临床投资杂志。2002年6月15日；109(12): 1607–1615.
终身暴露于可溶性转化生长因子-β拮抗剂可保护小鼠免受转移，无不良副作用
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三和1
于安阳
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
奥克萨娜·杜哈尼娜
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
宾乌汤
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
美津子（Mizuko Mamura）
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
约翰·莱特里奥
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
詹妮弗·麦格雷戈
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理学和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
塞加尔·帕特尔
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
沙赫拉姆·科赞
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
刘子耀
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
杰弗里·格林
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
米里亚姆·R·安弗
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
格伦·梅利诺
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
Lalage M.Wakefield公司
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节与致癌实验室2美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所科学应用国际公司病理和组织技术实验室三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所分子生物学实验室
通信地址：Lalage M.Wakefield，国家癌症研究所细胞调节和致癌实验室，马里兰州贝塞斯达MSC 5055图书馆路41号C629室41号楼，邮编：20892-5055。电话：（301）496-8351；传真：（301）496-8395；电子邮件：vog.hin.icn.14ecd@莱菲考. 2002年2月25日收到；2002年4月9日接受。
摘要
TGF-β在许多生物过程中发挥着多样而复杂的作用。在肿瘤发生中，根据疾病的阶段，它们可以作为肿瘤抑制因子或致癌因子发挥作用。我们已经开发出在乳腺选择性MMTV-LTR启动子/增强子调控下表达可溶性II型TGF-β受体的TGF-α拮抗剂：Fc融合蛋白类的转基因小鼠。在该小鼠系的血清和大多数组织中检测到具有生物学意义的拮抗剂水平。与野生型对照组相比，无论是在使用等基因黑色素瘤细胞的尾静脉转移试验中，还是在与转移性乳腺癌MMTV-neu转基因小鼠模型的杂交中，这些小鼠对多器官部位的转移具有抵抗力。重要的是，内源性乳腺肿瘤的转移受到抑制，而原发性肿瘤的发生没有任何增强。此外，衰老的转基因小鼠没有表现出TGF-β无效小鼠的严重病理特征，尽管终生暴露于拮抗剂。数据表明，在体内，拮抗剂可以选择性中和与转移相关的不良TGF-β，同时保留正常组织中TGF-α的调节作用。因此，这种可溶性TGF-β拮抗剂在预防转移方面具有长期临床应用的潜力。
介绍
TGF-βs是多功能生长因子，可调节发育、功能和增殖体内平衡，并对环境挑战作出反应(1). 许多疾病过程与TGF-β功能异常有关，这一事实强调了这些生长因子在人类中的核心重要性。正常TGF-β功能的丧失与癌症、动脉粥样硬化、自身免疫性和炎症性疾病的发病机制有关，而过度TGF-(2–9).
TGF-βs在肿瘤发生中的作用尤其复杂。临床和小鼠模型数据表明，TGF-β系统可以明确发挥肿瘤抑制通路的作用，许多人类肿瘤中可以看到TGF-？受体或下游信号成分的减少或丢失（有关综述，请参阅参考文献。2–5). 然而，晚期人类肿瘤经常表现出TGF-βs表达的反常增加，这与转移增加和预后不良有关(10). 目前对这些观察结果的合理解释是，当上皮细胞对TGF-β的反应仍然相对正常时，TGF-？s在肿瘤发生早期起到抑癌作用。在这一过程的后期，多途径中的遗传或表观遗传改变损害了肿瘤抑制活性，TGF-β主要作为癌基因发挥作用，促进侵袭性转移性疾病的进展(2).
理想情况下，在临床环境中，人们希望选择性中和参与疾病发病机制的TGF-β，而不影响TGF-在未受影响组织中的正常保护和稳态作用。在动物模型中，各种类型的TGF-β拮抗剂已成功用于改善TGF-α驱动的病变，尤其是纤维化(11–16). 然而，这些研究大多是短期的，或涉及拮抗剂的局部给药。长期全身暴露于高亲和力TGF-β拮抗剂的后果尚未评估，特别是在增加自发肿瘤发生和免疫系统功能障碍的可能性方面，如从TGF-(17–19).
