SUMO公司(秒购物中心u个类铋瞬间difier）是泛素相关蛋白家族中一个不断增长的成员，已知与RanGAP1、PML、IκBα、p53、酵母隔膜组分和其他蛋白质结合(小时天 等。1999;小时奥克斯特拉瑟2000;J型entsch公司和P狼疮2000;M（M）乌勒 等。2001;W公司艾斯曼2001). 高等真核生物的细胞有三个SUMO同系物：SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3(J型奥森森2004). 在芽殖酵母中，唯一的SUMO编码基因SMT3型对细胞存活至关重要(M（M）艾鲁和K奥什兰1995). 普通E1和E2酶需要结合所有SUMO变体。E1酶Uba2p/Aos1p酿酒酵母哺乳动物中的SAE1/SAE2在SUMO的C末端甘氨酸和SAE2/Uba2p之间形成一个短暂的硫酯键(D类欧姆 等。1995;D类埃斯特罗 等。1997;J型奥森森 等。1997). 然后将SUMO转移到E2结合酶Ubc9p(J型奥亨森和B洛贝尔1997;S公司奇瓦兹 等。1998).
SUMO E3蛋白被鉴定为Ubc9p识别底物所需的辅因子(小时奥克斯特拉瑟2001;J型阿克森2001). 这个酿酒酵母Siz1p/Ull1p公司(S公司特伦尼科夫 等。2001;T型阿卡哈西 等。2001年a)，已被证明是七肽酰化的E3因子特异性(J型奥森森和G上止点2001;T型高桥 等。2001年a,b条). 在哺乳动物细胞中发现了几种额外类型的E3因子(P（P）伊克勒 等。2002;K（K）年龄大的 等。2003)，但其对应项不在酿酒酵母.缺乏E3的酵母细胞(尺寸1/尺寸2双缺失突变体）失去大部分可检测到的Smt3p结合，但仍保持野生型增长率(J型奥森森和G上止点2001;T型阿卡哈西 等。2003)在2μ质粒因E3依赖性对其分配因子的过度修饰而丢失后(C类母鸡 等。2005). SUMO共轭体的大量丢失尺寸1/尺寸2双突变体只导致微不足道的表型变化，这突显了识别生理上重要的Smt3p底物和揭示Smt3p对细胞生存能力的重要作用的技术难度。作为SMT3型是一种基本基因，人们普遍认为，在缺少Siz1p和Siz2p的情况下，一些蛋白靶点被修饰，使细胞得以存活。这种修饰也可以通过E2酶本身的结合活性进行(O（运行）库马 等。1999)或可由一些狭义的SUMO E3因子催化，例如最近表征的Mms21p(Z轴浩和B洛贝尔2005).
SUMO修饰的众多生物学作用取决于靶蛋白的功能(M（M）乌勒 等。2001;J型奥森森2004;U型爱尔兰2004). Smt3p在酵母细胞中的定位模式表明，结合蛋白存在于细胞核（许多靶点）和芽颈（隔膜）中(J型奥森森和B洛贝尔1999;T型阿卡哈西 等。1999). Smt3p的核定位及SUMO结合途径在染色体传递保真度中的作用(B类iggins公司 等。2001;A类祖马 等。2003)提示SUMO修饰的关键靶点可能是核蛋白。事实上，最近发现Smt3p底物体内使用蛋白质组学方法(P（P）安塞 等。2004;W公司奥尔施勒格尔 等。2004;Z轴侯 等。2004;小时安妮（annich） 等。2005)已经证明许多必需的核蛋白被SUMO修饰。
酶突变将SUMO从结合靶点上移除，导致生存能力严重丧失(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2000;S公司特伦尼科夫 等。2001)证明了Smt3p从靶上的去除与共轭一样重要。萌芽酵母有两种特殊的SUMO异肽酶：核内，Smt4p（Ulp2p）(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2000;S公司特伦尼科夫 等。2001)和核外，Ulp1p(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2003). 这两种酶在细胞中明显严格划分，因为Ulp1p定位错误导致严重的表型(P（P）安塞 等。2003). 