介绍
突触前终末通过突触小泡胞吐释放神经递质。胞吐过程中的膜融合由SNARE蛋白synaptobrevin/VAMP、SNAP-25和syntaxin 1以及SM-protein Munc18-1（综述于Lin和Scheller，2000年;扬等, 2003). 然而，只有Munc18-1，而不是synaptobrevin和SNAP-25是绝对必要的突触膜融合。在缺乏突触蛋白或SNAP-25的突触中，突触囊泡融合仍然会自发发生，并且仍然可以通过动作电位或高渗蔗糖诱发，尽管水平有所降低(肖克等2001年;Washbourne公司等, 2002). 相反，缺少Munc18-1的突触没有自发或诱发释放(维尔哈吉等, 2000). 这些发现表明，其他SNARE蛋白与synaptobrevin和SNAP-25是冗余的，和/或在没有SNARE蛋白质的情况下可以发生融合。
突触小泡包含一个称为Rab3A、B、C和D的GTP结合蛋白家族，在神经递质释放中执行冗余功能(施吕特等, 2004; 已在中审阅Darchen和Goud，2000年). Rab3蛋白被认为通过两种保守的依赖GTP的效应蛋白发挥作用：一种称为rabphilin的细胞溶质蛋白(白桦等, 1993;锂等, 1994)和称为α-RIMs的活性区蛋白(王等, 1997,2000). Rabphilin属于一个大蛋白家族，包括亲颗粒蛋白/亲外蛋白2/Slp4、亲外蛋白3/Slp6和亲外蛋白9/Slp5（综述于伊祖米等, 2003;福田，2005). 这些蛋白质的特征是N末端锌指序列与Rab3和/或Rab27（另一种胞外Rab蛋白）和两个C末端C相互作用2至少在兔蛋白中结合Ca的结构域2+神经末梢含有两个α-RIM（RIM1α和2α；Wang和Südhof，2003年)包含N端Rab3-结合锌指序列和两个C端C的2与rabphilin相似的结构域。然而，C2兔亲素结合Ca的结构域2+(乌巴赫等, 1999)而RIM没有(戴等, 2005).
小鼠遗传分析和秀丽隐杆线虫对rab3和α-RIM的功能提供了深入的了解，但对raphilin相对没有信息。在小鼠中，仅Rab3A的缺失导致显著的突触表型(格佩特等, 1994,1997;卡斯蒂略等, 1997)而全部四种Rab3亚型的缺失是致命的(施吕特等, 2004). 与释放中的角色一致，删除秀丽线虫（只有一个亚型）产生突触表型(Nonet公司等, 1997). 在小鼠和秀丽线虫，RIM1α的缺失严重损害了对接后缺陷引起的突触小泡胞吐(库什卡等2001年;肖克等, 2002). 此外，RIM1α缺失导致小鼠突触可塑性发生较大变化(卡斯蒂略等, 2002;肖克等, 2002). 与rab3和RIM1α的缺失相比，rabphilin的缺失对小鼠没有检测到的影响(施吕特等, 1999)，在秀丽线虫然而，突触SNARE蛋白的同时突变显著增强了这一点(斯汤顿等2001年). 这个秀丽线虫数据表明，尽管亲兔素本身不是必需的，但可能有助于SNARE功能。然而，这一观察对神经递质释放的意义尚不清楚。
在本研究中，我们检测了兔亲素可能在与SNARE蛋白相关的胞吐中发挥作用的可能性，但在兔亲素敲除（KO）小鼠的表型的标准筛选中不明显。我们的数据表明，在野生型突触中，在囊泡的易释放池（RRP）耗尽后，拉菲蛋白的缺失会显著增加释放，而在突触缺乏型突触，拉菲肽的缺失会增加所有Ca的释放2+-触发释放，可能是因为synaptobrevin缺失导致RRP持续耗竭。我们发现“底部”Ca2+-C的独立曲面2兔亲素的B结构域直接与SNARE蛋白SNAP-25结合，从而为我们在生理实验中观察到的兔亲素作用提供了一种机制解释。这些数据表明，兔亲素是神经递质释放的调节器，当RRP耗尽时，它与质膜SNARE蛋白一起发挥作用。
结果
SNARE复合物与Rab3A通过Raphilin的相互作用
利用GST下拉框，我们首先测试了大鼠脑拉菲蛋白是否与SNARE蛋白结合。我们发现GST-SNAP-25有效地捕获了兔流感病毒，而GST-synaptobrevin和GST-syntaxin没有(). 相反，GST-syntaxin与其主要脑结合伙伴Munc18-1结合(哈塔等, 1993)而GST-synaptobrevin和GST-SNAP-25则没有。Raphilin与SNAP-25的结合以及Munc18-1与syntaxin的结合是特异性的，因为突触素1不与任何SNARE蛋白结合。所有三种GST-SNARE蛋白都类似地捕获了复合蛋白()，表明所有三种GST-SNARE蛋白都成核SNARE复合物的组装，因为复合物只与组装的SNARE复合物结合(麦克马洪等, 1995). 因此，尽管兔亲素似乎没有与完全组装的SNARE复合物结合，但它确实与SNAP-25/突触蛋白异二聚体结合(补充图1).
