心肌肌浆网一氧化氮合酶

摘要

已在心肌和骨骼肌中鉴定出一氧化氮合酶（NOS）亚型[神经元型NOS（nNOS）、诱导型NOS(1–7). 不^⋅是NOS的产物，已成为钙稳态的重要生理调节器(8)和心肌收缩功能(5)通过与心肌细胞中两个L型钙通道的相互作用(8)和ryanodine受体（RyR）(9). 心肌细胞中的肌浆网（SR）在胞浆收缩蛋白附近隔离并释放分级水平的钙离子，以调节心脏的收缩和舒张。尽管最近有报道称eNOS与心肌RyR-Ca发生铜净化²⁺释放通道(10)，对细胞内NOS来源或NO知之甚少^⋅心肌细胞中的靶点及其在心脏功能中的作用。在这里，我们报告心肌SR清楚地表达内源性NOS活性，内源性NO^⋅可以通过抑制钙来改变SR钙吸收²⁺-ATP酶。此外，我们的数据表明，心肌细胞SR上存在的主要亚型是nNOS亚型。

方法

结果

所有NOS亚型都催化氨基氮的5电子氧化我-生成精氨酸我-瓜氨酸和NO^⋅在对分离的兔心脏SR囊泡进行生化分析期间，我们观察到内源性NOS活性，通过转换我-[^三H] 精氨酸（100 nM）至我-[^三H] 存在辅因子的瓜氨酸[Ca²⁺（0.2微米）、钙（0.1微米）、NADPH（1微米）、FAD（2微米）、FMN（2μM）和BH₄（3μM）]（图。​（图11一，车道A）。仅含底物而不含囊泡的对照组中不存在NOS活性（图。​（图11一或在添加底物之前首先煮沸囊泡（图。​（图11一，泳道C）。当添加EGTA（2 mM）时，心脏SR NOS活性被取消（图。​（图11一，通道E），并且在缺乏钙的情况下未观察到NOS活性²⁺（图。​（图11一，通道D），证明心脏SR NOS活性是Ca²⁺依赖。据报道，7-NI和1-（2-三氟甲基苯基）咪唑（TRIM）是nNOS的强选择性抑制剂(18,19)，带IC₅₀大鼠nNOS的7-NI为0.71μM，小鼠nNOS为28.2μM(20). TRIM是带有IC的牛主动脉内皮NOS的不良抑制剂₅₀1057.5μM(20). 在我们的实验条件下，心脏SR NOS活性的完全失活需要10μM 7-NI（图。​（图11一，通道F）或60μM TRIM（图。​（图11一，车道G）。这些结果表明心脏SR NOS是一种nNOS型NOS，而不是eNOS。有效的iNOS抑制剂，2-氨基-5,6-二氢-6-甲基-4H（H）-1,3-噻吩嗪（AMT，10 nM）完全抑制iNOS（图。​（图11一，通道I），但在相同浓度下仅观察到15%的心脏SR NOS抑制（图。​（图11一，通道H），表明心脏SR NOS不是iNOS。

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图1

(一)在分离的心脏SR囊泡中发现NO合成酶活性。通道A：在存在NOS底物和辅因子的情况下进行控制：Ca²⁺、CaM、NADPH、FMN、FAD、[^三H] 精氨酸和BH₄; B道：在无囊泡的NOS底物存在下；通道C：煮沸囊泡+NOS底物和辅因子；D车道：没有Ca²⁺; 车道E：带有EGTA和NOS底物和辅因子；F道：带10μM 7-NI；车道G：具有60μM TRIM；H车道：10 nM AMT；以及车道I：在10 nM AMT存在下的iNOS。这些结果表明SR NOS活性是Ca²⁺依赖性并且对nNOS选择性抑制剂敏感，表明心脏SR囊泡中NOS的存在以及神经元型NOS酶活性的特异性。数据代表六个独立实验的平均值。(b条)心脏SR NOS的Western blot分析。通过7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离心脏SR囊泡，并转移到硝酸纤维素。用亲和生物试剂培养抗nNOS抗体(文学士)，带有抗nNOSα抗体(bB（英国）)和抗nNOSμ抗体(bC公司). 第1列：大鼠脑匀浆；2：小鼠心脏匀浆；3：小鼠心脏SR囊泡；4:nNOS基因敲除小鼠心脏SR小泡；5：兔心脏SR囊泡。所有样品均为每条泳道30μg（总蛋白）。用抗nNOS和抗αnNOS抗体检测兔和小鼠心脏SR NOS。结果还表明，大鼠大脑NOS和心脏SR NOS的变性分子量分别约为155和160kDa。