而Ulp1p是一种必需酶(L（左）我和H奥克斯特拉瑟1999)，承载了大量Smt3p处理(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2003)，的表面贴装4突变体能够生存(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2000;S公司特伦尼科夫 等。2001)，但可能只是因为微量的Ulp1p活性到达细胞核(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2003). 描述SMT4型该基因揭示了许多受Smt3p结合控制的途径：SMT4型是编码染色体蛋白质基因突变的剂量抑制剂MIF2型,SMC2公司,PDS5系列(M（M）艾鲁和K奥什兰1995;S公司特伦尼科夫 等。2001;S公司特德 等。2003)、和表面贴装4DNA复制阻滞导致突变综合致死(B类阿坎特 等。2002). 严重的细胞缺陷表面贴装4突变体可归因于许多Smp3p靶点的过度聚合。因此，目前SUMO修改的负面影响(S公司特伦尼科夫 等。2001;B类阿坎特 等。2002;C类母鸡 等。2005)已被记录的程度远远超过其积极的监管作用。
之前，我们描述了SIZ1型和SIZ2公司基因(S公司特伦尼科夫 等。2001)显示编码酵母中主要的SUMO E3活性(J型奥亨森和G上止点2001). 作为双精度尺寸1/尺寸2缺失导致约99%的SUMO共轭物被消除(J型奥森森和G上止点2001)许多染色体蛋白质在Siz中被聚合+单元格(Z轴侯 等。2004;小时安尼奇 等。2005)，我们开始有兴趣评估这两个基因在染色体分离中可能发挥的潜在作用。通过对一些潜在基板的分析，我们发现Top2p改性由Siz1p和Siz2p控制。而之前对Top2p的研究酿酒酵母(B类阿坎特 等。2002)发现Top2p过速聚合导致动粒附近早熟姐妹染色单体分离，其机制尚不明确(B类阿坎特 等。2002)Top2p sumoylation在野生型细胞中的作用尚不清楚。在高等真核生物和野生型酵母细胞中，只有极少数拓扑异构酶II被酰化(B类阿坎特 等。2002;A类祖马 等。2003)这使得对该池的任何直接分析都相当具有挑战性。然而，使用以下组合尺寸1,尺寸2、和前2名突变体我们表明，SUMO E3机制特别促进Top2p–Smt3p结合，并证明Top2p sumoylation和Siz1p/Siz2p活性在遗传信息传递中具有先前未经证实的积极调节作用。我们证明SUMO E3在小染色体分离中的关键作用可能局限于Top2p的COOH末端尾部的Smt3p修饰。
材料和方法
微生物学和遗传学方法：
大肠杆菌菌株Top10和BL21（DE3）分别用于质粒繁殖和重组蛋白生产。酵母培养基和遗传技术按照描述进行(克奥特里和F墨水1991). 这个酿酒酵母菌株具有S288C和W303背景(). 对于所有遗传测试，使用了一组等基因菌株，并对S288C和W303重复了实验。微小染色体稳定性，即，在选择性条件下，对含有微小染色体的人群中的细胞比例进行了分析(S公司特伦尼科夫 等。1993). 简言之，携带YCplac111菌株的指数培养(欧洲标准化委员会4,LEU2级)、YCplac33(CEN4、URA3) (克伊茨和S乌吉诺1988)，pPRS425（2μ复制源，LEU2级)，pRS415(CEN6、LEU2) (S公司伊科尔斯基和H一封信1989)，pAS255(场景3-BCT1型,ARS1 TRP1 URA3)或pIA1(URA3公司，2μ）（P.H一封信，个人通信）质粒和携带不同组合的尺寸1/尺寸2和/或前2名突变分别在缺乏尿嘧啶或亮氨酸的最小培养基中生长。将培养液等分样品置于四个YPD板上。通过在缺乏尿嘧啶或亮氨酸的合成培养基上进行复制电镀，分析产生的菌落是否存在微小染色体。条件双中心微小染色体pAS72的传递效率（稳定性）(LEU2 URA3 ARS CEN6 pGAL:CEN3，美国特伦尼科夫（未公布的数据）以类似的方式进行测定，但对数期培养物首先在含有2%棉子糖、1%半乳糖（v/v）作为碳源的选择性培养基中30°下生长，然后在YPD中培养4小时，然后进行电镀。
表1
| 应变 | 相关基因型 | 来源 |
|---|
| BY4733公司 | 材料一他的3个leu2遇到了15个trp1 ura3 | 美国标准菌库 |