Raphilin与SNAP-25的结合。(A类)用固定化GST、GST-syntaxin、GST-SNAP-25和GST-synaptobrevin（在50 mM HEPES中pH 7.2、0.1 M NaCl、4 mM EGTA、2 mM MgCl2、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）和0.5%Triton X-100）。通过免疫印迹（顶面板）分析兔亲素（Rph）、突触素1（Syp 1）、Munc18-1（M18-1）和复合蛋白1和2（Cpx 1和2）的结合蛋白。底部面板显示GST蛋白的考马斯蓝染色凝胶，以说明使用了类似数量的蛋白质。(B类)大鼠脑蛋白（上面板）或重组SNAP-25（下面板）与含有全长兔亲素（GST-FL Rph）或兔亲素片段（GST-Rph1-181或-Rph1-361=兔亲素残基1–181或1–361；GST-Rph C2A、C2B或C2AB=C）的固定化GST融合蛋白的下拉2A-、C2B-或双C2兔瘟病毒A/B结构域片段；GST=仅GST控制）。结合蛋白通过免疫印迹分析SNAP-25和突触素1（Syp1；用作阴性对照）。(C类)二价阳离子对兔亲素与SNAP-25相互作用的影响。野生型（WT）和兔亲蛋白KO小鼠（KO）的可溶性突触囊泡蛋白在1 mM指示的二价阳离子存在下与GST-SNAP-25结合；结合蛋白通过免疫印迹分析。(D类)在1 mM Ca存在或不存在的情况下，用兔亲蛋白（I734）N末端的多克隆抗体从洗涤剂溶解的突触体中免疫沉淀兔亲蛋白2+结合蛋白用单克隆抗体SNAP-25、突触蛋白1、Rab3A、突触素1（Syp1）、GDI或rabphilin（Rph）进行免疫印迹分析。(E、 F类)SNAP-25与兔亲蛋白共同免疫沉淀作为GDP与GTPγS的函数进行分析（E；抗体=“仅抗体”对照，提取物=用洗涤剂溶解的突触体提取物和蛋白G-Sepharose进行对照），或作为独立兔亲蛋白抗体的函数（I734和I374=兔亲蛋白N末端半体抗体；I731=在钙存在或不存在的情况下对兔亲素C末端半部分的抗体2+（F） ●●●●。在（E）和（F）中，兔病毒带下方的涂片是由免疫沉淀的IgG引起的。
SNAP-25是否直接或间接与兔瘟病毒结合？为了研究这一点，我们比较了天然脑SNAP-25和重组SNAP-25-与全长兔亲蛋白和兔亲蛋白片段的固定化GST融合蛋白的结合，从而扭转了最初GST下拉实验的方向。我们发现GST-raphilins同样有效地保留了大脑和重组SNAP-25()，表示直接交互。包括其锌的兔亲蛋白的N末端一半2+-指状结构域和磷酸化位点(费克斯等, 1995;斯塔尔等, 1996)，及其C端子C2B域捕获的SNAP-25(). 兔子蛋白N末端一半的SNAP-25结合没有进一步研究，因为我们手中的这个区域经常受到非特异性相互作用的影响，可能是因为它的一部分是天然展开的。兔瘟素C的结合2B域是特异性的，因为突触结合蛋白1 C2B结构域，其结构类似于Raphilin C2B域，无法下拉SNAP-25（未显示数据）。
自从拉宾C2B结构域是Ca2+-绑定域(乌巴赫等, 1999)，我们接下来测试了各种二价阳离子对rabphilin/SNAP-25相互作用的影响(). 二价阳离子对GST-SNAP-25从野生型小鼠脑匀浆中去除兔瘟蛋白的能力没有影响(). 作为阴性对照，我们测试了兔流感KO小鼠的脑匀浆(施吕特等, 1999)，但未发现绑定(). 此外，我们没有观察到Rab3A的显著保留，也用作阴性对照，因为这些实验是在没有GTP的情况下进行的。
接下来，我们研究了内源性脑亲素和SNAP-25是否相互作用。我们在有利于SNARE复合物组装的条件下，从大鼠脑匀浆中免疫沉淀rabphilin，并通过免疫印迹法探索共免疫沉淀蛋白。我们发现SNAP-25和syntaxin 1与raphilin共同免疫沉淀，而syntaphysin和GDI则没有(). SNAP-25与兔亲和素的联合免疫沉淀与GTP无关(). 由于GST下拉显示C2兔亲蛋白的B结构域至少部分负责SNAP-25的结合，我们检测了针对兔亲蛋白N末端一半（I734和I374）或其C末端C的抗体的相对能力2域（I731）与兔亲和素共同免疫沉淀SNAP-25。我们发现，尽管这三种抗体使用的免疫沉淀兔亲和素数量相似，但C端抗体在共免疫沉淀SNAP-25中的效力低于N端抗体()，与SNAP-25与C端子C的绑定一致2兔毒蛋白的B结构域。钙存在时SNAP-25结合适度增加2+可能是因为Ca2+稳定C2兔毒蛋白的结构域。