据报道，骨骼肌和心肌都表达nNOSμ亚型(4). 为了评估心脏SR NOS是否为nNOSμ蛋白，使用抗nNOSγ抗体进行了Western blot实验。在整个心脏匀浆中检测到nNOSμ。在分离的兔和小鼠心脏SR囊泡中，也可以通过抗nNOS和抗nNOS-α抗体检测到心脏SR NOS，但在nNOS敲除的小鼠心脏SR-囊泡中没有检测到（图。​（图11b条). 相反，当相同的囊泡与抗nNOSμ抗体孵育时，没有检测到，这表明心脏SR NOS不是nNOSγ亚型。结果还表明，心脏SR NOS大于大脑NOS（160 vs.155 kDa）。综上所述，这些结果表明可能存在与心脏SR膜相关的潜在nNOS亚型。

接下来我们检查了是否为NO^⋅由心脏SR小泡通过NO产生^⋅-比自旋阱Fe²⁺络合物，Fe（MGD）₂(21). EPR光谱是一种能够直接测量具有不成对电子自旋的分子（如NO）的技术^⋅EPR自旋追踪测量证实NO^⋅在存在NOS底物和辅因子的情况下，从分离的SR囊泡内源性生成（图。​（图22D类，三重态光谱）。内源性NO^⋅nNOS选择性抑制剂7-NI（图。​（图22E类)无法由支持d日-精氨酸（图。​（图22F类). 结果进一步证实了心脏SR囊泡中的功能性NOS。确保内源性NO的特异性^⋅代，除图1外，所有反应样品中都存在SOD。​图22 A类和B类，以防止BH产生超氧物₄自动氧化(22)或任何其他来源。不^⋅SOD（300单位/ml）、Ca混合物中未检测到自由基²⁺（0.2毫微米），我-精氨酸（2mM）、NADPH（1mM）、FAD（1μM）、FMN（1μM）、CaM（0.1μM）和BH₄（3μM），如图所示。​图22C类此外，Fe（MGD）₂仅自旋捕捉试剂（图。​（图22A类)也不能使用SOD（图。​（图22B类)显示任何可检测到的NO^⋅径向信号。

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图2

NO的EPR谱^⋅铁（MGD）存在下心脏SR小泡的形成₂在室温下，在各种条件下复合60min。铁（MGD）₂仅限(A类); + SOD处于状态A类(B类); + NOS底物和辅因子的混合物B类(C类); + 条件下的心脏囊泡C类(D类); + 7-NI状态D类(E类); 和+d日-囊泡和辅因子存在下的精氨酸(F类)（请参见方法反应组分的最终浓度）。这些结果表明7-NI敏感的内源性NO^⋅（三重态光谱）由分离的心脏SR小泡产生。数据来自每种情况下四个类似独立实验中的一个。

接下来在人心室心肌切片上进行心脏SR NOS的免疫荧光定位，以确定其亚细胞定位与骨骼肌限制性肌膜定位模式的比较(1–4,7). 通过使用nNOS特异的单克隆抗体（Transduction Laboratories），结果显示心肌中存在纵向和横向线性细胞内模式的组合（图。​（图3三美国汽车协会)与已经描述的定位于纵向和连接SR的抗原一致(23,24). 为了进行比较，我们用特异于心脏Ca的单克隆抗体对切片进行染色²⁺-ATP酶（SERCA2）和RyR，这两种酶以前都被证明定位于纵向和连接SR(25,26). SR抗原RyR（图。​（图3三交流电)和SERCA2（图。​（图3三aD公司)，具有与nNOS相似的免疫荧光模式（图。​（图3三美国汽车协会). 相反，Na⁺，K⁺-ATP酶是一种专门的肌膜抗原，具有完全不同的免疫荧光染色模式（图。​（图3三aB类). 用mAb对无关病毒蛋白染色的对照组仅显示微弱的背景荧光（图。​（图3三美国电气公司).