Ⅱ型TGF-β受体细胞外配体结合域与人IgG Fc结构域的融合1提供一种特别高亲和力、稳定的TGF-β拮抗剂，本文称为SR2F(20). 这种可溶性受体的其他细胞因子拮抗剂：Fc融合蛋白类已被证明在临床上有用，最近批准使用TNF-α拮抗剂依那西普治疗类风湿关节炎就是证明(21). 在本研究中，我们建立了一个转基因小鼠模型，该模型在其整个生命周期中广泛表达SR2F TGF-β拮抗剂，并且我们表明，该小鼠能够抵抗实验性转移，没有明显的副作用。数据表明，该拮抗剂可能能够在体内选择性中和与转移相关的不良TGF-β，而不影响参与维持正常体内平衡的TGF-α。
方法
SR2F转基因小鼠的产生。
SR2F TGF-β拮抗剂包含与人IgG的Fc结构域融合的人类II型TGF-？受体的胞外结构域1（图a） ●●●●。从Monica Tsang（R&D Systems Inc.，Minneapolis，Minnesota，USA）获得质粒JP109-6，其含有一种SR2F cDNA形式，在Fc结构域中具有两个小内含子，用于增强体内表达。将SR2F插入子克隆到pSKMMTV-SVPA载体中(22)生成一个转基因，其中SR2F编码序列由MMTV-LTR启动子增强子和SV40 3′UTR和聚腺苷酸化信号介导，切除后用BglII公司和拼写1（图b） ●●●●。将转基因注射到近交FVB/NCr合子的原核中(23). 获得了六位创始人，其中五位表现出种系传播，两位表达了转基因。将高表达系（MMTV-SR2F）培育成纯合性，以进行进一步分析。年龄和性别匹配的野生型FVB/NCr小鼠作为对照。在符合或超过NIH指南的条件下，小鼠被安置在实验室动物护理评估和认证协会认可的设施中。
拮抗剂设计和体外验证。(一)可溶性TGF-β拮抗剂SR2F。这种拮抗剂由人Ⅱ型TGF-β受体的胞外结构域与人IgG的Fc结构域融合而成1能结合TGF-β1和TGF-。(b条)转基因构建。转基因表达是由乳腺选择性MMTV-LTR启动子/增强子驱动的。小内含子存在于SR2F和SV40 3′UTR的Fc结构域中，以增强体内转基因表达。(c（c）)转染SR2F逆转TGF-β1的生长抑制作用。用空载体（pcDNA3）、膜结合显性负II型TGF-β受体（DNR）或SR2F稳定转染MDA MB435细胞，检测其对添加TGF-α1（5 ng/ml）的生长抑制作用的抵抗力。对于每个构建体，细胞增殖标准化为“无TGF-β”状态。结果是三次测定的平均值±SD。(d日)测定中和TGF-β活性所需的纯化SR2F与TGF-α1的摩尔比。测定了增加纯化SR2F的量逆转2 pM TGF-β1对Mv1Lu细胞生长抑制活性的能力。结果为三次测定的平均值±SD。
稳定转染和生长抑制试验。
为了在体外进行高水平表达，将SR2F插入物亚克隆到pcDNA3中（Invitrogen Corp.，Carlsbad，California，USA）。人类乳腺癌细胞株MDA MB435（由美国华盛顿哥伦比亚特区伦巴第研究所Stephen Byers赠送）单独用pcDNA3载体pcDNA3-SR2F或pcDNA3-DNR稳定转染，其中DNR是II型TGF-β受体的膜结合显性阴性形式(24). 对于生长抑制试验，转染细胞在105细胞/孔置于含有10%FBS的DMEM中的24孔板中。24小时后，将细胞切换到含有DMEM、0.1%FBS和10 ng/ml EGF的分析培养基中，并允许在添加5 ng/ml TGF-β1（R&D Systems Inc.）或溶媒对照之前将培养基调节24小时。再过22小时，细胞被三H-胸苷2小时后收获(25). 为了确定中和TGF-β-生长抑制作用所需的SR2F与TGF-？的摩尔比，使用了高度敏感的Mv1Lu细胞系（美国马里兰州罗克维尔美国型培养物收藏中心）。TGF-β1（2 pM）存在于所有微孔中，无论是否含有0–200 pM纯化的SR2F蛋白（R&D Systems Inc.）。
Northern杂交和原位杂交。
根据制造商的说明（美国马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司），使用Trizol试剂从组织中提取RNA。每个泳道加载15微克总RNA，并将印迹与520bp杂交32SR2F的Fc域特有的P标记探针。溴化乙锭染色的核糖体条带被可视化，以获得RNA负载的均匀性。利用引物对5′-CGAAACCCTGAGGTCAAGT-3′（正向）和5′-GAGGCTCTGCGTGTAG-3′（反向）通过PCR扩增产生探针，并克隆到pCR2.1载体（Invitrogen Corp.）中。在含有对甲醛的组织切片上进行原位杂交。使用Genius Kit 4（Boehringer Mannheim Biochemicals Inc.，Indianapolis，Indiana，USA）转录相同的Fc-特异性探针，以产生正反义探针。如前所述，使用地高辛标记探针对载玻片进行杂交(26). 幻灯片被核固红复染。
SR2F ELISA。