| 4bAS399标准 | 材料一his3 leu2 lys2 met15 ura3 siz1白细胞数-Δ©kanMX siz2-Δ●kanMX | 这项工作 |
| 12cAS399标准 | 材料α他的3 leu2 lys2 ura3尺寸-Δ©kanMX siz2-Δ●kanMX | 这项工作 |
| 924–YPH499 | 材料一ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 HF:SMT3Şleu2 | 这项工作 |
| 924–4bAS399 | 材料一他的3个leu2 lys2遇到了15个ura3 size1–Δ■kanMX siz2-HF:SMT3｜LEU2 | 这项工作 |
| W303–1A型 | 材料一ade2 ura3 trp1 leu2 his3 can1 | R.罗斯坦 |
| YPH499型 | 材料一ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 | P.希特 |
| YPH499bp1型 | 材料一ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 bar1-Δpep4｜HIS3 SMC4:6His:3HA｜URA3 | 这项工作 |
| BY4733桶5 | 材料一他的3个leu2遇到了15 trp1 ura3 pep4｜his3 bar1-Δ■LEU2 PDS5:6His:3HA｜URA3 | 这项工作 |
| EY0987（眼睛0987）/SPC42型：mRFP | 材料α他的3-Δ1列2-Δ0赖氨酸2-Δ0乌拉3-Δ0 SPC42:mRFP kanMX | E.奥谢 |
染色体III丢失率测定是基于二倍体菌株与二者交配的能力材料α和材料一如果染色体分离受到损害，测试者将进行菌株分离。两者的杂合性缺失材料一/材料α和leu2/leu2基因座被认为是一种染色体丢失事件。分析的详细信息如下所述(克犯错 等。1990).
DNA结构：
这个SIZ1型通过扩增半乳糖控制的启动子和来自pFA6a–His3MX6–pGAL1–3HA的标记，构建了过表达结构(L（左）长汀 等。1998)特异性引物融合SIZ1型ORF至pGAL。PCR产物直接用于酵母转化，以替换SIZ1型发起人。
取代SMT3型多组氨酸和FLAG标记基因SMT3型（高频-SMT3型)在pHF-SMT3质粒的基础上构建由天然启动子表达的(J型奥森森 等。1997). 这个LEU2级标记已插入唯一Mlu公司我的网站位于SMT3型启动子和由此产生的载体pAS924被用于转化酵母Nco公司我和Bgl公司二、。这个表面贴装4,尺寸1、和尺寸2删除与报告一致(T型阿卡哈西 等。2000,2001亿).
生成标记和突变的排名前2替换载体的基因组拷贝排名前2通过PCR（引物：GCAACTGCAGTACCTAACTACGGTGCTTTCGG和GCGCGTCGACATCCTTTCATTGAAAC）扩增基因，并将PCR产物克隆到pTS901IU（5xHA URA3）的PstI-SalI限制位点(S公司旭化成 等。2000)生产pYT1033(URA3顶部2:HA). 这个前2名：HA（ΔC）载体pYT1035的构建类似，但使用截断引物（GCGCGTCGACAATTTTTGCCCTTTAGCA）。ΔC等位基因被指定为前2名–Δ200. The前2名3xKR三突变等位基因(前2名–201名)通过基于PCR-的定点突变（引物对：CAAAAAATTAGGTTAGAGGAA/TTATCCTCTAACCTATATTTTTG、CTACAAGAAAGAGAAAAC/GTTTTTCTTCTAATCTTTTTATATATAGAGAAC、TTTCTCTAGAGAGAGATAAC/GTTTTCTCT）获得编码K1220R、K1246R、K1277R替换突变的基因，并将PCR产物克隆到pTS901IU中，产生pYT1034(URA3前2名：HA3xKR）。质粒pML251(前2-SNM:HA｜KanMX)用于替换排名前2基因(B类阿坎特 等。2002)标记更改为URA3公司给pYT1032(URA3 top2-SNM:HA). 用于不同版本的排名前2pYT1026、pYT11027和pYT10208分别与pYT1033、pYT1034和pYT2032相似，只是它们与GFP编码序列和LEU2级标记。这个排名前2:SMT3:HA融合质粒pYT1051(和)通过插入SMT3型框架中的基因Spe公司我的网站在pYT1033。这个排名前2:SMT3:GFP融合质粒pYT1101()通过插入SMT3型框架中的基因Spe公司我的网站在pYT1026。