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图3

(一)激光扫描共聚焦显微镜在人心室肌冷冻切片上用单克隆抗体进行心肌细胞抗原的免疫荧光定位。(美国汽车协会)nNOS间接免疫荧光标记（IIL）显示线性纵向和横向条纹标记模式；纳⁺，K⁺-ATP酶IIL显示了人类心脏切片标记的明显不同的肌膜模式(aB类); RyR IIL公司(交流电)和SERCA2 IIL(aD公司)具有与NOS IIL相似的标记模式，表明NOS的SR定位，而不是心肌中的肌膜定位；一种无关的抗病毒蛋白单克隆抗体(美国电气公司)与其他初级单克隆抗体的浓度相同，背景荧光水平较低。(b条)单一免疫金标记。SR囊泡与特定的一级抗体和与12 nm胶体金结合的二级抗体孵育。在没有初级抗体的情况下控制囊泡(文学士); 带抗eNOS(bB（英国）); 带抗iNOS(bC公司); 和单个囊泡(bD公司)和一组小泡(bE公司)使用反nNOS。电子显微照片显示，只有nNOS广泛分布在心肌SR膜泡表面。双重免疫金标记：Ca²⁺-ATP酶（6纳米金粒子）和nNOS（12纳米）(bF公司); 纳⁺，K⁺-ATP酶（6 nm）和nNOS（12 nm）(bG（英国）); 和磷酸λ（6 nm）和nNOS（12 nm）(bH公司). 每个囊泡代表每种情况下数百个类似的标记或未标记囊泡。结果显示心脏SR-Ca²⁺-ATP酶和磷蛋白与SR神经元型NOS共存。Na缺乏⁺，K⁺-SR囊泡上的ATP酶进一步证明囊泡代表SR而不是肌膜。

为了确认负责心脏SR囊泡内源性NOS活性的NOS亚型的免疫学特性和定位，进行了免疫金标记和电子显微镜检查。抗-nNOS免疫反应广泛分布于分离的心脏SR膜囊泡（图。​（图3三 bD公司和bE公司)进一步证明心脏SR NOS与神经元型NOS在免疫学上密切相关。相反，骨骼肌SR囊泡中未出现标记（数据未显示），表明nNOS定位于SR囊膜可能是心脏SR膜的特异性。在缺乏抗nNOS的情况下，未观察到免疫反应（图。​（图3三文学士)或在存在抗eNOS或抗iNOS的情况下（图。​（图3三 bB（英国）和bC公司). 接下来使用囊泡的双重免疫金标记，将心脏SR NOS与分离囊泡中的特异SR蛋白标记物共定位。与SERCA2和磷蛋白抗原共定位的抗-nNOS免疫反应（心脏SR的蛋白标记，图。​图3三 bF公司和bH公司)，但不是Na⁺，K⁺-ATP酶（图。​（图3三bG（英国）)（肌膜膜蛋白标记物），进一步证明了分离的SR囊泡的纯度和免疫金标记的特异性。

肌肉收缩期间，SR中的钙离子释放到心肌细胞细胞质后，SR Ca²⁺-ATP酶负责钙的主动运输²⁺回到SR，触发放松，为下一次收缩做好准备。确定心脏SR-Ca²⁺-ATP酶是NO的潜在靶点^⋅，我们研究了内源性NO的影响^⋅心脏SR⁴⁵不同条件下的钙吸收。实验结果表明，内源性产生NO^⋅由SR囊泡与NOS底物和辅因子在37°C下孵育30分钟而产生，抑制了对thapsigargin敏感的SR⁴⁵钙吸收60%（图。​（图4，4，通道E），并且在60分钟的培养期间抑制率超过80%（图。​（图4，4，车道F）。抑制⁴⁵在NOS选择性抑制剂7-NI（10μM，图。​图4，4，车道G）。确保内源性NO的特异性^⋅在这些实验中添加了抑制，SOD（300单位/ml），但SR的量⁴⁵钙吸收不受影响（图。​（图4，4，车道C）。什么时候？d日-精氨酸替代我-精氨酸，在⁴⁵钙吸收如图所示。​图4，4，车道H。NO的显著抑制作用^⋅在⁴⁵钙摄取表明心脏SR NOS可以调节SR⁴⁵通过修饰钙吸收钙²⁺-ATP酶活性。

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图4

内源性NO的影响^⋅心脏SR⁴⁵不同条件下的钙吸收。不含NOS底物、辅因子和SOD的囊泡(A类); −SOD+thapsigargin(B类)（Tg，一种钙的特异性抑制剂²⁺-ATP酶）；小泡+SOD(C类); + SOD+Tg(D类); 条件C类在NOS底物和辅因子存在下30分钟(E类)，或持续60分钟(F类)（23°C时为30分钟，37°C时30分钟）；60分钟孵育（与F类)在NOS抑制剂7-NI（10μM）存在下(G公司);d日-精氨酸替代我-条件下的精氨酸F类(H（H）). 数据表示使用0.6 mg/ml心脏SR囊泡的六个独立实验的平均±SD。在所有反应混合物中，SOD的浓度为300单位/ml。⁴⁵钙吸收被内源性NO抑制^⋅结果表明心脏NOS调节SR⁴⁵直接修饰钙的钙吸收²⁺-内源性NO的ATP酶功能^⋅.