建立了一种灵敏、特异的测定SR2F的ELISA方法。组织在提取缓冲液（1%Nonide P40、150 mM NaCl、50 mM Tris-Cl、pH 7.4和20μg/ml 4-（2-氨基乙基）-苯磺酰氟）中均质并澄清。Nunc MaxiSorp微量滴定板（美国纽约州罗切斯特Nalge Nunc International公司）在4°C下涂1μg/孔山羊抗人IgG过夜（美国宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories公司）。在用Tris缓冲盐水（TBS）和酪蛋白（美国马里兰州Owings Mills的BioFX Laboratories Inc.）清洗和封闭后，添加在TBS/酪蛋白中连续稀释的血清或组织样品或纯化的SR2F标准品（1–100 pg/孔；R&D Systems Inc.），在室温下培养1小时。检测抗体为12.4 ng/孔生物素化抗TGF-β受体II型（BAF241；R&D Systems Inc.）。使用1:10000稀释的链霉亲和素结合过氧化物酶（016-030-084；Jackson ImmunoResearch Laboratories）和过氧化物酶底物（TMBW-0100-01；BioFX Laboratory Inc.）显色。
蛋白质印迹和配体亲和交联。
对于Western blots，将野生型或转基因小鼠的乳腺提取物（20μg/lane）置于4–12%非还原性甘氨酸凝胶上，并将其印在硝酸纤维素上。纯化SR2F（2 ng/孔）用作阳性对照。用0.2μg/ml抗人Fc抗体（109-005-098；Jackson ImmunoResearch Laboratories）探测印迹，无论是否有过量的人IgG（5μg/ml），以证明抗体特异性。对于配体亲和交联，使用来自3个月大的原始转基因或野生型小鼠的血清，并将纯化的SR2F（2 ng/0.1 ml）加入野生型血清或PBS中作为阳性对照。125将I–TGF-β1（131μCi/μg）添加到0.4 nM的最终浓度，并将反应混合物在冰上培养1小时。将二琥珀酰亚胺亚油酸盐（美国伊利诺伊州罗克福德皮尔斯化学公司）添加到最终浓度为1 mM的溶液中，并在室温下培养30分钟。在非还原条件下，在6%三甘氨酸凝胶上运行交联样品，并将其暴露于薄膜中。
尾静脉转移试验。
如前所述，从HGF/SF转基因小鼠系MH-37中产生的黑色素瘤衍生出的等基因转移性无色素黑色素瘤细胞系37-32进行培养(27). 通过静脉注射10只转基因和年龄匹配的野生型雄性小鼠（年龄2-4个月）6细胞通过尾静脉注入0.1 ml DMEM。在一个实验中，小鼠在注射后21、28和35天被安乐死（5-10只小鼠/基因型组/时间点）。第二个实验研究转移效率对SR2F水平的依赖性，每个基因型组使用4-5只小鼠，所有小鼠在35天后被安乐死。在尸检时对小鼠进行大体检查，以确定是否存在内部器官的转移。由认证的兽医病理学家（M.R.Anver）对福尔马林固定石蜡包埋组织的代表性横截面进行转移的显微镜定量。对于肝脏，检查每个肝叶的两个部分。
MMTV-neu小鼠的肿瘤发生。
纯合子MMTV-neu小鼠[FVB/N-TgN（MMTV-new）202Mul]从美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室获得，并与FVB/NCr对照小鼠或纯合子MMTV-SR2F小鼠杂交，产生两个实验队列，其中一个是neu（新）单独致癌基因（29只小鼠）或两者兼而有之neu（新）和SR2F（38只小鼠）。雌性小鼠经过一轮妊娠和哺乳期以增加转基因的表达。每两周对小鼠进行一次乳腺肿瘤触诊，当任何原发肿瘤直径达到2 cm或小鼠出现病态时，对其进行安乐死。肿瘤体积按以下公式计算V（V）=LS（负载感应）×0.4，其中L（左）和S公司分别是最长和最短尺寸(28). 收集肿瘤、乳腺和肺进行组织学分析，并收集血清进行循环SR2F水平测定。
非免疫表型分析。
对22只雌性FVB/NCr小鼠和20只雌性进行了完全尸检SR2F型+/+小鼠年龄为16-26个月，FVB/NCr组的平均年龄为20±2个月，SR2F组的平均寿命为21±4个月。对处女小鼠和产下的小鼠进行了分析。尸检时，检查所有小鼠是否存在大体损伤。常规采集33个器官进行组织学观察，以及任何其他有损伤的组织。福尔马林固定石蜡包埋组织的苏木精和伊红染色切片由一名注册兽医（M.R.Anver）进行检查。采集血清和乳腺，用夹心ELISA法测定SR2F水平。
免疫表型。