大多数C2钙的结构域2+-依赖性磷脂复合物（综述Nalefski和Falke，1996年;Rizo和Südhof，1998年). 先前的研究表明，拉菲菌素C2B结构域是一种有效的Ca2+-绑定域(乌巴赫等, 1999)，但没有通用Ca2+-检测到依赖性磷脂结合(锂等, 1994;钟等, 1998). 确定兔瘟素C2B结构域形成Ca2+-依赖性磷脂复合物，我们采用溶液结合试验(费尔南德斯等2001年). 由于磷脂结合的标准GST下拉试验不能可靠地检测到磷脂与所有C2域(费尔南德斯等2001年). 我们没有观察到明显的钙2+-C的依赖绑定2磷脂的结构域。隔离的C2然而，B结构域与具有高表观钙的脂质体结合2+亲和力（1-2μM）；相同的Ca2+-观察到双C的依赖性结合2A/B域片段(补充图2). 高表观钙2+兔亲和力C2B结构域/磷脂复合物与高固有钙很好地对应2+C的亲和力2B域(乌巴赫等, 1999)，表明C2兔病毒素的B结构域，类似于C2synaptotagmin 1的一个结构域可以形成两种钙2+-依赖性磷脂复合物和钙2+-与SNARE蛋白的独立复合物。
兔毒蛋白C的底面2具有的B域α-螺旋与SNAP-25结合
为了研究rabphilin/SNAP-25复合物的性质和化学计量比，我们使用了核磁共振波谱，正如之前用于确定rabphilin C的结构一样2B域(乌巴赫等, 1999). 使用重组，15我们记录了N标记的蛋白质1H–15C的N异核单量子相干（HSQC）光谱2存在或不存在未标记SNAP-25的B结构域，具有或不具有饱和钙浓度2+(). 在1H–15N HSQC光谱15N标记蛋白质，每个非脯氨酸残基由一个交叉峰表示，其位置反映了相应酰胺基团的微环境。因此1H–15一个的N个光谱15N-标记的蛋白质提供了一种灵敏的方法来监测未标记的蛋白质的结合并绘制结合位点。
兔瘟素C的特性2通过核磁共振波谱与SNAP-25结合的B结构域。（A、B）1H（H）-15N HSQC光谱15N标记为C2在不存在（黑色）或存在（红色）未标记SNAP-25（75μM）的情况下，从拉菲菌素（75μM）中提取B结构域。在0.2 mM EDTA中获得光谱(A类)或10 mM Ca2+(B类). 为了便于比较，确定了一些不随SNAP-25变化的交叉峰（如果峰未被Ca改变，则下划线2+，如果随Ca移动，则不加下划线2+). 添加SNAP-25后移动的峰值子集用箭头标记；这些峰在有钙和无钙时表现出类似的变化2+. (C、 D类)的扩展1H（H）-15兔红素C的N HSQC光谱2记录在10 mM Ca中的B域（75μM）2+不带SNAP-25（黑色）或带150μM SNAP-25（红色）。请注意，一些峰值随着SNAP-25而大幅移动，而其他峰值则没有移动。对于一些交叉峰，显示了剩余分配。
1H–15N HSQC光谱15N标记兔亲素C2B域（75μM）在缺失的情况下获得()和存在()钙的2+，无（黑色轮廓）或（红色轮廓）等摩尔浓度的SNAP-25（75μM）。SNAP-25导致C的HSQC光谱中的交叉峰的一般线加宽2B域，源于SNAP-25/C的较大规模2B域复合体。此外，SNAP-25导致了1H–15N HSQC交叉峰，由SNAP-25与相应残基结合引起。C线加宽2B域交叉峰的出现与钙的存在或缺乏无关2+这种加宽没有25kDa蛋白预期的那么严重，可能是因为游离的SNAP-25基本上是未折叠的，并且SNAP-25与Raphilin C结合2B畴在相互作用位置仅部分折叠。
一个子集中的移位1H–15兔红素C的N HSQC交叉峰2SNAP-25绑定后的B域可以在中所示的扩展中更好地观察到（在较高浓度的SNAP-25（150μM）下获得，以确保相互作用饱和）。The assignment of the1H–15兔红素C的N HSQC交叉峰2B域(乌巴赫等, 1999)使识别与移位的交叉峰相对应的残留物成为可能；它们在C结构中的位置2B域如所示.C类2结构域由稳定的β-三明治组成，在“顶部”（结合Ca的一侧）出现柔性环2+)和“底部”（不结合Ca的一侧2+;里佐和苏多夫，1998年). 引人注目的是，SNAP-25结合完全改变了交叉峰，对应于兔蛋白C“底部”表面的残基2B结构域，不结合Ca2+SNAP-25引起的峰间位移集中在C所特有的长底部α-螺旋中2兔亲素和突触素的B结构域(乌巴赫等, 1999;费尔南德斯等2001年)和在钙的存在和不存在方面是相同的2+().
