交克隆KIP21中的SETDB1氨基酸定义。图示了用于制备多克隆抗体的SETDB1（氨基酸1-377）区域。(B类)示意图(顶部)重组GST-PRMT1、GST-SUV39H1、GST-G9a和GST-SETDB1组蛋白甲基转移酶蛋白和酶活性(底部)亲和纯化蛋白的表达大肠杆菌考马斯染色显示亲和纯化的GST蛋白。自动射线照片显示[三H] 甲基标记组蛋白H3和H4来自于体外HMTase检测和每个甲基转移酶。(底部考马斯染色法表示每个反应中等量的核心组蛋白八聚体，其身份分别标记。(C类)瞬时转染HEK293细胞的抗Flag免疫纯化SETDB1肽洗脱液（图。​（图1D）1D） 在以核心组蛋白或鸡红细胞单核小体为底物的体外HMTase检测中显示组蛋白H3特异性甲基转移酶活性。考马斯蓝染色显示组蛋白负载。自动射线照片显示相应[三H] 甲基标记产品。(D类)亲和纯化在Sf9杆状病毒感染细胞中表达的酶活性SETDB1的策略。(E类)考马斯染色显示镍2+-杆状病毒感染的Sf9细胞中NTA和α-Flag M2亲和纯化的SETDB1。自动射线照片说明[三H] 甲基标记组蛋白H3。在纯化过程中，Western blot证实了SETDB1的身份。(底部小组）考马斯染色，表示每个反应中等量的核心组蛋白八聚体。

为了评估SET前、SET和SET后结构域在HMTase活性中的作用，我们设计了几个SETDB1突变体（图。​（图3A）。三A） ●●●●。至少在该分析系统中，含有SET后结构域缺失和C末端SET同源性的蛋白质的HMTase活性显著受损。此外，每个亚结构域中高度保守残基上的单一氨基酸替换将甲基化酶活性降低到无法检测的水平。然而，假定KAP-1相互作用域（KID）的缺失增加了活性。MBD同源性中的点突变对这种酶的活性没有影响（图。​（图3B）。三B） ●●●●。因此，与组蛋白甲基转移酶SET结构域家族的其他成员类似，SETDB1需要SET前、SET后和SET后同源性才能在体外进行完全酶活性。值得注意的是，SET结构域中独特的347-氨基酸插入似乎对SETDB1的催化活性没有影响。这些数据支持先前的假设，即SET结构域在结构上可能由两个可分离的功能域组成(Katsani等人，2001年). 此外，甲基转移酶活性显然不需要与KAP-1结合。尽管我们不能排除SETDB1免疫纯化制剂中存在的其他内源性多肽的作用，但从Sf9杆状病毒感染的细胞提取物中纯化SETDB1到接近同质性表明，它足以介导组蛋白甲基化（图。​（图2E）。2E） ●●●●。

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SETDB1选择性地甲基化组蛋白H3的Lys 9。(A类)图示综合引入MBD、前SET、SET和后SET结构域的单个氨基酸取代的相对位置的示意图，如图所示。(B类)催化结构域内高度保守残基（前SET、SET和后SET）的SET后同源性和部分SET同源性的缺失以及单个氨基酸突变会削弱SETDB1的H3-甲基化酶活性。抗Flag蛋白印迹证实了所示蛋白的表达和Flag免疫纯化。ΔKID和ΔSET蛋白分别对应于SETDB1的570–1291和1–951氨基酸。(C类)组蛋白H3（1–30）N末端尾部的氨基酸序列如顶部突出显示K4、K9和K27残基。指出了K4、K9和K27中的各种赖氨酸到精氨酸突变，以确定SETDB1的底物特异性。K4、K9和K27的所有赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变都被装箱。(D类)SETDB1甲基转移酶活性对K9高度特异。在使用标记纯化的SETDB1进行的体外HMTase检测中，使用5毫克相应的GST–H3N蛋白作为底物（图。​（图1D）。1D） ●●●●。考马斯蓝染色显示纯化的GST组蛋白H3底物。自动射线照片显示相应[三H] 甲基标记产品。Western blot证实HMTase反应中存在Flag-SETDB1。

SETDB1是一种高选择性的H3-K9甲基转移酶

为了通过SETDB1确定H3甲基化的位点特异性，我们使用了一系列纯化的、重组的GST组蛋白尾部蛋白和几个赖氨酸-精氨酸替代物作为底物（图。​（图3C；三C类；Tachibana等人，2001年). 我们发现SETDB1的H3甲基化对Lys 9具有高度选择性（图。​（图3D）。三D） ●●●●。K4、K9和K27分别突变为精氨酸的底物（NT）未能甲基化。具有赖氨酸-精氨酸双重突变的底物（N4、N9、N27）显示了底物的甲基化，只保留了K9（N9）。在K9（K9R）具有单一精氨酸取代的底物证实了SETDB1对K9的特异性。这些数据证实，SETDB1对H3-K9甲基化不需要对底物进行额外的翻译后修饰（即乙酰化、磷酸化、甲基化）。此外，当K9突变为精氨酸（K9R）时，SETDB1没有改变其对K27的特异性，尽管该残基位于一个惊人相似的氨基酸序列（TKxxAR）中K（K）S） 与K9相同。

SETDB1的组蛋白编码和H3-K9甲基化

接下来，我们确定组蛋白尾部先前存在的修饰是否会影响SETDB1甲基化其底物的能力。从小牛胸腺分离的核心组蛋白用组蛋白去乙酰化酶复合物NuRD的催化量均匀纯制备物进行预处理（数据未显示）。然后我们评估了SETDB1甲基化该去乙酰化核心组蛋白八聚体底物的效率。如图所示​图4A，4A、 用纯化的NuRD复合物预处理组蛋白底物导致甲基化大约增加两倍，这与H3乙酰化的总体减少一致，表明甲基化的位点是天然乙酰化的，或者H3的整体乙酰化干扰了酶对底物的识别。