通过心脏穿刺从转基因和野生型雌性小鼠中采集全血，Ani Lytics Inc.（美国马里兰州盖瑟斯堡）测定了完整的血细胞计数和白细胞差异。为了测定脾细胞计数，将脾脏切除并破裂，用ACK裂解缓冲液（美国马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker公司）裂解红细胞。使用血细胞仪对脾细胞总数进行计数，并使用CellQuest软件（Becton Dickinson and Co.，San Jose，California，USA）对FACSCalibur进行染色和分析。为了直接染色以确定白细胞总分布并量化活化和/或记忆T细胞表型，从BD Pharmingen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买了以下结合抗体：抗CD69 FITC、抗CD25藻红蛋白（PE）、抗CD62L FITC、抗CD44 PE、抗CD4 PerCP、别藻蓝蛋白（APC）、，抗CD8 PerCP、抗CD3 APC、抗B220 APC、抗NK1.1 PE、抗CD11b FITC和抗Ly-6G（Gr-1）PE。染色前，用抗CD16/32抗体（2.4G2；BD Pharmingen）阻断Fc受体。
结果
SR2F拮抗剂的体外验证。
用SR2F稳定转染MDA MB435人乳腺癌细胞株，或用DNR作为阳性对照。TGF-β的生长抑制作用在转染SR2F的细胞中基本消除，在转染DNR的细胞中完全消除（图c） ●●●●。这表明内源性合成的SR2F能够保护细胞免受添加TGF-β的生物效应的影响。与DNR相比，SR2F的效率较低，这可能反映了培养基中分泌的SR2F被广泛稀释。使用纯化的SR2F蛋白，我们确定体外90%的生物活性中和需要SR2F与TGF-β1的50:1摩尔比（图d） ●●●●。如前所述，SR2F只能结合TGF-β1和TGF-。20以及我们的数据，未显示）。
MMTV-SR2F转基因小鼠的特性。
在MMTV-SR2F系纯合转基因雌性大鼠的乳腺和唾液腺中观察到SR2F mRNA的高水平表达，而在肺和淋巴组织中的表达较低（图a） ●●●●。原位杂交显示，乳腺中SR2F mRNA的表达仅限于上皮细胞（图b） ●●●●。转基因乳腺提取物在Western blots上显示出一条预期大小的二聚体SR2F带（图c） ●●●●。通过ELISA，在成年小鼠的乳腺和雄性辅助性器官中发现SR2F蛋白的含量最高（200–1000 ng/g），而在除大脑外的所有其他器官中发现的含量较低但可检测到（30–150 ng/gd和未显示的数据）。肾脏等器官中SR2F的存在可能反映了循环中的隔离，因为血清中也发现了高水平的SR2F蛋白（图d） ●●●●。由于母体转移蛋白的额外存在，幼龄小鼠的血清SR2F水平最高。通过监测半合子转基因母亲的野生型后代中循环SR2F水平随时间的下降，我们可以计算出SR2F蛋白的体内半衰期为12.3±0.5天（图e） ●●●●。然而，值得注意的是，由于内源性合成（未显示），转基因小鼠的循环SR2F水平在动物的整个寿命期间通常保持在≥200 ng/ml。通过配体亲和交联测定体内制备的SR2F与TGF-β结合的能力。125I–TGF-β1在转基因血清和添加纯化SR2F的野生型血清中结合到同一条带（图f） 。相反，TGF-β仅与对应于α的高分子量带结合2-野生型血清中的巨球蛋白。这表明体内制备的SR2F折叠正确，能够以比主要血清结合蛋白α更高的亲和力结合TGF-β2-巨球蛋白，大量存在。
TGF-β拮抗剂在MMTV-SR2F小鼠中的表达和功能。(一)SR2F mRNA在不同组织中的表达。从一只成年处女转基因小鼠中制备RNA并检测SR2F。(b条)SR2F在乳腺中的细胞类型特异性表达。原位杂交显示SR2F mRNA在乳腺导管上皮细胞（EC）中有特异性表达，但在转基因小鼠的乳腺脂肪垫（FP）或血管（BV）中没有特异性表达。(c（c）)转基因乳腺中的SR2F蛋白。用抗人Fc抗体（抗-huFc）检测野生型或转基因（TG）小鼠乳腺提取物的蛋白质印迹，检测是否含有过量的人免疫球蛋白G1（huIgG），以证明特异性。纯化的SR2F为阳性对照。(d日)转基因小鼠血清和组织中SR2F蛋白水平。对2.5个月龄转基因处女小鼠的血清和组织提取物进行SR2F蛋白检测。结果是每种性别三只小鼠的平均值±SD。(e（电子）)SR2F的体内稳定性。半合子转基因母鼠野生型后代出生后不同时间测定血清SR2F水平。血清半衰期（T1/2)根据衰减曲线计算SR2F。(（f）)转基因血清中SR2F结合TGF-β1的能力。用配体亲和交联法检测野生型或转基因小鼠血清中TGF-β结合蛋白125I–转化生长因子-β1。将纯化的SR2F加入生理盐水或野生型血清中作为阳性对照。哺乳动物，乳腺；萨尔。Gl.，唾液腺；网格。LN，肠系膜淋巴结；萨尔。gl，唾液腺；Sm.int.，小肠；精囊；分子量标记；α2M、 α2-巨球蛋白。
MMTV-SR2F小鼠在尾静脉转移模型系统中具有抗转移保护作用。
几项研究表明TGF-βs是促转移剂(29–31). 为了确定SR2F的表达是否可以防止实验性转移，对3至4个月龄的雄性MMTV-SR2F和野生型FVB/NCr对照小鼠的年龄匹配队列进行了尾静脉注射等基因转移性黑色素瘤细胞系37-32的挑战。注射细胞后28天和35天，MMTV-SR2F小鼠大体上可检测到的肝转移数量均出现统计学上的显著减少（图a） ●●●●。组织学分析显示，MMTV-SR2F小鼠在35天时，所有转移部位的每个器官的转移数量减少了两到三倍（图b） ●●●●。肝脏是最有效的定植部位，差异具有统计学意义(P（P）=0.03（学生）t吨独立样本测试）。在一项使用7周龄小鼠的单独实验中，由于母体转移的变化，转基因队列中循环SR2F的水平差异很大，随着循环SR2F水平的增加，肝转移的数量呈剂量依赖性减少（图c） ●●●●。