讨论

本文报道的研究表明，免疫化学和生物化学表明，神经型NOS与心脏SR膜相关。两者的形成我-瓜氨酸和NO^⋅分离的心脏SR囊泡中的自由基提供了强有力的证据，证明心脏SR小泡中存在功能性NOS。研究表明，nNOS位于兔小脑内质网中(27)但在骨骼肌中，它通过PDZ蛋白靶向序列（nNOSμ）局限于肌膜(1–4,7,28). 我们发现心脏SR NOS略大于大脑NOS（160 vs.155 kDa），这表明心脏SR NO可能是nNOS的新剪接或翻译后修饰变体。虽然心脏SR NOS迁移的分子量与nNOSμ相同，但它可能不是nNOSγ亚型，因为它没有被特定的nNOSβ抗体检测到。我们的研究结果表明，这是一种nNOS亚型，因为心脏SR nNOS容易被选择性nNOS抗体检测到，而nNOS阴性小鼠完全没有这种检测。我们的结果显示，通过免疫荧光，抗nNOS免疫反应在人类心脏切片中的模式与SR定位一致，而不是局限于心脏肌膜。免疫金共定位研究证实了nNOS在心脏SR囊泡上的免疫反应性，但在骨骼肌SR囊泡上没有，这表明心脏nNOS亚型可能与先前描述的骨骼肌nNOS亚型不同(1–4).

Zahradnikova最近报道过等。(10)eNOS与心脏SR膜相关。然而，我们无法通过免疫金标记在我们分离的心脏SR囊泡中检测到eNOS（图。​（图3）三)或Western blotting（未显示数据）。我们进一步测试了小窝膜是否与SR小泡相关，因为eNOS是针对小窝的(29–31). Western blot分析显示，在野生型小鼠或兔全心脏匀浆中发现小窝膜蛋白，即小窝蛋白3，在平滑肌、骨骼肌和心肌中表达，但在我们分离的兔和小鼠心脏SR囊泡或nNOS敲除心肌SR囊中未检测到（数据未显示）。心脏SR囊泡上eNOS存在的明显差异可能是由于Zahradnikova研究中使用的SR囊中存在小窝膜或肌膜所致等。(10). nNOS样NOS与心脏SR膜相关的机制尚不清楚。NOS与心脏SR的结合是否由静电相互作用介导(32–34)尚待回答。

SR钙²⁺储存是动态细胞溶质钙的中心²⁺在心脏跳动的收缩/放松循环过程中发生的流量。不^⋅被发现是肌肉收缩力的重要调节器(1–8,25,26). 据报道，NO^⋅抑制骨骼肌RyR钙释放通道和用力产生，并减弱心肌细胞收缩(35–37). 我们的结果提供了新的证据证明NO^⋅也可以直接下调SR-Ca²⁺-ATP酶并损害SR钙转运系统（图。​（图4）。4). 不^⋅-对SR-Ca的诱导效应²⁺-ATP酶和RyR钙释放通道功能(37)可能导致SR Ca的显著改变²⁺释放，胞浆钙²⁺注意力集中和心肌收缩。NO的抑制作用^⋅可能会进一步受到细胞内钙增加的影响，如之前在缺血条件下所证明的(38). NO调节作用的详细生化机制^⋅关于SR-Ca²⁺主动运输不明确。然而，否^⋅可以调节SR-Ca²⁺-ATP酶和RyR通过与这些蛋白质的调节硫醇反应(39–41)或通过一条涉及S公司-亚硝基谷胱甘肽(42).

NO调节心脏功能的分子基础^⋅只是部分理解。我们的结果不仅定位了心脏SR上可能存在的神经型NOS的新亚型，而且为NO之间的分子相互作用提供了证据^⋅和心脏SR Ca²⁺-ATP酶可能调节心脏SR-Ca²⁺主动运输。关于NOS亚型如何与心脏SR膜相关以及NO如何^⋅影响SR-Ca²⁺心肌细胞中的转运，应增加我们对NO生物调节作用的了解^⋅细胞内钙²⁺健康和疾病期间的体内平衡和心肌收缩。

致谢

缩写

脚注

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