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通过SETDB1解剖组蛋白代码和甲基化。(A类)用同质纯组蛋白脱乙酰化酶复合物NuRD预处理核心组蛋白底物，可在体外增强组蛋白H3的甲基化，同时伴有组蛋白H4的脱乙酰化（抗AcH3 Western blot）。考马斯蓝染色显示组蛋白负载量相等。自动射线照片显示相应[三H] 甲基标记产品。抗-SETDB1和抗HDAC2蛋白质印迹显示SETDB1和HDAC在相应的HMTase反应中的存在。(B类)组蛋白修饰对SETDB1酶活性的影响。与组蛋白H3和H4的N末端尾部相对应的1微克未修饰或乙酰化（K9-Ac、K14-Ac、K9、K14-Ac）、磷酸化（S10-phos）或甲基化（K4-diMe、K9-diMe）肽用作带标记纯化SETDB1的体外甲基化分析的底物。甲基化通过过滤器结合试验定量，并表示为合并的每分钟原始计数（C.P.M.）。

为了确定组蛋白H3的哪些翻译后修饰（即乙酰化、甲基化和磷酸化）影响SETDB1甲基化酶的活性，我们针对一组具有单个修饰或组合修饰的肽底物测试了SETDB1的活性（图。​（图4B）。4B） ●●●●。标记纯化的SETDB1使未修饰的H3底物强烈甲基化，但不使H4肽甲基化。有趣的是，在K4甲基化的肽底物对这种活性没有明显影响。正如预期的那样，H3-K9的任何修饰（甲基化或乙酰化）都会抑制SETDB1介导的甲基化。此外，S10的磷酸化或K14的乙酰化也显著抑制底物的甲基化。这些观察结果与之前针对相关K9-特异性组蛋白H3甲基转移酶SUV39H1观察到的结果类似，表明这些蛋白质可能以类似的方式识别底物，并具有类似的催化机制。因此，我们得出结论，在体内，SETDB1在靶位点内甲基化组蛋白的能力可能需要与脱乙酰酶复合物和假定的组蛋白磷酸酶进行协调。

SETDB1的H3-K9甲基化增强HP1结合

由于HP1蛋白与甲基化的K9组蛋白肽结合，我们测试了SETDB1是否可以刺激HP1与组蛋白H3的N末端尾部结合。如图所示​图5，5，通过SETDB1使GST-H3和GST-N9底物甲基化显著提高了HP1α与组蛋白H3的N末端尾部结合的效率。这种结合活性被HP1α的色域（V21M）突变所消除。此外，影响HP1α二聚化的色影结构域（I165K）突变显著损害了HP1：组蛋白相互作用(Lechner等人，2000年). 从这一系列数据中，我们得出结论，SETDB1是一种高度选择性的组蛋白H3-K9甲基化酶，完全能够刺激HP1蛋白与组蛋白H3的结合。

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组蛋白H3-K9的SETDB1甲基化增强HP1结合。HP1α和GST–H3N之间的体外GST结合试验。GST–H3N底物用Flag-purified SETDB1预甲基化（图。​（图1D）1D） 和15μMS公司-腺苷-L-甲硫氨酸（Sigma）。35S-L-甲硫氨酸标记的体外翻译HP1α蛋白与甲基化GST-H3N蛋白孵育。HP1-组蛋白复合物通过变性洗脱并在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，结合的HP1α通过荧光成像显示。考马斯蓝染色显示纯化的甲基化GST组蛋白H3底物。右侧的HP1α示意图说明了该蛋白家族的结构域组织（CD，色域；CSD，色影域）以及V21M和I165K突变的相对位置(Lechner等人，2000年).

内源性SETDB1是一种常染色体H3特异性甲基转移酶

为了证实内源性SETDB1具有甲基转移酶活性，我们产生了一种特异性识别该蛋白的多克隆抗体（图。​（图2A）。2A） ●●●●。磷酸纤维素分馏可溶HeLa核提取物的Western blot分析表明，SETDB1主要在0.1 M和0.3 M KCl洗脱液中洗脱，而SUV39H1存在于0.5 M和1.0 M KCl洗脱液中。含有这两种蛋白质的组分显示出强大的H3甲基化酶活性（图。​（图6A）。6A） ●●●●。针对SETDB1的抗体可有效地免疫耗尽0.1 M P11提取物中的几乎所有组蛋白H3甲基化酶活性，而不会影响H4活性（图。​（图6B）。6B） ●●●●。此外，SETDB1免疫沉淀物的颗粒保留了很强的组蛋白H3活性，该活性与提纯的SETDB1相当（图。​（图1D）。1D） ●●●●。这些观察强烈表明内源性SETDB1代表丰富的组蛋白H3甲基转移酶。NIH/3T3细胞异步群体的间接免疫荧光染色显示，通过Hoechst染色和HP1α单克隆抗体的免疫染色，SETDB1主要定位于间期细胞核的常染色区，并被排除在核仁和浓缩染色质岛之外（图。​（图6C）。6C） ●●●●。然而，在细胞核的常染色区，SETDB1和HP1α之间存在显著重叠。因此，我们认为SETDB1独立于SUV39H1/H2起作用，是一种细胞HMTase，负责在细胞内维持H3-K9甲基化Suv39小时双敲除鼠标(Peters等人，2001年).

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内源性SETDB1代表主要组蛋白H3特异性甲基转移酶。(A类)HeLa核提取物中H3特异性甲基转移酶的生化分离。如前所述，通过磷酸纤维素（P11）色谱分离HeLa核提取物(Bochar等人，2000年). HMTase活性通过体外甲基化试验进行监测。通过Western blot分析监测SETDB1和SUV39H1从P11柱中的洗脱。(B类)SETDB1免疫缺失核提取物的上清液缺乏H3 HMTase活性。我们用蛋白A-琼脂糖和亲和纯化的抗GST或抗SETDB1 IgG孵育150μg 0.1 M P11分离的核提取物。对来自这些免疫沉淀物的上清液和颗粒进行HMTase活性分析。考马斯蓝染色显示每个反应中核心组蛋白底物的数量相等。自动射线照片显示相应[三H] 甲基标记产品。抗-SETDB1蛋白印迹显示，0.1 M P11提取物中的SETDB1具有高效的免疫耗竭作用。(C类)NIH/3T3细胞间期细胞核的间接免疫荧光。通过Hoechst染色和单克隆HP1αIgG（德克萨斯红）观察到，亲和纯化的多克隆SETDB1特异性IgG对间期核（FITC）常染色核区域进行全局染色，在富含A-T的浓缩染色质区域几乎没有重叠。