C的功能区图2兔亲素B结构域：通过化学位移变化确定SNAP-25结合位点。该图显示了乌合之众C的视图2B域，绕垂直轴旋转90°。加利福尼亚州2+-绑定环显示在顶部，带有两个Ca2+离子结合（橙色；乌巴赫等, 1999). β-股显示为黄色。SNAP-25结合后发生变化的残基以红色显示。注意，这些变化仅限于底部α-螺旋和相邻的底部环。N和C端子用白色“N”和“C”表示。
从核磁共振结果可以得出几个结论。首先，SNAP-25似乎与兔病毒C结合2化学计量比1:1络合物中的B结构域。这一结论是基于当两种蛋白质以1:1的比例混合时观察到的显著的交叉峰位移，以及当SNAP-25加倍时，这些位移的幅度仅略有增加的事实(和数据未显示）。其次，在有钙和无钙的情况下观察到类似的峰间位移2+，确认C的交互作用2SNAP-25的B域不需要Ca2+第三，所有转移的交叉峰都来自于raphilin C底表面的残基2B结构域，主要位于C特征的独特α-螺旋中2B域().
删除拉菲林可促进使用依赖性抑郁症的恢复
rabphilin与SNAP-25的结合表明Rabphivin在胞吐中具有功能，但之前对Rabphirin KO小鼠的广泛分析未能检测到表型(施吕特等, 1999). 然而，这些分析可能遗漏了只有当突触传递依赖于SNARE复合体组装时才表现出来的表型。一种突触小泡对接和启动的模型表明，小泡以SNARE依赖的方式对接，随后被启动成为Ca2+-由SNARE依赖机制响应，允许Ca2+通过与synaptotagmin结合触发融合孔开放(苏霍夫，1995年). 根据这一概念，SNARE-复合体集合在被高频刺激序列耗尽后，成为突触上启动小泡RRP恢复的速率限制。因此，我们测试了在使用依赖性抑郁后，兔亲素的缺失是否会改变EPSC的恢复率。
我们以高密度培养了同窝野生型和兔亲KO小鼠的胚胎海马神经元，这些培养物在高密度下形成广泛的突触网络(补充图3)，并通过全细胞记录监测对场刺激的突触后反应。我们首先测量低频刺激期间的稳态EPSCs（60个刺激，0.4 Hz），然后应用高频刺激序列诱发大量突触抑制（1200个刺激，20 Hz），最后确定低频刺激期间EPSCs的恢复速度（60个激励，0.4 Hz；). 如前所述(施吕特等, 1999)，我们观察到兔亲素缺乏神经元和对照神经元在初始EPSCs的大小上没有差异()或使用依赖性抑郁的程度(). 然而，在高频刺激序列终止后，兔亲素的缺失显著加速了EPSCs的恢复().
raphilin缺失对使用依赖性抑郁症突触反应恢复的影响。(A类)实验设计。对野生型或兔亲蛋白KO小鼠培养的神经元进行分析，无需进一步操作（WT和Rph-KO），或用表达全长兔亲蛋白（iRph）的慢病毒或缺乏C2B域（iRΔC2B） ●●●●。以0.4 Hz刺激神经元150 s以确定初始EPSC振幅，然后以20 Hz刺激神经元60 s以引起使用依赖性抑郁，最后再次以0.4 Hz激励神经元150 s，以监测突触反应的恢复。(B类)初始EPSC振幅条形图。(C类)突触恢复期间的典型轨迹（为了清晰起见，仅显示前12个脉冲的前100毫秒）。(D、 E类)20 Hz刺激期间WT和Raphilin KO神经元突触反应的抑制（D；峰值电流归一化为第一反应），以及0.4 Hz刺激期间突触抑制的突触反应恢复（E；归一化至初始0.4 Hz刺激过程中每个细胞的平均振幅）。Rabbilin缺陷型突触在第21次脉冲前恢复得明显更快(P（P）<0.05). (F、 G公司)20Hz刺激时WT神经元和表达全长iRph或C-末端截断iRph（iRΔC2B） （F），以及随后这些神经元中突触反应的恢复（G）。对于（B）和（D–G），所示数据为平均值±s.e.m.（在四种独立培养物中分析的神经元数量：WT、，n个=14; Rph KO公司，n个=11; iRph、，n个=12; iRphΔC2B，n个=13).