尾静脉注射试验中SR2F对转移效率的影响。(一)接种后不同时间肉眼可见的肝转移。野生型或转基因（SR2F）小鼠尾静脉注射106等基因37-32黑色素瘤细胞。21、28和35天后，对小鼠进行尸检，并对肝脏表面肉眼可见的转移瘤数量进行量化。在21天的时间点上，每个基因型组有5只小鼠，而其余时间点上每个基因型群有10只小鼠。(b条)对不同内脏器官转移效率的影响。在接种后35天尸检的小鼠中，对所有组织中组织学上明显的转移数量进行了量化，这些组织有明显的转移迹象。对肝脏每个叶的两个代表性横截面进行评估，并对其他器官的一个代表性横断面进行分析。每个基因型组使用10只小鼠。(c（c）)SR2F对转移效率影响的剂量依赖性。在一个重复实验中一用夹心ELISA法测定尸检时制备的血清中循环SR2F水平，定量并绘制肝脏代表性横截面中组织学可检测到的转移瘤数量。野生型队列（0 ng/ml SR2F）的数据表示为平均值±标准偏差(n个= 4).R（右）表示线性曲线拟合的相关系数。
SR2F拮抗剂可防止原发性乳腺肿瘤的转移，而不会影响原发性肿瘤的发展。
为了确定SR2F拮抗剂是否能有效地防止自然部位原发性肿瘤的转移，我们将MMTV-SR2F小鼠或对照FVB/NCr小鼠与MMTV杂交-neu（新）转移性乳腺癌小鼠模型(32). 在这个模型中，乳腺肿瘤的发生是由大鼠乳腺癌基因同源物的过度表达引起的HER2/erbB2/neu原癌基因。由于TGF-β被认为在肿瘤发生的早期阶段起到抑癌作用，我们还希望确定在肿瘤形成的所有阶段长期接触TGF-α拮抗剂后是否有任何不良促瘤作用。每周对小鼠进行肿瘤触诊，并在其出现病状或肿瘤直径达到2厘米时进行尸检。尸检时，双基因的循环SR2F水平(neu（新）/SR2F）小鼠平均为18.0±10.2μg/ml（范围4.3–38.8μg/ml）。这明显高于正常情况下在假释的SR2F小鼠中发现的水平（~1μg/ml），可能反映了肿瘤细胞额外产生SR2F。在研究的58周时间范围内，29只（86.2%）小鼠中有25只neu（新）组和38只（86.8%）小鼠中的33只neu（新）/SR2F组出现明显的乳腺肿瘤。肿瘤潜伏期由首次发现可触及肿瘤的年龄决定，不受SR2F的影响（图a） ●●●●。同样，SR2F对小鼠的肿瘤多样性或总肿瘤负荷没有影响。neu（新）每只小鼠有2.4±1.8个肿瘤，而neu（新）/SR2F小鼠每只小鼠有2.4±1.7个肿瘤。患者的平均总肿瘤负担neu（新）小鼠为1.8±1.0厘米三，而对于neu（新）/SR2F小鼠为1.7±1.0厘米三与对原发性乳腺肿瘤的潜伏期、多样性和大小没有影响相反，SR2F的存在显著降低了该模型中肺转移的发生率3.3倍（图b） ●●●●。这表明，长期接触SR2F可以保护小鼠免受内源性原发肿瘤的转移，而不会加速原发肿瘤形成。
SR2F对转移性乳腺癌MMTV-neu转基因模型中原发性肿瘤发生和转移的影响。MMTV-neu小鼠与FVB/NCr对照小鼠或MMTV-SR2F小鼠杂交，产生表达neu（新）独自一人(neu（新）)或者对neu（新）和SR2F转基因(neu（新）/SR2F）。小鼠经过一轮妊娠，然后监测肿瘤的发展。(一)肿瘤潜伏期。潜伏期被确定为首次出现可触及乳腺肿瘤的时间。平均潜伏期为34周neu（新）大鼠为32.5周neu（新）/SR2F组（无统计学差异）。(b条)转移。对两个基因型组小鼠的肺部进行组织学检查，以确定是否存在转移。
长期接触SR2F TGF-β拮抗剂与主要不良反应无关。
在基因工程小鼠模型中，TGF-β功能的丧失与严重的免疫系统功能障碍和增加的自发肿瘤发生有关(17–19,33,34). 为了确定长期接触SR2F TGF-β拮抗剂是否有类似的效果，我们分析了MMTV-SR2F和野生型FVB/NCr小鼠的免疫表型和自发病理。在很小的年龄，TGF-β1缺失小鼠会发展成淋巴增生综合征，伴有自身免疫性表现和髓样增生(17,18,35,36). 然而，在对7至10个月龄MMTV-SR2F和FVB/NCr小鼠的分析中，我们发现循环白细胞、红细胞、血小板或分段中性粒细胞的数量没有显著差异（数据未显示）。未观察到淋巴结病变或脾肿大，脾细胞FACS分析显示MMTV-SR2F小鼠的B细胞和CD4、CD8单阳性T细胞比例正常，提示外周淋巴细胞无异常扩张。对更大鼠群脾脏T细胞群的更详细分析表明，T细胞早期激活标记物（如CD69和CD25）在MMTV-SR2F小鼠和野生型对照组中的表达水平相同（数据未显示）。CD4细胞比例有小幅但显著的增加+具有记忆表型的T细胞（CD4+CD44细胞高的CD62型低的; 参见图)和CD8中+与年龄匹配的对照组相比，老年MMTV-SR2F小鼠的记忆T细胞（数据未显示）。然而，与TGF-β1基因敲除小鼠相比，记忆表型获得的增加是最小的（图).