SETDB1增强由KRAB–KAP-1阻遏系统稳定沉默的内源性位点上的H3-K9甲基化和HP1

上述结果表明，SETDB1的功能是使细胞核常染色区的组蛋白H3-K9甲基化，以促进HP1沉积。此外，我们的生化数据表明，KRAB-ZFP–KAP-1阻遏复合物可以通过SETDB1促进HP1蛋白沉积以沉默基因表达，从而靶向内源性基因启动子的H3-K9甲基化。为了验证这一假设，用含有稳定整合的常色萤光素酶转基因的细胞系进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，该转基因受到KRAB介导的抑制（图。​（图7A）。7A） ●●●●。该双质体系统基于激素调节的DNA-结合KRAB结构域融合(Ayyanathan等人，2000年)和一个TK-核糖核酸酶报告子转基因作为其靶点。融合蛋白完全能够与KAP-1和HP1形成三元复合物（数据未显示）。对含有这两种质粒的克隆NIH3T3细胞系的综合分析表明：（1）KRAB结构域是一个整合靶基因的强阻遏物；（2） 阻遏的范围相对较短，伴随着启动子区域的染色质致密化和富含浓缩染色质的亚核区的空间募集；（3） α/γ蛋白以高度定位的方式与被抑制的基因物理相关。最值得注意的是，可以从激素处理过的人群中分离出大部分细胞，在没有激素的情况下，转基因保持沉默表达状态超过40倍，表明沉默状态是有丝分裂遗传的。

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KRAB–KAP-1阻遏系统以SETDB1为靶点，增强H3-K9甲基化和HP1向转录沉默基因启动子的募集。(A类)用于在NIH/3T3细胞中创建由异源KRAB阻遏蛋白调节的稳定整合荧光素酶转基因的双质体系统的示意图。数字箭头表示用于PCR扩增ChIP保留的DNA的PCR引物的相对位置。(B类)两个单细胞亚克隆，包含异源KRAB–PAX3–HBD转录阻遏物和整合的萤光素酶转基因，在激素处理后表达（cl-49）或稳定沉默（cl-74）。在亚融合细胞群中测量荧光素酶活性，并以每毫克蛋白质的相对光单位报告。(C类)ChIP实验显示KAP-1和SETDB1在TK公司细胞中荧光素酶转基因的启动子区域，其中荧光素酶基因的转录已被稳定沉默（cl-74）。用亲和纯化的KAP-1或SETDB1 IgG免疫沉淀来自cl-49和cl-74细胞的甲醛交联染色质。用PCR从1%的输入染色质中确定cl-49和cl-74核小体制剂中等量的启动子序列。PCR-扩增的DNA片段如所示A类.cl-2代表阴性对照细胞系。(D类)交联染色质与KAP-1、SETDB1、HP1α和MeK9抗血清的ChIPC类.每条车道下方的粗体数字表示扩增DNA的数量，表示为扩增输入DNA的信号强度百分比。

该系统为哺乳动物细胞系（K.Ayyanathan和F.J.Rauscher III，预备）中的常染色基因表达的HP1依赖性沉默和变异提供了一个模型，我们已按如下所述使用它来评估SETDB1和组蛋白H3 MeK9在稳定沉默荧光素酶转基因中的作用。我们使用的克隆细胞系要么表现出荧光素酶（cl-49）的稳健表达，要么显示出荧光素酶转基因（cl-74；图。​图7B）。7B） ●●●●。在含有沉默荧光素酶转基因（cl-74）的细胞中，ChIP实验表明，KAP-1和SETDB1都容易交联到荧光素素酶转基因，并且在整合报告者的TK启动子区域周围显著共定位。相反，通过ChIP分析，在细胞（cl-49）的TK启动子区域检测不到KAP-1和SETDB1，显示出显著的荧光素酶活性（图。​（图7C）。7C） ●●●●。此外，我们观察到这些蛋白很少与连接的Zeocin抗性位点的启动子区域结合，该启动子区域位于TK启动子下游近3.0kb处，或者与同一细胞中存在的未连接的新霉素抗性基因结合（图。​（图7C）。7C） ●●●●。仅含有整合荧光素酶转基因的细胞克隆群体未显示KAP-1或SETDB1在TK启动子区域的任何定位，这表明KAP-1和SETDB1招募需要DNA-结合的KRAB阻遏模块（数据未显示）。接下来，我们确定SETBD1在TK启动子区域的定位是否增强了H3-K9甲基化和HP1的招募。如图所示​图7D，7D、 这两个细胞系之间的比较表明，HP1α及其染色质配体H3-MeK9富含含有TK启动子序列的染色质，该启动子序列位于激素诱导的稳定沉默转基因细胞中。这些数据表明，KAP-1辅阻遏物作为一个分子平台，协调组蛋白甲基转移酶的顺序招募和常染色体位点HP1的沉积，以稳定沉默有丝分裂遗传的基因表达。

讨论

组蛋白修饰在染色质结构调控和真核基因表达调控中的作用正在迅速确定(斯特拉尔和艾利斯2000;Jenuwein和Allis 2001年). 这些研究中出现的假设是，对同一核小体内的组蛋白或其他组蛋白的修饰组合会创建一个索引系统，该系统可以格式化染色质以正确表达基因组的遗传信息，并有助于建立专门的核结构。然而，理解所有这些组蛋白修饰的关键问题包括：（1）它们是如何靶向特定基因调控元件的？（2） 哪些非组蛋白染色体蛋白解释了组蛋白密码？（3） 对这个密码的识别是如何转化为基因活动的变化的？