Top2p以SUMO E3依赖的方式被修饰。（A） 染色质结合的Top2p是一种sumoylation底物在体外。所有假定目标都有HA-标记。将1μl从酵母细胞BY4733/pYT1033（Top2）、BY4733 bp5（Pds5）、YPH499 bp1（Smc4）、YPH 499 bp2（Smc2）、YPHz 499 bp6（Brn1）、BY 4733 bp4（Ycs4）和YPH499bp5（Ycs5）纯化的染色质与反应混合物在37°下培养120分钟（incub.+），并用抗HA抗体进行免疫印迹。将冰上保存的相同反应混合物（incub.−）用作阴性对照。（B） 净化Top2p由Smt3p修改在体外.共4.4μg纯化Top2p(V（V）奥恩 等。2005)受到苏美化在体外（包括+）或留在冰上（包括−）（参见材料 和 方法)在37°下放置60分钟。用抗Top2p抗体进行免疫印迹。（C） Smt3p修饰的Top2p仍然与染色质密切相关。Top2p在染色质上下文中被修饰在体外如中所述材料 和 方法模拟反应（Smt3−）是在没有重组Smt3p的情况下进行的。IN，萃取前反应。用EBX或EBX+0.5在4°下对sumoylation反应后的Top2p进行萃取30分钟米NaCl缓冲液。通过离心分离染色质（P）和可溶性组分（S），并通过Western blotting进行分析。Top2p–Smt3p缀合物用星号标记。（D） Top2p由Smt3p修改在体外共有5μl来自BY4733/pYT1033（Top2）或BY4733/pYT1051（Top2-Smt3）的染色质与在体外磺酰化反应混合物（参见材料 和 方法)37°放置60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。sumoylation引起的特征迁移率偏移对应于Smt3p融合产生的偏移。Top2p–Smt3p缀合物用星号标记。（E） Top2p的COOH末端一致性sumoylation位点是Smt3p结合的主要靶点在体外将含有5μl染色质的反应混合物（从酵母细胞BY4733/pYT1033（Top2）和BY4733/pYT1022（Top2-SNM）中纯化）在37°下培养60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。（F） Top2p–Smt3p共轭在体外受SUMO E3刺激。来自4bAS399/pYT1033（Siz−)与在体外磺酰化反应混合物（参见材料 和 方法)37°放置60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。使用以下蛋白质和辅因子的组合：E1，4.5μg Uba2p，5.2μg Aos1p；E2，0.75μg Ubc9p；E3，4.5μg Siz1pΔ440; ATP（10 mM）和2.9μg的6xHis–Smt3p。未修改的Top2p带用“u”表示。Top2p–Smt3p共轭物用星号表示。只有在Smt3p存在的情况下，Top2p才能形成多种修饰形式。
组成性sumoylation导致Top2p的近着丝粒靶向。（A） 之间的合成相互作用表面贴装4-Δ和排名前三：SMT3融合。相同浓度（106将三种菌株的培养物以10倍的连续稀释液涂布在YPD平板上，并在30°（允许表面贴装4-Δ）和37°（不允许表面贴装4-Δ）48小时的温度。集成排名前2变体产生Top2p–HA融合。SMT4顶部2：具有野生类型的W303SMT4型pYT1033基因转化。smt4顶部2和smt4顶部2:SMT3型W303带有表面贴装4缺失，分别用pYT1033或pYT1051转化。