恢复时间过程拟合了一个双指数函数
哪里A类1和A类2和τ1和τ2分别为第一和第二分量的振幅和时间常数，以及米是一个偏移值，用于校正监测期结束时EPSC的不完全恢复）。拉菲林的缺失使第一组分的振幅增加了2倍以上，而恢复的第二组分的幅度则相应减少（WT:A类1, 0.219±0.038;A类2, 0.547±0.066 (n个=14个细胞/3个培养物）；让开：A类1, 0.587±0.068;A类2, 0.331±0.059 (n个=11个细胞/3个培养物）；P（P）<0.0001; 也会导致不同的偏移值；重量：米=0.241±0.051; 让开：米=0.135±0.041). 然而，两种回收组分的时间常数没有显著改变（WT:τ14.5±0.6秒；τ257.0±4.1秒；KO：τ13.5±0.6秒；τ2，55.4±5.3秒(n个同上）；P（P）>0.25). 因此，Raphilin的缺失使小泡从缓慢恢复模式转变为快速恢复模式，这表明Raphilin通常在广泛的突触活动后控制小泡的重新启动。
兔亲素缺失对恢复的影响是由于其与SNAP-25的相互作用吗？作为这个问题的第一个测试，我们检查了是否可以通过表达野生型兔亲蛋白或缺乏C2B结构域，因此不通过其C与SNAP-25结合2B域。用重组慢病毒在培养的神经元中高效表达了这两种蛋白(补充图4). 我们发现用慢病毒表达的野生型兔流感病毒逆转了兔流感病毒KO表型(; 数值：KO与WT慢病毒，τ13.8±0.6秒；τ265.7±5.8秒；A类1, 0.294±0.035;A类2, 0.466±0.059;米=0.241±0.051 (n个=12个细胞/3个培养基））。除其他外，该结果表明，兔亲蛋白KO恢复动力学的增加不是发育异常，因为它可以通过在有丝分裂后神经元中表达兔亲蛋白来挽救。与全长兔亲蛋白相比，截短的兔亲蛋白无法拯救兔亲蛋白KO表型(; 带有表达截短兔亲素τ的慢病毒的KO14.0±0.5秒；τ262.5±4.6秒；A类1, 0.495±0.046;A类2, 0.441±0.037 (n个=13个细胞/3个培养物）；P（P）=0.002;米=0.091±0.025;P（P）=0.011 (P（P）-数值用于比较感染野生型和表达慢病毒的C末端截短兔病毒的KO培养物）。
兔亲素对突触素缺乏突触自发和蔗糖诱导的突触活动的影响
为了用另一种方法测试兔亲素是否与SNARE蛋白发生功能性相互作用，我们使用了先前生成的突触素KO小鼠(肖克等2001年;德拉克等, 2004). 我们对在两种繁殖方案中产生的同窝小鼠培养的胚胎海马神经元进行了电生理分析：野生型和杂合突触短肽2 KO小鼠杂交获得的突触短肽KO小鼠，和缺乏或含有突触蛋白2的兔亲蛋白KO小鼠，它们是在兔亲蛋白KO纯合和突触蛋白KO杂合的小鼠杂交中获得的。这些实验背后的总的想法是，删除synaptobrevin应该会产生一种类似于使用依赖性抑郁的状态。在这两种情况下，RRP都被耗尽，组装的SNARE复合体基本上不存在；因此，如果拉比林正常抑制钙2+-这种状态下产生的依赖性胞吐，其缺失也可能放大突触素缺乏神经元中剩余的胞吐。
我们首先研究了自发突触事件（“minis”；). 如前所述，突触素缺乏的神经元自发事件的频率下降了约10倍(肖克等2001年)，而Raphilin缺陷神经元没有显示出显著的变化(施吕特等, 1999). 在兔/突触素双KO神经元中，微频率的降低甚至比突触素KO神经元更严重(). 突触短肽缺陷神经元的minis振幅略大于野生型神经元()与突触素缺乏神经元中囊泡大小的增加相一致(德拉克等, 2004). 突触素缺乏突触的上升时间往往更长，尽管这种差异仅在突触素/兔亲素双KO小鼠与兔亲素单KO小鼠之间的比较中才达到显著水平().
培养海马神经元的自发突触反应（“minis”）和高渗蔗糖诱发的突触反应。(A类)野生型（WT）、突触素KO（Syb2 KO）、兔亲蛋白KO（Rph KO）和突触素/兔亲蛋白双KO小鼠（SR DKO）神经元中1μM河豚毒素监测到的自发突触事件的代表性痕迹。(B类)自发突触事件的频率。只有synaptobrevin缺陷型和synaptoprevin/raphilin双重缺陷型突触之间存在显著的统计学差异。(C类)自发突触事件的振幅。突触素缺乏的神经元比含有突触素的神经元表现出更大的振幅，但这种差异仅在所示的比较中具有统计学意义。(D类)自发突触事件的上升时间（以达到一半最大值所需的时间衡量）。双KO神经元（SR-DKO）的上升时间明显慢于兔单KO神经元。在（B–D）中，显示的所有数据均为平均值±标准误差(n个=19 SR DKO；10 Syb2 KO；8重量；8 Rph KO）。(E类)高渗蔗糖（0.5 Osm）诱发的典型突触反应痕迹。(F类)监测WT和各种单、双KO神经元对蔗糖的突触反应总图。响应计算为响应峰值处2 s时间间隔内的累积电荷转移积分（平均值±s.e.m。；n个=SR DKO为16，n个=12，对于rph KO，n个=6，对于syb2 KO和n个=WT为4）。