在这里，我们报告了序列特异性转录抑制因子KRAB-ZFP家族的KAP-1共表达子与组蛋白H3 Lys 9甲基转移酶SETDB1相关，并将其靶向被模型KRAB抑制蛋白转录沉默的基因启动子。催化结构域（包括SET前、SET和SET后结构域）中保守氨基酸残基的突变会显著削弱SETDB1的酶活性。尽管H3 N-末端尾部的乙酰化和磷酸化严重影响SETDB1对H3-K9甲基化的效率，但我们发现H3-K4甲基化的底物不会影响SETDB1对H3-K9的甲基化。SETDB1对组蛋白H3的N末端尾部进行体外甲基化足以增强HP1蛋白的结合。令人惊讶的是，SETDB1只定位于间期细胞核的常染色区，而在染色质的非中心区与HP1染色重叠。此外，我们表明SETDB1可以通过KAP-1辅阻遏物靶向稳定沉默的常染色体基因。此外，SETDB1的招募增强了H3-K9和HP1的本地化顺式-KRAB–KAP-1阻遏系统沉默的基因调控序列。我们提出KRAB ZFPs与其同源识别序列结合，然后募集KAP-1形成支架，该支架协调组装组蛋白脱乙酰酶、组蛋白甲基化酶和HP1蛋白的沉积，通过形成兼性异染色质环境来沉默基因表达。

SETDB1介导K9甲基化

具有高度保守的SET结构域的蛋白质作为赖氨酸特异性组蛋白甲基转移酶的发现，彻底改变了组蛋白甲基化在新兴组蛋白编码中的作用(Rea等人，2000年). 对SETDB1一级氨基酸序列的分析表明，存在与SUV39H1蛋白家族的SET前、SET和SET后结构域高度同源的氨基酸模块（数据未显示）。有趣的是，SETDB1的SET域同源性被347-氨基酸插入所中断，该插入在低等真核生物的同源蛋白质中进化上保守。虽然在我们的甲基转移酶检测中，由最小催化结构域（前SET、SET和后SET结构域）组成的重组SETDB1没有活性，但从真核细胞提取物中纯化的SETDB1使用小牛胸腺核心组蛋白、鸡单核小体或H3N末端肽作为底物显示出强大的H3特异性HMTase活性。目前尚不清楚为什么重组SETDB1蛋白与作为重组蛋白活性的其他组蛋白甲基转移酶（SUV39H1、G9a、PRMT1）相比没有活性。虽然我们不能排除NAD或FAD等小分子量辅因子，但我们支持这样一种假设，即SETDB1必须对细胞蛋白辅因子的活性进行翻译后修饰，因为SETDB1在杆状病毒感染的Sf9细胞中表达，并且亲和力纯化到接近同质性，足以显示与内源性SETDB1来源相同的酶活性。在酶活性SETDB1的亲和纯化过程中，我们始终观察到两种形式。此外，我们通过SDS-PAGE/Western blotting发现慢迁移蛋白物种与SETDB1的酶活性之间存在紧密的相关性（图。​（图3B）。三B） ●●●●。迁移速度较快的物种可能是一种降解产物。然而，肽映射实验显示，这两个物种的肽谱发生了变化，这与小分子量修饰一致。在这方面，我们发现SETDB1在非同步细胞群中构成磷酸化，这一发现与SUV39H1家族的其他成员一致（D.C.Schultz和F.J.Rauscher III，未获证实）。然而，需要确定SETDB1翻译后修饰的确切类型和程度，以全面评估它们在其酶活性中的作用。

K9甲基化的机制

虽然组蛋白甲基化早已确立，但直到最近才开始阐明染色质结构和基因转录调节中位点特异性甲基化的功能后果。最近发现H3-MeK9标记建立了一种高亲和力配体，用于结合异染色质蛋白的HP1家族，并将其定位在适当的亚细胞位置，这为组蛋白修饰和抑制染色质环境之间的基因表达提供了第一条联系(Bannister等人，2001年;Jacobs等人，2001年;Lachner等人，2001年;Nakayama等人，2001年;Jacobs和Khorasanizadeh，2002年). 在这里，我们表明通过SETDB1对重组组蛋白H3 N末端尾部进行从头甲基化足以增强HP1结合的亲和力。此外，SETDB1募集到KRAB–KAP-1抑制系统靶向抑制的染色单体基因座，与H3-K9甲基化和HP1沉积的显著富集相吻合。在体外和体内实验中，HP1结合增强完全依赖于H3-K9甲基化。正如预期的那样，HP1在体外与甲基化组蛋白尾部结合需要一个功能性染色域。此外，我们发现最佳HP1结合还需要一个功能性色影结构域，因为破坏HP1蛋白二聚化的突变显著削弱了这种关联。因此，HP1与甲基化H3-K9的结合并不完全依赖于色域。随后的观察表明，任何色影域结合伙伴（即KAP-1、CAF150、SP100）在稳定H3-MeK9–HP1相互作用中都可能发挥作用。在体外溶液结合试验中，添加重组KAP-1不会刺激或增强HP1与甲基化H3尾部的结合（D.C.Schultz，unpubl.）。关于HP1–H3-MeK9相互作用，一个有待回答的重要问题是，单个HP1分子的色域是否与单个核小体或两个相邻核小体的甲基化H3-K9尾部结合。由于KAP-1以同三聚体的形式存在于溶液中，因此KAP-1可能通过作为核小体交联剂的作用，增加靶位点HP1-H3-MeK9相互作用的化学计量比。