作为表面贴装4-Δ导致大量死亡，即使在允许的温度下，与Smt4相比，起始稀释液具有不同数量的生长菌落+（B）用于Top2p结合的ChIP分析的PCR探针布局欧洲标准化委员会4区域。（C） Smt3p融合到Top2p尾部导致Top2p在欧洲标准化委员会4端粒周围区域。pYT1033转化W303菌株(排名前2：HA），pYT1051(排名前2:SMT3型：HA）或pYT1035(排名前2-ΔC:HA），全部替代野生型排名前2使用B中所示的PCR探针对基因进行ChIP分析。ChIP分析如下所述(S公司特伦尼科夫 等。2001;W公司英国 等。2004). （D–F）Smt3p融合改变了Top2p–GFP在细胞核中的定位。Spc42p-mRFP用于标记表达野生型Top2p和相应Top2p–GFP融合的二倍体菌株中的SPB：排名前2:SMT3型：GFP（D和E显示最大分辨率）和排名前2-ΔC:GFP（E）。将20个间距为0.2-μm的光学Z截面组合成图像（2×2分格，每帧曝光1秒，E除外：无分格，每帧曝光3秒）。箭头指向有丝分裂细胞中聚集的Top2p–Smt3p–GFP染色。
双心室微小染色体pAS72由pRS415构建(欧洲标准化委员会6,LEU2级)通过插入pGAL：欧洲标准化委员会3和URA3公司进入聚链接体区域。由此产生的微小染色体在含葡萄糖的培养基中表现为双中心，在半乳糖培养基中功能为单中心。
生物化学方法：
制备所有染色质组分，并通过微球菌核酸酶消化进行验证，如下所述L（左）iang公司和S蒂尔曼(1997)为了制备酵母裂解物和免疫印迹分析，收集、清洗细胞，将其重新悬浮在2%SDS中，并使用TOMY摇床用玻璃珠打碎。将得到的裂解物煮沸，补充LDS负载缓冲液（Invitrogen），并分离到4-12%Bis–Tris或3-8%Tris–醋酸盐NUPAGE梯度凝胶（Invitrogen）上。蛋白质印迹后，用ECL（Amersham Pharmacia）观察到特定蛋白反应带。
SUMO结合分析按以下所述进行T型阿卡哈西 等。(2003)简言之，结合反应的组分：6xHis–Smt3p、GST–Uba2p、GST-Aos1p、Ubc9p和Siz1p–Δ440蛋白质从大肠杆菌然后用于含有底物的反应混合物中。大多数情况下染色质为~5μl(L（左）iang公司和S蒂尔曼1997)由带有HA标记目标蛋白的菌株制备而成。反应混合物（20μl）在10 m的存在下培养米在37°（或冰上，作为对照）下放置ATP 1或2小时。每次实验中使用Top2p–HA染色质，其他蛋白质作为阳性对照。Top2p修饰反应在2小时后达到饱和。煮沸5μl的反应等分样品并进行免疫印迹。未标记的Top2p如前所述，在J.L.Nitiss的实验室中纯化(V（V）奥恩 等。2005). 使用特异性Top2p抗体（TopoGEN）在Western blots上检测到。
为了净化体内IMAC（一种50毫升酵母细胞培养物，带有基因组拷贝HF）的Smt3p结合蛋白-SMT3型收集后，在500μl裂解缓冲液（0.1）中用玻璃珠（10分钟）破坏细胞米Tris pH 8.0，6米氯化胍，0.5n个NaCl），通过20000×离心澄清提取物克在室温下，将澄清的蛋白质提取物与含镍NTA树脂（QIAGEN）在分批模式下培养6小时。然后将树脂装入2ml生物活性剂一次性柱中，将提取物再次通过开放柱。柱清洗一次，10个柱的体积为0.1米Tris pH值7，6米氯化胍，0.5米NaCl，一次0.1米Tris pH值6，6米尿素，0.5米氯化钠。然后用剥离缓冲液（20 m）洗脱结合蛋白米Tris pH值7，40 m米EDTA，2%十二烷基硫酸钠）。用水将流通部分稀释10倍，用10%TCA沉淀蛋白质。
显微镜检查：
为了产生表达GFP标记的Top2p的菌株，用Spe公司我或平均二/Bln公司并转化为W303-1A、YPH499bp和BY4733菌株。转化细胞在23°的选择性培养基中以低密度生长，在0.5%PBS中洗涤，并使用带有冷却CCD相机和Z轴扫描功能的蔡司AxioVert荧光显微镜通过荧光显微镜进行分析。Top2p–GFP和Spc42p–mRFP融合的共表达通过交叉材料一表达Top2p与EY0987融合的菌株/第42页：mRFP(小时休斯敦大学 等。2003).