接下来，我们通过测量对高渗蔗糖的突触反应来评估RRP的大小(Rosenmund和Stevens，1996年;). 突触素KO导致蔗糖反应降低约10倍。拉菲菌素的额外缺失并没有改变蔗糖诱导反应的平均大小；同样，拉菲蛋白的单一KO也不会改变蔗糖反应(). 当分析蔗糖反应的整个时间段而不是急性期时，也得到了相同的结果（数据未显示）。因此，基于自发和蔗糖诱导的释放，在突触蛋白KO顶部额外删除兔亲素通常不会增加突触小泡的释放能力。
Rabbhilin/突触短肽双KO神经元的诱发突触反应
接下来，我们研究了1Hz电场刺激引起的动作电位的突触反应(). 突触素缺乏的神经元只对34.2±7.8%的动作电位有反应(n个=11），而野生型和Raphilin KO神经元对100%的动作电位有反应(). 删除拉菲菌素后，突触素缺乏神经元的反应率增加了2倍以上（至78.5±7.8%；n个=12），使突触事件几乎完全可靠。此外，兔亲素缺失使突触反应的平均振幅增加了约2倍，突触蛋白缺乏但野生型神经元没有（突触蛋白KO=32.7±7.9pA(n个=11); 双KO=76.9±22.6 pA(n个=12); 野生型=757.8±145.0 pA(n个=4); 兔毒蛋白KO=709.8±140.9 pA(n个=7);). 在这些实验中，神经元可能会接收数百个突触输入，每个刺激都会在一个子集的输入中引发释放，这取决于它们的释放概率。因此，观察到突触素缺乏神经元的低反应率加上反应幅度小，意味着在这些突触中，实际释放概率很低，突触素缺乏神经元中rabphilin的额外缺失大大增加了这种释放概率，而不是观察到的总反应的2倍增加。
对1Hz刺激的突触反应。(A类)1 Hz场刺激期间全细胞记录的代表性痕迹。为了清晰起见，只显示了每个响应的前200毫秒。(B类)突触素-KO神经元（Syb2-KO）和双突触素/raphilin-KO神经细胞（SR-DKO）记录的反应日记图。(C类)在1 Hz的60个脉冲期间成功刺激的分数。(D类)诱发反应的振幅。（C，D）中的数据为平均值±s.e.m(n个=11个Syb2 KO细胞；7个SR-DKO细胞；7个Rph KO细胞；4个WT细胞）。
最后，我们研究了突变突触对10Hz刺激的反应。在这个刺激频率下，突触素缺乏的突触表现出强烈的易化性(德拉克等, 2004; 看见). 拉菲菌素和联会霉素的缺失将这种促进转化为抑郁()而rabphilin的缺失对突触抑制没有影响(). 这些结果为结论提供了独立的证实()突触蛋白KO背景中拉菲蛋白的缺失显著增加了释放概率。同时，我们还使用荧光FM-dye染色和去染色测量了突触中突触小泡循环池的大小(德克等, 2004). 如前所述，池大小由90 mM K的单个去极化标记+与野生型对照组相比，突触素KO神经元显著减少（～3倍；肖克等2001年;德拉克等, 2004). Raphilin的额外缺失显著增加了突触素缺乏神经元的池大小（约2倍；)与Ca的增加相一致2+-触发释放。
对10 Hz刺激的突触反应。(A类)在10 Hz刺激synaptobrevin KO神经元（Syb2 KO）和synaptoprevin/rabphilin双KO神经元的全细胞记录中获得的代表性痕迹。显示了对脉冲#1-10和191-200的响应。(B、 C类)突触素KO小鼠和突触素/兔亲素双KO小鼠在10 Hz刺激期间三个细胞的突触反应日记图。(D类)突触素KO神经元10Hz刺激期间突触反应的正常振幅（Syb2 KO；n个=9）和synaptobrevin/raphilin双KO神经元（SR-DKO；n个=9). 突触反应被归一化为序列中前五个脉冲的平均值，并显示为平均值±s.e.m。只有突触蛋白KO神经元与其他三种基因型之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.05). (E类)通过FM2-10染色和去染色测量突触小泡循环池的大小。用5×90 mM KCl/2 mM CaCl去除负载FM2-10的突触泡2(n个=SR DKO为12（610个突触），n个Rph KO=10（632个突触），n个=10（486个突触），对于syb2-KO，以及n个=9（533个突触），用于四种独立培养物中的WT）。所示数据为荧光损失分布直方图（以任意单位表示）；突触蛋白缺失突触中含有或缺乏兔亲素的差异具有统计学意义(P（P）<0.01).