H3-K4和H3-K9甲基化之间可能的相互作用

一项更全面的H3-K9甲基化分析葡萄裂殖酵母高等真核生物发现这种染色质标记优先与转录不活跃的染色质相关。相反，组蛋白H3-Lys4甲基化已被证明与组蛋白H3乙酰化和允许基因转录的染色质区域相关。此外，这些数据表明H3-K4和H3-K9甲基化在这两个特定位点上是相互排斥的(Heard等人，2001年;Litt等人，2001年;Noma等人，2001年;Boggs等人，2002年). 此外，H3-K4甲基化只与转录活性的大细胞核有关，而与非活性的微核无关四膜虫(Strahl等人，1999年). 有趣的是，我们发现在H3-K4甲基化的底物对SETDB1甲基化H3-K9的能力几乎没有影响。这一观察似乎与这两种修改的互斥假设背道而驰。此外，这一观察结果与SUV39H1的发现形成鲜明对比，SUV39H2的H3-K9酶活性因甲基化H3-K4底物而显著降低(Nishioka等人，2002年). 这种差异的一种解释可能是组蛋白密码假说。在这种特殊情况下，同一组蛋白上的组蛋白修饰模式似乎独立地调节着修饰同一残基的两种不同酶的酶活性。在这方面，SETDB1可能有助于维持H3-K9在边界元素的甲基化，从而防止转录活性染色质域从富含H3-K4甲基化的并列区域扩散。或者，H3-K9的SETDB1甲基化可能与H3-K4协同作用，抑制高度专业化染色质区域或结构中的转录。与此假设一致，H3-K4甲基化由酿酒酵母蛋白Set1是主要的H3-K4甲基转移酶，是抑制rDNA、端粒和沉默配对型位点内RNA聚合酶II转录所必需的(Nislow等人，1997年;Briggs等人，2001年;Miller等人，2001年;Roguev等人，2001年). 为了更准确地定义SETDB1在含有H3-K4和H3-K9甲基化的染色质结构调控中的作用，需要对我们的转基因工程中的H3-K3甲基化状态进行表征，并进一步鉴定受SETDB1调控的内源性位点。

组蛋白甲基化和DNA甲基化

有趣的是，SETDB1是SET蛋白亚类的一个独特成员，该亚类具有典型的CpG DNA甲基结合结构域（MBD），其他蛋白质使用该结构域结合甲基化DNA(韦德和沃尔夫2001). 一个模型预测SETDB1直接与甲基化DNA的低乙酰化区域（印迹中心、非活性X染色体、转座子等）结合，随后将周围核小体的相应组蛋白甲基化。或者，根据最近的一项基因研究，SETDB1的H3-K9甲基化可能在DNA甲基化的基因特异性靶向中发挥作用粗糙脉孢菌将基因组DNA甲基化的维持与组蛋白H3-K9甲基化联系起来(Tamaru和Selker 2001). 初步结果表明，DNA甲基化修饰剂可以改变整合转基因的沉默状态（K.Ayyanathan和F.J.Rauscher III，unpubl.）。因此，KRAB–KAP-1阻遏系统可能提供了一种有用的工具，用于剖析组蛋白甲基化和DNA甲基化在建立基因沉默的表观遗传状态中的相互作用。

KRAB-ZFPs在建立兼性异染色质中的作用

这些观察强烈表明KRAB-ZFP转录阻遏物超家族在序列特异性建立基因沉默中的作用。KAP-1似乎有能力协调诱导和维持高阶染色质结构组装所需的生化活动。我们建议KRAB-ZFPs选择性地结合同源物顺式-调节元件，并将KAP-1辅压因子募集到靶基因座。由于KAP-1对KRAB介导的阻遏是必需的，因此沉默的效应分子很可能来自与KAP-1相互作用的蛋白质网络。通过我们的研究，我们将KAP-1定义为一种分子支架，它至少协调基因特异性沉默所需的四种活动：（1）靶向特定启动子（通过人类基因组中>220个KRAB锌指蛋白）；（2） 组蛋白通过NuRD/HDAC复合物去乙酰化；（3） 通过SETDB1实现H3-K9甲基化；（4）HP1蛋白的沉积，共同促进兼性异染色质的成核以沉默基因表达。迄今为止，Rb是唯一一种似乎在抑制E2F靶基因中协调类似活动的辅抑制蛋白(尼尔森等人，2001年). 因此，KRAB–KAP-1阻遏系统是通过靶向HP1蛋白来沉默常染色体基因的最具特征的哺乳动物系统之一。此外，人类蛋白质组中KRAB结构域锌指蛋白的丰富性及其识别的DNA序列的潜在多样性，可能使该基因特异性沉默家族成为在细胞分化和生物体发育过程中建立基因沉默表观遗传程序的主控调节器。

材料和方法

质粒

全长人类SETDB1（KIAA0067）来自哈萨克斯坦DNA研究所。SETDB1的编码序列被亚克隆不是我/巴姆HI导入pCMV2（Sigma）以创建CMV-driven Flag-tagged SETDB1哺乳动物表达载体。ΔKID（氨基酸570–1291）表达结构是通过亚克隆Hin公司dIII型/巴姆HI片段进入pCMV2。ΔSET（氨基酸1–951）表达结构是通过亚克隆a不是我/Bgl公司II片段化为pCMV2。SETDB1（R643V、CC 729、731 LP、H1224K、C1226A、C1279Y）中的氨基酸替换是使用快速改变PCR突变策略（Stratagene）创建的。对于蛋白质表达大肠杆菌，2.2 kb巴姆将编码人类SETDB1氨基酸661–1291的HI片段亚克隆到pGEX-5X-1中。类似地，2.6-kbXho公司我/萨尔编码585–1291氨基酸的I片段亚克隆到pGEX-5X-1中。对于抗原生产，1.4-kbXho公司将编码pACT-KIP41中氨基酸1-377的I片段亚克隆到pGEX-4T-1中。先前描述的KAP-1中的PHD指和溴结构域突变被亚克隆到Sma公司pBTM116的I位点(Capili等人，2001年;Schultz等人，2001年). 先前描述了GST–组蛋白H3和GST–G9a细菌表达质粒(Tachibana等人，2001年). 如前所述进行细菌蛋白表达和体外GST结合测定(Ryan等人，1999年;Lechner等人，2000年). 通过对两条链的DNA序列分析，证实了PCR构建的所有结构体的正确阅读框融合和侧翼序列的完整性。