长期接触SR2F对记忆性T细胞表型的影响。CD4的百分比+具有记忆性T细胞表型（CD4）的T细胞+CD44细胞高的CD62L型低的)通过对不同年龄野生型和MMTV-SR2F转基因小鼠脾脏的FACS分析确定。TGF-β1为空(转化生长因子-β1–/–)和年龄和应变匹配的野生型(转化生长因子-β1+/+)展示小鼠进行比较。TGF-β1基因缺失的小鼠不能存活约3周。
为了确定长期接触SR2F是否有其他影响，对22只雌性FVB/NCr小鼠（平均年龄20±2个月）和20只雌性MMTV-SR2F小鼠进行了完全尸检+/+小鼠（平均年龄21±4个月）。尸检时，转基因组血清中SR2F的平均水平为930±551 ng/ml（范围207–1958 ng/ml），乳腺中为496±287 ng/g（范围127–976 ng/g）。930 ng/ml的平均血清水平足以中和5 ng/ml TGF-β，这对于大多数已知的生物反应来说已经饱和了。因此，这些老龄小鼠中SR2F的量可能超过了内源性TGF-β的中和量。尽管SR2F水平很高，但与FVB/NCr对照组相比，老年MMTV-SR2F小鼠任何器官的肿瘤病变发生率均没有增加（表). 每只小鼠的平均肿瘤数为1.5±1.1(n个=20）对于SR2F小鼠和1.6±1.4(n个=22）对于FVB/NCr小鼠。尤其是结肠肿瘤，在TGF-β1阴性小鼠中发病率很高(19)在两个基因型组中均未发现。此外，没有证据表明TGF-β1阴性小鼠具有弥漫性血管炎的特征(17,18). 与野生型对照组相比，老龄SR2F小鼠肺、肾和胰腺淋巴细胞浸润的发生率增加（数据未显示）。然而，当存在时，浸润的严重程度为最低至轻度，这与限制TGF-β1阴性小鼠寿命的严重多灶炎症反应非常不同。同样，严重心肌炎是TGF-β1缺失小鼠的显著特征(17)在老龄SR2F小鼠中未发现。自发性小鼠心肌病是一种与年龄相关的小鼠退行性病变(37). 这种以慢性炎症和肌纤维变性为特征的疾病在SR2F小鼠中的发病率略有增加（95%的SR2F鼠有这种病变，而FVB/NCr对照组为68%；P（P）= 0.04). 然而，当这些病变出现在任一基因型时，其严重程度仅为轻微到轻微，与任何发病率无关。
表1
老年FVB/NCr和MMTV-SR2F小鼠的肿瘤发病率
讨论
TGF-βs的表达，尤其是TGF-(10). 在乳腺癌中，TGF-β1蛋白水平在原发性人类乳腺癌的进展边缘和淋巴结转移中增加(38). 由于新诊断的乳腺癌患者的血浆TGF-β1水平升高，因此原发肿瘤和转移瘤似乎都向循环中分泌TGF-(39). 最近的研究表明，用中和TGF-β抗体治疗可以抑制接种多种肿瘤细胞的小鼠的转移，从而证实TGF-(29–31). 这些观察结果使TGF-β成为预防转移的新策略的一个有吸引力的分子靶点。然而，TGF-βs及其受体几乎在哺乳动物组织中普遍表达(1). 这对长期临床使用TGF-β拮抗剂提出了一个主要的概念性问题，因为TGF-(1).
在本研究中，我们已经表明，长期暴露于SR2F（一种可溶性受体：Fc融合蛋白类的TGF-β拮抗剂）可显著防止内源性原发肿瘤或转移细胞注射引起的转移。此外，我们已经证明，拮抗剂这样做既不会促进原发性肿瘤的发展，也不会诱发威胁生命的病理学，在许多小鼠模型中，TGF-β功能被其他机制实验性损害。例如，TGF-β1基因缺失的小鼠有严重的免疫系统缺陷，并且总是发展成具有自身免疫疾病许多特征的致命多灶炎症综合征(17,18,35). 当交叉到Rag2空白背景以防止致命炎症时，TGF-β1空白小鼠会发展成高发病率的结肠癌(19). 同样，实验性减少的TGF-β信号转导可以促进许多其他上皮组织的肿瘤发生(24,40,41). 然而，在对我们的老年MMTV-SR2F转基因小鼠的广泛分析中，我们发现终生接触这种形式的TGF-β拮抗剂不会导致自发肿瘤发生率增加。此外，在这些小鼠中观察到的唯一免疫表型是记忆性T细胞群随着年龄的增长而略有增加，16至26个月大的动物的肺、胰腺和肾脏中轻微至轻度淋巴细胞浸润的发生率无临床意义的增加。
我们的数据表明，SR2F TGF-β拮抗剂能够在体内区分与维持正常体内平衡相关的TGF-α和参与疾病发病机制的不良TGF-γ。我们推测，这种区别可能是基于TGF-β的剂量或可及性。与许多纤维增生性疾病一样，晚期转移性疾病的特征是TGF-βs的过度表达(8,10). 对于给定的组织，可能存在TGF-β的临界阈值剂量，超过该阈值，不希望的遗传程序就会被激活。如果是这样，我们研究中的SR2F水平可能已经足以将TGF-β降低到促进转移所需的阈值水平以下，同时保持在正常生理功能所需的水平以上。或者，TGF-β的生物潜伏期可能是提供治疗机会窗口的特征。几乎所有细胞都以生物潜伏形式生成TGF-β，在配体与受体结合之前必须激活该形式(42). 由于难以在原位区分潜在和活性TGF-β，因此对体内这一过程知之甚少。然而，最近有研究表明，在正常乳腺中，潜伏的TGF-β的激活是在细胞对细胞的基础上局部发生的，活性的TGF--β仅限于细胞表面(43). 虽然原位肿瘤对TGF-β的激活尚未研究，但已知培养的高转移细胞以活性形式分泌大量TGF-(44,45). 这就增加了一种可能性，即相对庞大的拮抗剂（如SR2F）可能很难接触到正常组织和早期肿瘤中的细胞相关活性TGF-β，但可能能够有效中和病理状态下大量广泛分布的活性TGF--β。
在我们使用的模型中，SR2F抑制转移的生物学机制目前尚不清楚。在尾静脉转移模型中，我们认为SR2F影响了外渗后的一个步骤。其他模型系统的研究表明，外渗通常不是一个限制步骤，而是休眠单个细胞微转移的形成和微转移向大转移的进展是两个最脆弱的步骤(46). 我们的初步数据表明，SR2F小鼠肝脏中的黑色素瘤细胞早期形成微转移的效率至少与野生型宿主相同，但这些小病灶无法形成更大的转移灶（数据未显示）。事实上，SR2F转基因小鼠的转移瘤增殖率略低于野生型小鼠（溴脱氧尿苷标记细胞分别为17.7%±5.2%和23.7%±6.9%；P（P）=0.016），而在两种基因型小鼠的转移瘤中基本上检测不到凋亡（数据未显示）。由于37-32细胞在体外被TGF-β抑制生长（数据未显示），体内增殖数据表明SR2F间接抑制转移。可信的间接机制包括增强免疫监视和减少血管生成(2,47)，我们正在积极调查这些可能性。
总之，我们的数据表明，长期接触SR2F TGF-β拮抗剂可以显著抑制小鼠的转移，而无任何不良副作用。SR2F TGF-β拮抗剂具有高亲和力和延长体内半衰期，这种意外的选择性使其成为临床应用的候选药物。大多数癌症患者死于转移，因此在原发肿瘤诊断后对患者长期服用SR2F可能会降低转移效率，从而提高死亡率。此外，这种方法可能广泛适用，因为TGF-β升高与多种肿瘤类型的不良预后有关(10).