讨论
Rabphilin是一种丰富的、进化上保守的蛋白质，作为GTP的功能与Rab3相互作用(白桦等, 1993;锂等, 1994)，结合Ca2+直接通过其C2域(乌巴赫等, 1999)在胞吐过程中与Rab3一起开启和关闭突触小泡(格佩特等, 1994;斯塔尔等, 1996). 小鼠中兔亲和素的缺失(施吕特等, 1999)或秀丽线虫(斯汤顿等2001年)虽然在秀丽线虫(斯汤顿等2001年). 在本研究中，我们描述了亲兔素在调节神经递质释放方面的生理功能，并对该功能提供了可能的机制解释。我们的研究报告了三个主要发现：（1）体外、C2Raphilin的B结构域在Ca中与SNARE蛋白SNAP-25结合2+-由“底部”Ca介导的独立相互作用2+-C的独立曲面2B域。（2） 兔亲素的缺失导致突触从使用依赖性突触抑制中恢复的速度急剧增加。（3） 兔亲素的缺失也增强了缺乏SNARE蛋白突触素的突触的释放；在这些突触中，有少量残余钙2+-触发释放仍然是rabphilin额外缺失后增加的2倍以上。除了为亲兔素在调节神经递质释放方面的功能提供生理学证据外，这些发现还为我们思考C的作用机制提供了以下暗示2SNARE蛋白催化膜融合的结构域和控制。
兔亲素与SNAP-25的相互作用
我们观察到兔红素C的化学计量相互作用2SNARE蛋白SNAP-25的B结构域(,和). 我们的数据扩展了本文提交期间发表的GST下拉研究(筑波和福田，2005年)通过免疫沉淀证明内源性拉菲菌素和SNAP-25相互作用，并通过核磁共振波谱鉴定拉菲菌C的“底部”表面2B域作为绑定站点。三条证据支持了兔亲素/SNAP-25复合物的有效性：（1）用固定化GST融合蛋白拖拽大鼠脑蛋白，结果表明SNAP-25捕获兔亲素，而兔亲素捕获SNAP-25(). 没有其他SNARE蛋白结合的兔病毒。（2） 用多种抗体从大鼠脑匀浆中免疫沉淀出兔亲和素/SNAP-25复合物，证明内源性蛋白质相互作用(). （3） 核磁共振实验表明，C2带有SNAP-25的兔亲和素B结构域是化学计量的()，涉及拉菲林中的一个确定序列().
SNAP-25与Raphilin C底部保守的α-螺旋的选择性相互作用2B结构域代表已知的第一个由钙介导的蛋白质相互作用2+-C的独立曲面2结构域，并为C底部发现的独特α-螺旋提供第一个结合活性2B域。这一发现表明了C2域可以同时执行多个Ca2+-依赖性和钙2+-通过结构域的顶环和底环上的结合位点进行独立的结合反应。SNAP-25与兔亲素的相互作用表明，将高浓度兔亲素或兔亲素片段引入牛嗜铬细胞、PC12细胞或鱿鱼突触中可导致胞吐变化(钟等, 1995,1998;烧伤等, 1998;筑波和福田，2005年). 在这些实验中大量过量的Raphilin干扰正常SNARE功能似乎超出了Raphilin的生理作用，正如在显性阴性干扰实验中经常观察到的那样，解释了为什么这些实验导致表型与生理性KO表型不相似。
兔亲素缺乏突触的表型
我们重新分析了培养神经元中的rabphilin KO表型，并证实了之前通过切片生理学获得的结果，即标准突触参数不会因rabphimin的缺失而受损(施吕特等, 1999). 在观察到的兔亲蛋白/SNAP-25相互作用的指导下，我们测试了高频刺激耗尽RRP后，兔亲蛋白的缺失是否会改变突触反应的恢复。我们发现，在没有拉菲蛋白的情况下，突触反应的恢复速度要快得多。曲线拟合揭示了这些实验中突触反应的两个恢复阶段；rabphilin的缺失并没有改变这些相的动力学，但产生了从慢相到快相的大位移（～3倍）。兔亲蛋白缺失的影响通过全长兔亲蛋白的急性病毒表达得以挽救，表明该表型并非由于发育异常或稳态代偿反应所致。C末端截短的兔流感病毒缺乏C蛋白，无法进行救援2B结构域，与拉菲蛋白的作用可能至少部分取决于C的相互作用的概念一致2具有SNAP-25的B域。
对这些实验的一种解释是，囊泡通过两个单独的反应恢复到RRP中，拉菲林通常将囊泡从较快的反应引导到较慢的反应。这一前提与我们的发现一致，即兔亲素与SNAP-25/突触蛋白异二聚体结合，但不是完全组装的SNARE复合物，因此可能至少暂时干扰同源SNARE相互作用(和补充图1). 自然放电训练期间神经传递的效率和频率依赖性取决于抑郁和恢复的动力学(Zucker和Regehr，2002年). 兔亲素抑制功能的一个可能网络作用可能是防止活动爆发后的反弹超兴奋性；也就是说，rabphilin可以在不改变抑郁症频率依赖性的情况下调节恢复动力学。例如，当突触处于压抑状态时，一个单一动作电位跟随一个沉默期可能会导致完全兴奋，从而导致网络失衡。自然，如果这种功能本身可以被调节，兔夫蛋白在控制这种兴奋性方面的作用将是最强大的。未来的实验将必须测试是否会发生这种对兔亲和素的调节，例如通过钙2+-绑定到其C2结构域或磷酸化。
突触素缺乏突触的融合机制
在突触处，SNARE蛋白synaptobrevin/VAMP、syntaxin 1和SNAP-25形成调节神经递质释放的核心融合机制(扬等, 2003). 因此，令人惊讶的是，突触短肽的缺失(肖克等2001年)或SNAP-25(Washbourne公司等, 2002)没有废除释放。具体地说，在突触素缺乏的神经元中，高渗蔗糖和动作电位仍分别引发约10和约2–3%的野生型释放(肖克等2001年)高频刺激促进释放(德拉克等, 2004). 此外，尽管用FM-dyes标记的回收泡囊池的大小为单轮K+-synaptobrevin缺乏的突触去极化比野生型突触小，野生型突触体是指通过重复的K轮标记FM-dyes的池的总大小+-突触短肽缺陷型和野生型突触的去极化是相同的(德拉克等, 2004). 因此，synaptobevin缺陷突触包含与野生型突触相同数量的融合活性囊泡，但启动的融合活性小泡的比例减少了10倍左右，突变突触中启动的小泡的较小子集比野生型突触中的小泡受到Ca的反应而胞吐2+.