杆状病毒SETDB1

SETDB1的全长编码序列通过生态里/巴姆HI进入pAcHLTa（Pharmingen）以创建串联6His/Flag标记的SETDB1杆状病毒转移载体。重组杆状病毒感染的Sf9细胞（模拟或SETDB1）在感染后48小时通过在RIPA缓冲液（pH 7.9下50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5%脱氧胆酸，0.1%SDS，1 mM PMSF，10μg/mL胃蛋白酶抑制素，10μg/mL抑肽酶，10μg/kL亮氨酸肽，1 mM-苯甲脒，50 mM-NaF，10 mM-NaOV）中裂解获得4). 全细胞提取物的澄清度为100000克，上清液与镍分批培养2+-NTA琼脂糖（QIAGEN），用20柱体积的RIPA缓冲液洗涤，然后用10柱体积的BC100（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，0.2 mM EDTA，10%甘油，0.2 mM-PMSF，0.2%吐温20）洗涤。结合蛋白用添加300 mM咪唑的BC100逐步稀释。镍2+-NTA洗脱液立即与反Flag M2-结合琼脂糖（Sigma）在4°C下孵育2 h，用20柱体积的BC1000（1 M NaCl）洗涤，然后用10柱体积的BC 100洗涤。结合蛋白在4°C下用2柱体积的BC100和400μg/mL Flag M2肽分批洗脱两次，每次洗脱1小时。

酵母双杂交系统

斯坦·霍伦伯格改良的酵母双杂交系统用于所有酵母实验。如前所述，筛选人类寡核苷酸（dT）引物的B细胞cDNA文库(Jensen等人，1998年).

免疫沉淀

如前所述，用脂质体瞬时转染HEK293细胞，并在转染后36–48小时制备核提取物(Ryan等人，1999年). 然后，将5-10 mg调整为100 mM NaCl的核提取物与100μg抗Flag M2（Sigma）在4°C下孵育2-4 h。用BC500（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NaCl，0.2 mM EDTA，10%甘油，0.2 mM-PMSF，0.2%吐温20）洗涤免疫复合物三次，用BC100（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，0.2 mM EDTA，10%甘油，0.2 mM-PMSF，0.2%吐温20）洗脱一次，用400μg/mL Flag M2肽洗脱。在MOPS运行缓冲液（Invitrogen）中的4%–12%NuPAGE凝胶上解析洗脱的蛋白质。如前所述，通过银染色或PVDF蛋白印迹观察蛋白质(Ryan等人，1999年). 对于内源性SETDB1免疫沉淀研究，将100μg与DEAE结合的0.1 M磷酸纤维素洗脱的HeLa核提取物与5μg亲和纯化的SETDB1抗体和5μL蛋白g-Sepharose（Pharmacia）在4°C下孵育2小时。在检测HMTase活性之前，用BC100清洗结合免疫复合物三次，用HMTase缓冲液清洗两次。在Wistar研究所蛋白质微化学设施中，在Finnigan LCQ四极离子阱质谱仪上使用微毛细管反相高效液相色谱-纳米喷雾串联质谱法对MS/MS肽进行鉴定。

体外组蛋白甲基转移酶反应

在40μL反应体积中，酶、5μg核心组蛋白（罗氏生化）、2μg鸡红细胞单核小体或5μg GST–H3N和500 nCiS公司-腺苷-[三H-甲基]-L-蛋氨酸(三H-AdoMet公司；72 Ci/mmole；NEN生命科学产品）在37°C下在50 mM Tris（pH 8.5）、20 mM KCl和10 mM MgCl中培养1小时2、10 mMβ-巯基乙醇和250 mM蔗糖。通过添加5×SDS-缓冲液终止反应。组蛋白在MES运行缓冲液中的4%-12%NuPage凝胶上解析，并通过考马斯蓝R250染色进行可视化。[三H] 在22%PPO溶液中通过荧光法检测甲基标记。将干燥凝胶暴露于柯达MRX胶片。如前所述进行Western Blotting(Ryan等人，1999年).

免疫荧光

NIH3T3细胞在含有10%小牛血清的DMEM培养基中的玻璃盖玻片上生长，并如前所述进行免疫染色(Maul等人，1998年). 用抗原纯化的兔多克隆抗体稀释1:400，通过间接免疫荧光观察小鼠SETDB1蛋白。DNA用Hoechst 33258（Sigma）复染，盖玻片用Fluoromount G（Fisher Scientific）固定。用倒置光显微镜（徕卡）观察细胞。

染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（ChIP）实验基本上如前所述，但有一些修改(Orlando等人，1997年). 用1%甲醛在37°C下交联细胞20分钟。用冷TBS（50 mM Tris，pH 8.0，200 mM NaCl）洗涤细胞数次，使交联反应猝灭。将细胞刮入添加5 mM丁酸的冷TBS中。通过在20 mM Tris HCl（pH 8.0）、0.25%Triton X-100、200 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5 mM EGTA、1μg/mL抑肽酶、亮氨酸蛋白酶、胃蛋白酶抑制素、1 mM苯甲脒、50 mM NaF、10 mM-NaOV中洗涤细胞一次来富集染色质三和5 mM丁酸。离心细胞，将其重新悬浮在IP缓冲液中（20 mM NaCl、0.05%DOC、0.5%Triton X-100、0.5%NP-40、200 mM NaC1、5 mM丁酸盐和蛋白酶抑制剂），并超声处理至平均片段大小300–500 bp。溶解的染色质在12000℃离心澄清克将上清液与被鲑鱼精子DNA和BSA封闭的蛋白A琼脂糖珠预孵育2 h。将预清除的染色质与5-10μg抗KAP-1孵育(Schultz等人，2001年)在4°C下，抗SETDB1、抗H3 MeK9（Upstate Biotechnology）和抗HP1α（D.C.Schultz，unpubl.）12–16小时。免疫复合物在4°C下与蛋白A琼脂糖珠结合2–3小时。用IP缓冲液洗涤珠四次，用高盐缓冲液洗涤两次（用0.4 M NaCl的IP缓冲液），一次使用LiCl缓冲液（pH 8.0下的10 mM Tris、250 mM LiCl、0.5%NP40、1%Triton X-100、0.1%DOC、5 mM EDTA和蛋白酶抑制剂），两次使用TE。在室温下用50 mM Tris（pH 8.0）、200 mM NaCl、5 mM EDTA和1%SDS从蛋白A珠中洗脱DNA-蛋白质复合物1小时。将上清液转移到新鲜试管中，并在65°C下逆转交联6–12小时。样品在55°C下用30μg蛋白酶K（罗氏生化）处理2小时，用苯酚提取一次，用2.5体积的乙醇加20μg糖原作为载体沉淀DNA。将沉淀的DNA造粒，用70%乙醇洗涤一次，干燥，并在25μL水中重新悬浮。用特异性引物对整合质粒的启动子序列进行PCR分析。