致谢
我们感谢Monica Tsang和Greg Fransen慷慨捐赠SR2F cDNA构建物，感谢Richard Simon提供统计分析方面的专家建议，感谢Lisa Birely为小鼠提供的出色技术援助。这项工作的部分资金来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所，合同编号为NO1-CO-12400。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。
脚注
参见第页开头的相关评论1533.
杨宇安现在的地址是：美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系。
工具书类
1.Roberts，A.B.和Sporn，M.B.，1990年。转化生长因子-β。在实验药理学手册。肽生长因子及其受体。M.B.Sporn和A.B.Roberts，编辑。斯普林格·弗拉格。德国柏林。419–472.
2Derynk R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF-β信号在肿瘤抑制和癌症进展中的作用。Nat Genet。2001;29:117–129.[公共医学][谷歌学者] 三。Massague J、Blain SW、Lo RS.生长控制、癌症和遗传性疾病中的TGFβ信号转导。单元格。2000;103:295–309.[公共医学][谷歌学者] 4de Caestecker MP、Piek E、Roberts AB。转化生长因子-β信号传导在癌症中的作用。美国国家癌症研究所杂志。2000;92:1388–1402.[公共医学][谷歌学者] 5Reiss M.转化生长因子-β与癌症。微生物感染。1999;1:1327–1347.[公共医学][谷歌学者] 6顶部JN。心血管系统中的TGF-β：上下文特异性生长因子的分子机制。心血管医学趋势。2000;10:132–137.[公共医学][谷歌学者] 7Chen W，Wahl SM。操纵TGF-β控制自身免疫性和慢性炎症性疾病。微生物感染。1999;1:1367–1380.[公共医学][谷歌学者] 8Branton MH，Kopp JB公司。TGF-β与纤维化。微生物感染。1999;1:1349–1365.[公共医学][谷歌学者] 9Reed SG.感染和传染病中的TGF-β。微生物感染。1999;1:1313–1325.[公共医学][谷歌学者] 10金LI。转化生长因子-β（TGF-β）在人类癌症中的作用。Oncog评论。1999;10:303–360.[公共医学][谷歌学者] 11Border WA等。转化生长因子-β的天然抑制剂可防止实验性肾脏疾病中的瘢痕形成。自然。1992;360:361–364.[公共医学][谷歌学者] 12Border WA，Okuda S，Languino LR，Sporn MB，Ruoslahti E.转化生长因子β1抗血清对实验性肾小球肾炎的抑制作用。自然。1990;346:371–374.[公共医学][谷歌学者] 13Ueno H等。肌肉中表达的可溶性转化生长因子β受体可防止大鼠肝纤维化和功能障碍。人类基因治疗。2000;11:33–42.[公共医学][谷歌学者] 14Isaka Y等。通过转化生长因子-β受体-IgG-Fc嵌合体的基因治疗抑制实验性肾小球肾炎中细胞外基质的积聚。肾脏Int。1999;55:465–475.[公共医学][谷歌学者] 15Zheng H，Wang J，Koteliansky VE，Gotwals PJ，Hauer-Jensen M.重组可溶性转化生长因子βⅡ型受体改善小鼠放射性肠病。胃肠病学。2000;119:1286–1296.[公共医学][谷歌学者] 16王强，等。通过转化生长因子β可溶性受体减少博莱霉素诱导的仓鼠肺纤维化。胸部。1999;54:805–812. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Kulkarni AB等。小鼠转化生长因子β1缺失突变会导致过度炎症反应和早期死亡。美国国家科学院程序。1993;90:770–774. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Shull MM等。小鼠转化生长因子-β1基因的靶向破坏导致多灶性炎症疾病。自然。1992;359:693–699. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Engle SJ等。转化生长因子β1在肿瘤发生的早期抑制非转移性结肠癌。癌症研究。1999;59:3379–3386.[公共医学][谷歌学者] 20Komesli S，Vivien D，Dutartre P.嵌合细胞外区域II型转化生长因子（TGF）-β受体作为TGF-β拮抗剂融合到人免疫球蛋白的Fc区。欧洲生物化学杂志。1998;254:505–513.[公共医学][谷歌学者] 21Fernandez-Botran R.可溶性细胞因子受体：新型免疫治疗剂。药物研究专家。2000;9:497–514.[公共医学][谷歌学者] 22Wang TC，等。MMTV-cyclin D1转基因小鼠的乳腺增生和乳腺癌。自然。1994;369:669–671.[公共医学][谷歌学者] 23Hogan，B.L.、Costantini，F.和Lacy，E.1986年。操作小鼠胚胎：实验室手册。冷泉港实验室出版社。美国纽约州普莱恩维尤53-57。