结果
Smt3p E3是微小染色体传输保真度所必需的：
我们之前获得的证据表明SIZ1型和SIZ2公司染色体代谢中的基因(S公司特伦尼科夫 等。2001). 此外，染色质蛋白被证明构成酵母中所有SUMO靶点的重要部分(W公司奥尔施勒格尔 等。2004;Z轴侯 等。2004;小时安妮（annich） 等。2005)和Siz1p/Siz2p负责酵母中的大部分sumoylation(J型奥森森和G上止点2001;T型阿卡哈西 等。2001亿)，分析染色质中Siz1p/Siz2p的功能可能揭示SUMO促进有丝分裂中染色体分离的机制(B类iggins公司 等。2001). 虽然Siz1p是一种SUMO E3，但之前发现它对隔膜的sumoylation很重要(J型奥森森和G上止点2001;T型阿卡哈西 等。2001年a,2001亿)，septin修饰的生理重要性被发现微不足道(J型奥森森和B洛贝尔1999). 最近报道了Siz1p和Siz2p作为SUMO E3在抑制2μ质粒扩增中的作用(C类母鸡 等。2005)但它们在染色体分离中的作用尚未明确。
为了研究Siz1p和Siz2p是否可能在芽殖酵母的染色体周期中发挥作用，我们首先使用染色质分馏分析了Siz1p和Siz2 p的细胞内定位。分离后发现Siz1p和Siz2p在染色质中富集(L（左）iang公司和S蒂尔曼1997)（未显示数据）。因此，染色质蛋白可能是Siz1p和Siz2p E3活性的主要靶点。因此，我们评估了Siz的染色体传输保真度−(尺寸1-Δ尺寸2-Δ）电池。在两个材料一/材料α和LEU2/LEU2级第三染色体的位点，我们确定了第三染色体在Siz−二倍体菌株与Siz无法区分+二倍体菌株（数据未显示）。我们也没有发现含有rDNA易位的染色体III的任何不稳定(F类雷曼 等。2000)以Siz为单位−二倍体。同时，我们检测到细胞内圆形着丝粒质粒（小染色体）的显著不稳定尺寸1-Δ尺寸2-Δ细胞：Siz−与Siz相比，菌株的微染色体传输保真度降低了30%+单元格(). 为了确定这种微小染色体丢失是由于错位还是复制受损所致，我们评估了两种Siz中非中心质粒的稳定性+和Siz−菌株。Siz家族−菌株在无着丝粒ARS质粒的稳定性方面没有差异(). 而含有2μ质粒来源的质粒在Siz中极不稳定−细胞，这是由于缺乏内源性2μ质粒（数据未显示），该质粒在尺寸1-Δ尺寸2-因放松管制而产生的Δ细胞FLP公司基因(C类母鸡 等。2005). 当一个全长Flp−使用2μ质粒，其在Siz中的稳定性没有差异+和Siz−菌株(). 因此，Siz中的微小染色体不稳定−很可能是由于分类错误。事实上，E3活性的丧失（以及随后SUMO结合的大量丧失）对微小染色体的分离有负面影响，这表明SUMO E3在染色体传递保真度方面具有先前未知的积极作用。与之前报道的过氨酰化在染色体分离中的负面作用相比，这种正调控途径具有更大的生理相关性(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2000;B类iggins公司 等。2001;S公司特伦尼科夫 等。2001;B类阿坎特 等。2002).
SUMO E3突变体的微染色体维持表型。（A） 尺寸−突变体破坏了小染色体的有丝分裂传递。在Siz中测定了YCplac111的稳定性+（BY4733）和Siz−（4bAS399）30°下的菌株，如材料 和 方法（B）Siz公司−突变体不会破坏无着丝粒质粒的有丝分裂传递。pAS255（复制型）、pRS426（2μORI）和pIA1（Flp）的稳定性−Siz中的2μ）质粒+（BY4733）和Siz−（4bAS399）菌株在30°下测定，如材料 和 方法.