我们现在发现，删除raphilin会大大增强残留的Ca2+-突触素缺乏突触中的触发释放，但不增加蔗糖诱导的释放。观察到的效果并不小：释放量增加了2倍以上()高频刺激训练期间的突触易化转化为抑郁(). 因此，我们的研究结果表明，在突触素缺乏的突触中，兔亲素通常抑制Ca2+-囊泡触发；通过累积残余钙来逆转这种抑制2+在重复刺激期间，至少可以部分解释在重复刺激过程中观察到突触素缺乏的突触中促进释放的现象(德拉克等, 2004). 总体效果与拉菲林的缺失加速了使用依赖性抑郁症的恢复相一致()，因为使用依赖性抑制后或突触素缺失后的突触都缺乏由组装的SNARE复合体产生的RRP。这也解释了为什么在标准兔亲蛋白KO小鼠中，兔亲蛋白的缺失不会导致释放增加。最后，我们的观察结果的一个重要暗示是，突触素缺乏突触中的残余释放可能涉及SNAP-25，这与SNARE蛋白质相互作用的混杂性质一致。
与上述关于诱发神经传递的观察结果相反，删除兔亲素进一步降低了突触素缺乏突触的自发融合率。最近的研究发现，自发融合事件部分来源于一组不同的囊泡(萨拉人等, 2005)可能有助于调和这些矛盾的结果。例如，如果这两组囊泡由于一组有限的释放位点而通常竞争融合，那么拉比灵对诱发融合的抑制作用的解除可能会带来竞争优势，并降低自发融合的倾向。这种情况与兔亲本KO的正常自发融合率一致，在这种情况下，突触诱发融合已经具有显著优势。
总之，我们认为rabphilin在对接和启动的囊泡中与SNAP-25在生理上相互作用，这种相互作用可能抑制剩余的Ca2+-突触素缺乏突触中的触发释放。这些发现与Raphilin与SNARE蛋白在秀丽线虫(斯汤顿等2001年)以及海兔中SNARE蛋白与Rab3的功能相互作用(约翰内斯等, 1996). 这意味着与rab3 KO表型一致(施吕特等, 2004)，rab3/rabphilin复合物通常微调含有部分或完全组装SNARE复合物的启动囊泡向Ca的过渡2+-反应性小泡。对这一过渡步骤的调节可能是导致短期突触可塑性的一个设定点，而Raphilin可能在突触活动增加期间参与这一调节。我们的数据表明了一种可能解释这些观察结果的机制，并为兔亲素作为SNARE复合物调节器的生理功能提供了分子证据。
材料和方法
小鼠繁殖和海马培养
Synaptobrevin 2/rabphilin双KO小鼠是从synaptobervin KO杂合小鼠的定时交配中获得的(肖克等2001年)和兔亲本KO的纯合子(施吕特等, 1999)而synaptobevin 2和raphilin单KO小鼠则是通过标准杂合交配产生的。如前所述，在涂有Matrigel的12 mm盖玻片（～3个盖玻片/海马）上制备海马神经元的高密度培养物(肖克等2001年)，并在12-24天使用在体外.
电生理学
使用Axopatch 200B放大器和Clampex 8.0软件（Axon Instruments），通过全细胞补丁灯记录监测锥体细胞的突触反应。记录在2kHz下过滤，并在200μs下采样。吸管内溶液（单位：mM）：115 Cs-MeSO三，10 CsCl，5 NaCl，0.1 CaCl2、10个HEPES、4个Cs-BAPTA、20个TEA-Cl、4个Mg-ATP、0.3 mM Na2-三磷酸鸟苷和10利多卡因N个-溴化乙基，pH 7.35（300 mOsm）。通过向Tyrode溶液中添加500 mM蔗糖制备的高渗溶液应用于近端树突。通过将平行铂电极浸入灌注室中，以1ms的24 mA脉冲实现现场刺激。
质粒构建与蛋白质表达
在未标记或均匀的谷胱甘肽琼脂糖上纯化重组GST融合蛋白15N标记（重组C2兔毒蛋白B结构域；残留物524–684；乌巴赫等, 1999). 蛋白质用作固定在谷胱甘肽琼脂糖上的亲和矩阵，或用凝血酶从GST部分裂解并通过尺寸排除色谱纯化。请参阅补充资料获取所用质粒的完整列表。
核磁共振波谱用15描述的N标记蛋白质(乌巴赫等, 1999).