致谢

我们感谢Brian D.Strahl和C.David Allis提供的抗H3 MeK9 IgG、鸡单核小体和组蛋白H3 MeK4、MeK9肽。我们感谢Yoichi Shinkai提供GST–H3N和突变质粒。我们感谢David Speicher和Wistar研究所癌症中心核心蛋白微化学设施进行MS/MS分析。我们感谢William Wunner和威斯塔研究所癌症中心核心蛋白表达设施生产杆状病毒表达的SETDB1。D.C.S.得到了DAMD 17-98-1-8269和Wistar研究所癌症培训拨款CA 09171的支持。通用由AI41136支持。F.J.R.得到了美国国立卫生研究院拨款CA 92088、核心拨款CA 10815、GM 54220、DAMD 17-96-1-6141、ACS NP-954、欧文·A·汉森纪念基金会和苏珊·G·科门乳腺癌基金会的部分支持。这项工作的早期部分得到了生物医学科学佩尤学者计划（F.J.R.）的支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ude.urwc.op@71scd; 传真：（216）368-3395。

电子邮件在rehcsuaR条件下; 传真：（215）898-3929。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.973302。

工具书类

  • Ayyanathan K、Fredericks WJ、Berking C、Herlyn M、Balakrishnan C、Gunther E、Rauscher FJ、III通过直接针对PAX3-FKHR癌基因的可诱导转录阻遏物在体内进行激素依赖性肿瘤消退。癌症研究。2000;60:5803–5814.[公共医学][谷歌学者]
  • Bannister AJ、Zegerman P、Partridge JF、Miska EA、Thomas JO、Allshire RC、Kouzarides T.通过HP1色结构域选择性识别组蛋白H3上的甲基化赖氨酸9。自然。2001;410:120–124.[公共医学][谷歌学者]
  • Berger SL.利基的尴尬：组蛋白在转录调控中的许多共价修饰。致癌物。2001;20:3007–3013.[公共医学][谷歌学者]
  • Bochar DA、Savard J、Wang W、Lafleur DW、Moore P、Cote J、Shiekhattar R.与Williams综合征转录因子相关的染色质重塑因子家族。国家科学院院刊。2000;97:1038–1043. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Boggs BA、Cheung P、Heard E、Spector DL、Chinault AC、Allis CD。组蛋白H3的不同甲基化形式显示出与非活性人类X染色体的独特关联模式。自然遗传学。2002;30:73–76.[公共医学][谷歌学者]
  • Briggs SD、Bryk M、Strahl BD、Cheung WL、Davie JK、Dent SY、Winston F、Allis CD。组蛋白H3赖氨酸4甲基化由Set1介导，是细胞生长和rDNA沉默所必需的酿酒酵母。 基因与发育。2001;15:3286–3295. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Capili AD、Schultz DC、Rauscher FJ、III、Borden KL。KAP-1共抑制剂PHD结构域的溶液结构：PHD、RING和LIM锌结合结构域的结构决定因素。EMBO J。2001;20:165–177. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen D，Ma H，Hong H，Koh SS，Huang SM，Schurter BT，Aswad BW，Stallcup MR.通过蛋白甲基转移酶调节转录。科学。1999;284:2174–2177.[公共医学][谷歌学者]
  • Cheung P，Allis CD，Sassone-Corsi P.通过组蛋白修饰向染色质发送信号。单元格。2000;103:263–271.[公共医学][谷歌学者]
  • Friedman JR、Fredericks WJ、Jensen DE、Speicher DW、Huang XP、Neilson EG、Rauscher FJ、III KAP-1，高度保守的KRAB阻遏结构域的新型共抑制剂。基因与发育。1996;10:2067–2078.[公共医学][谷歌学者]
  • Harte PJ，Wu W，Carrasquillo MM，Matera AG.通过原位杂交和辐射杂交将一个新的分叉SET结构域基因SETDB1分配给人类染色体带1q21。细胞遗传学细胞遗传学。1999;84:83–86.[公共医学][谷歌学者]
  • Heard E、Rougeulle C、Arnaud D、Avner P、Allis CD、Spector DL。组蛋白H3在Lys-9的甲基化是X染色体失活期间的早期标记。单元格。2001;107:727–738.[公共医学][谷歌学者]
  • Jacobs SA，Khorasanizadeh S.与赖氨酸9-甲基化组蛋白H3尾部结合的HP1色域结构。科学。2002;295:2080–2083.[公共医学][谷歌学者]
  • Jacobs SA、Taverna SD、Zhang Y、Briggs SD、Li J、Eissenberg JC、Allis CD、Khorasanizadeh S.组蛋白H3甲基化N-末端HP1色结构域的特异性。EMBO J。2001;20:5232–5241. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jensen DE、Proctor M、Marquis ST、Gardner HP、Ha SI、Chodosh LA、Ishov AM、Tommerup N、Vissing H、Sekido Y等。BAP1：一种新型泛素水解酶，与BRCA1环指结合，增强BRCA1介导的细胞生长抑制。致癌物。1998年；16:1097–1112.[公共医学][谷歌学者]
  • Jenuwein T，Allis CD。翻译组蛋白代码。科学。2001;293:1074–1080.[公共医学][谷歌学者]
  • Katsani KR、Arredondo JJ、Kal AJ、Verrijzer CP。三胸SET结构域中的同源突变阻碍组蛋白结合。基因与发育。2001;15：2197–2202。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lachner M、O’Carroll D、Rea S、Mechtler K、Jenuwein T。组蛋白H3赖氨酸9的甲基化为HP1蛋白创建了一个结合位点。自然。2001;410:116–120.[公共医学][谷歌学者]