24Bottinger EP、Jakubczak JL、Haines DC、Bagnall K、Wakefield LM。过度表达显性阴性突变型II转化生长因子β受体的转基因小鼠对致癌物7,12-二甲基苯-[a]-蒽的反应增强了乳腺和肺部的肿瘤发生。癌症研究。1997;57:5564–5570.[公共医学][谷歌学者] 25Danielpour D、Dart LL、Flanders KC、Roberts AB、Sporn MB。免疫检测和定量培养细胞分泌的两种形式的转化生长因子-β（TGF-β1和TGF-α2）。细胞生理学杂志。1989;138:79–86.[公共医学][谷歌学者] 26Jakowlew SB、Moody TW、You L、Mariano JM。小鼠肺癌发生过程中转化生长因子-βII型受体的减少。霉菌致癌。1998;22:46–56.[公共医学][谷歌学者] 27Otsuka T等。体内met-mediated生物反应的解除：天然肝细胞生长因子/分散因子剪接变体NK2拮抗生长但促进转移。分子细胞生物学。2000;20:2055–2065. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Fueyo J等。胶质瘤中E2F-1的过度表达可在体内外触发细胞凋亡并抑制肿瘤生长。自然医学。1998;4:685–690.[公共医学][谷歌学者] 29Arteaga CL等。抗转化生长因子（TGF）-β抗体抑制乳腺癌细胞的致瘤性并增加小鼠脾脏自然杀伤细胞的活性。肿瘤细胞/宿主TGF-β相互作用在人类乳腺癌进展中的可能作用。临床投资杂志。1993;92:2569–2576. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Wojtowicz-Praga S等。抗转化生长因子β抗体和白细胞介素-2对B16黑色素瘤生长和转移的调节。免疫学杂志强调肿瘤免疫学。1996;19:169–175.[公共医学][谷歌学者] 31Hoefer M，Ander FA。具有预先确定的特异性的抗（转化生长因子β）抗体可抑制高致瘤性人类异种移植在nu/nu小鼠中的转移。癌症免疫疗法。1995;41:302–308. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Guy CT等。neu原癌基因在转基因小鼠乳腺上皮中的表达可诱导转移性疾病。美国国家科学院程序。1992;89:10578–10582. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33.Gorelik L，Flavell RA。T细胞中TGFβ信号的缺失导致T细胞自发分化和自身免疫性疾病。免疫。2000;12:171–181.[公共医学][谷歌学者] 34Lucas PJ，Kim SJ，Melby SJ，Gress RE。表达T细胞特异性显性负性转化生长因子βII受体的小鼠T细胞稳态的破坏。《实验医学杂志》。2000;191:1187–1196. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Dang H等。TGF-β基因敲除小鼠中SLE样自身抗体和干燥综合征样淋巴增殖。免疫学杂志。1995;155:3205–3212.[公共医学][谷歌学者] 36Letterio JJ等。小鼠TGF-β1缺乏相关的自身免疫依赖于MHC II类抗原的表达。临床投资杂志。1996;98:2109–2119. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37.Price，P.和Papadimitriou，J.M.，1996年。年龄相关性和病毒性心脏病的遗传和免疫决定因素。在衰老小鼠的病理生物学。U.Mohr等人，编辑。ILSI出版社。美国华盛顿特区，373–383。
38Dallal BI，宾夕法尼亚州基翁，格林伯格。分泌的转化生长因子-β1在原发性肿瘤前进边缘和乳腺癌淋巴结转移中的免疫细胞化学定位。《美国病理学杂志》。1993;143:381–389. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39.Kong FM等。乳腺癌患者手术切除肿瘤后血浆转化生长因子-β1水平升高，降低。安·苏格。1995;222:155–162. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Tang B等。转化生长因子-β1是一种新形式的肿瘤抑制因子，具有真正的单倍体功能不全。自然医学。1998;4:802–807.[公共医学][谷歌学者] 41Amendt C，Schirmacher P，Weber H，Blessing M。小鼠皮肤中显性负II型TGF-β受体的表达导致癌症发病率增加和癌症发展加速。致癌物。1998;17:25–34.[公共医学][谷歌学者] 42Munger JS等。潜在转化生长因子-β：结构特征和激活机制。肾脏Int。1997;51:1376–1382.[公共医学][谷歌学者] 43Barcellos-Hoff MH，Ewan KBR。转化生长因子-β与乳腺癌：乳腺发育。乳腺癌研究。2000;2:92–99. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Schwarz LC等。转移性恶性肿瘤中TGF-β的异常生成和调节。生长因子。1990;三:115–127.[公共医学][谷歌学者] 45Wakefield LM、Smith DM、Masui T、Harris CC、Sporn MB。转化生长因子-β细胞受体的分布与调控细胞生物学杂志。1987;105:965–975. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Chambers AF等人，《血行转移的关键步骤：综述》。北美外科肿瘤临床。2000;10:243–255.[公共医学][谷歌学者] 47Gorelik L，Flavell RA。通过阻断T细胞中转化生长因子-β信号转导的免疫介导的肿瘤根除。自然医学。2001;7:1118–1122.[公共医学][谷歌学者] 