  • Lechner MS，Begg GE，Speicher DW，Rauscher FJ.，III靶向异染色质蛋白1介导的基因沉默的分子决定簇：直接色影结构域-KAP-1辅抑制子相互作用至关重要。分子细胞生物学。2000;20:6449–6465. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Litt MD、Simpson M、Gaszner M、Allis CD、Felsenfeld G。组蛋白赖氨酸甲基化与鸡β-珠蛋白基因座发育变化之间的相关性。科学。2001;293:2453–2455.[公共医学][谷歌学者]
  • Mark C，Abrink M，Hellman L.啮齿动物和人类中KRAB锌指蛋白的比较分析：KRAB基因几个进化上不同亚家族的证据。DNA细胞生物学。1999;18:381–396.[公共医学][谷歌学者]
  • Maul GG，Jensen DE，Ishov AM，Herlyn M，Rauscher FJ.，III病毒感染期间BRCA1的核再分配。细胞生长差异。1998年；9:743–755.[公共医学][谷歌学者]
  • Miller T、Krogan NJ、Dover J、Erdjument-Bromage H、Tempst P、Johnston M、Greenblatt JF、Shilatifard A.COMPASS：一种与三激素相关SET域蛋白相关的蛋白质复合体。国家科学院院刊。2001;98:12902–12907. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nakayama J，Rice JC，Strahl BD，Allis CD，Grewal SI。组蛋白H3赖氨酸9甲基化在异染色质组装的表观遗传控制中的作用。科学。2001;292:110–113.[公共医学][谷歌学者]
  • Nielsen SJ、Schneider R、Bauer UM、Bannister AJ、Morrison A、O'Carroll D、Firestein R、Cleary M、Jenuwein T、Herrera RE等。Rb靶向组蛋白H3甲基化和HP1启动子。自然。2001;412:561–565.[公共医学][谷歌学者]
  • Nishioka K，Chuikov S，Sarma K，Erdjument-Bromage H，Allis CD，Tempst P，Reinberg D.Set9，一种新型组蛋白H3甲基转移酶，通过阻止异染色质形成所需的组蛋白尾部修饰来促进转录。基因与发育。2002;16:479–489. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nislow C、Ray E、Pillus L.SET1是三胸类家族的酵母成员，在转录沉默和多种细胞过程中发挥作用。分子生物学细胞。1997;8:2421–2436. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Noma K，Allis CD，Grewal SI。异染色质域边界不同组蛋白H3甲基化模式的转变。科学。2001;293:1150–1155.[公共医学][谷歌学者]
  • Orlando V，Strutt H，Paro R.体内甲醛交联染色质结构分析。方法。1997;11:205–214.[公共医学][谷歌学者]
  • Peng H，Begg GE，Harper SL，Friedman JR，Speicher DW，Rauscher FJ.，III Kruppel-associated box（KRAB）转录抑制域的生化分析。生物化学杂志。2000年a；275:18000–18010.[公共医学][谷歌学者]
  • Peng H，Begg GE，Schultz DC，Friedman JR，Jensen DE，Speicher DW，Rauscher FJ.，III KRAB-KAP-1阻遏物复合物的重组：一个用于定义环-B盒-线圈域介导的蛋白质-蛋白质相互作用的分子解剖的模型系统。分子生物学杂志。2000年b；295:1139–1162.[公共医学][谷歌学者]
  • Peters AH、O’Carroll D、Scherthan H、Mechtler K、Sauer S、Schofer C、Weipoltshammer K、Pagani M、Lachner M、Kohlmaier A等。suv39h组蛋白甲基转移酶的缺失会损害哺乳动物的异染色质和基因组稳定性。单元格。2001;107:323–337.[公共医学][谷歌学者]
  • Rea S、Eisenhaber F、O'Carroll D、Strahl BD、Sun ZW、Schmid M、Opravel S、Mechtler K、Ponting CP、Allis CD等。通过位点特异性组蛋白H3甲基转移酶调节染色质结构。自然。2000;406:593–599.[公共医学][谷歌学者]
  • Roguev A、Schaft D、Shevchenko A、Pijnappel WW、Wilm M、Aasland R、Stewart AF酿酒酵母Set1复合物包括一个Ash2同源物，并使组蛋白3赖氨酸4甲基化。EMBO J。2001;20:7137–7148. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ryan RF、Schultz DC、Ayyanathan K、Singh PB、Friedman JR、Fredericks WJ、Rauscher FJ、III KAP-1共表达蛋白与异染色质和常染色质HP1蛋白相互作用和共定位：Kruppel相关的盒锌指蛋白在异染色素介导的基因沉默中的潜在作用。分子细胞生物学。1999;19:4366–4378. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schultz DC，Friedman JR，Rauscher FJ.，III通过KRAB-锌指蛋白靶向组蛋白脱乙酰酶复合物：KAP-1的PHD和溴代腺苷形成一个合作单位，招募NuRD的Mi-2α亚基的新亚型。基因与发育。2001;15：428–443。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Strahl BD，Allis CD。共价组蛋白修饰的语言。自然。2000;403:41–45.[公共医学][谷歌学者]
  • Strahl BD，Ohba R，Cook RG，Allis CD。组蛋白H3在赖氨酸4处的甲基化高度保守，并与转录活性核相关四膜虫。 国家科学院院刊。1999;96:14967–14972. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tachibana M、Sugimoto K、Fukushima T、Shinkai Y.Set结构域蛋白G9a是一种新型的赖氨酸偏好性哺乳动物组蛋白甲基转移酶，对组蛋白H3的赖氨酸类9和27具有高度活性和特异选择性。生物化学杂志。2001;276:25309–25317.[公共医学][谷歌学者]
  • Tamaru H，Selker欧盟。组蛋白H3甲基转移酶控制DNA甲基化粗糙脉孢菌。 自然。2001;414:277–283.[公共医学][谷歌学者]
  • 宾夕法尼亚州沃夫夫市韦德。重接甲基化DNA。自然结构生物。2001;8:575–577.[公共医学][谷歌学者]
文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社