Smt3p对Top2p的修饰受到E3的促进体内和在体外:
中的数据可以解释为E3活性是染色质蛋白Smt3p修饰所必需的，在姐妹染色单体的准确分离中起作用。因此，我们测试了一个假定的Smt3p靶点样本，包括Pol30p和所有标记的凝集素亚基(K（K）阿根斯基 等。2004)和condensin(F类雷曼 等。2000)在中在体外由重组Smt3p、E1、E2和E3酶组成的sumoyalization系统(T型阿卡哈西 等。2003). 此外，Top2p的过度sumoylation先前被证明对着丝粒周围的内聚力有负面影响(B类阿坎特 等。2002)，促使我们将Top2p作为负责Siz的SUMO E3活动的潜在目标进行分析−偏析缺陷(). 在反应混合物中存在Siz1p或Siz2p的情况下，我们测试的大多数蛋白质在与染色质结合时没有表现出Smt3p修饰的倾向，但Top2p除外(和数据未显示）。容易检测到染色质结合Top2p的Smt3p修饰()提示Top2p可能是E3在染色质中作用的潜在介质。
使用在体外SUMO修饰体系使我们能够绕过Top2p–Smt3p共轭物丰度低的问题体内(B类阿坎特 等。2002). 而可溶性Top2蛋白也被证明是一种有效的SUMO底物在体外()Top2p的Smt3p修饰并没有改变Top2p对染色质的亲和力()根据耐盐性不变判断。因此，我们通常使用含有Top2p的染色质作为底物，使在体外sumoylation体系的一个更好的近似体内情况。两个实验证实了修饰的Top2p带与Smt3p共轭物的一致性。首先，我们表明Top2p与Smt3p直接融合产生相同的电泳偏移(). 第二，“相扑不再变异”前2-SNM(B类阿坎特 等。2002)在Top2p尾部缺乏一致的sumoylation位点，在长时间孵育后，Smt3p只显示出轻微的修饰在体外().
染色质相关Top2p，即使从尺寸1-Δ尺寸2-发现即使在没有E3的情况下，Δ细胞也在一定程度上被Smt3p修饰(). 然而，向系统中添加重组Siz1p（或Siz2p，数据未显示）允许以依赖于ATP的方式将几乎所有Top2p转化为Smt3p修饰形式(). 众所周知，SUMO E2 Ubc9p支持有限的E3依赖性Smt3p共轭在体外(O（运行）库马 等。1999)，我们研究了E3在Top2p修饰中的作用体内。我们生成了野生型的替代品排名前2带有HA标记野生型基因的基因前2名-3xKR，以及前2名-ΔC等位基因(). 突变的等位基因排名前2对整体细胞生长或生存能力没有显著影响(). 3xKR(前2名–201名)等位基因是SUMO受体赖氨酸残基的三重取代（位点1、2和3，). 这个等位基因不同于前2名–SNM等位基因(B类阿坎特 等。2002)，其中共识位点中的所有赖氨酸残基（不仅仅是受体残基）都发生了突变，这增加了前2名–SNM等位基因不仅在Smt3p共轭干扰中有缺陷。ΔC等位基因(前2名–200名)缺少对COOH终端Top2p尾部进行编码的整个区域，如所示相应的Top2p–ΔC蛋白对sumoylation完全不起作用在体外（未显示数据）。
Top2p尾部已修改体内以SUMO E3依赖方式。（A） Top2p的COOH末端区域和共识的sumoylation位点在酵母物种中的保守性有限。这个酿酒酵母Top2p尾部区域（残基1219–1428）与白色念珠菌(重心。)以及棉蚜Ashbya gossypii(A.g.（美国）。)拓扑异构酶II和二级结构是使用JPred软件包预测的(C类乌夫和B阿顿2000). h、 α螺旋；e、 β-表。SUMO共识站点用开放框标记并编号。概述了受体赖氨酸残基。（B） 细胞生长不受标记的干扰前2名等位基因ΔC和3KR。野生型过夜培养的十倍系列稀释液(顶部2，顶部2：HA）和不同前2名在YPD平板上发现突变体，并在指定温度下培养。标记的排名前2等位基因替换菌株（W303-1A/pYT1033、W303-1A/pYT1024和W303-1A/pYT1035）经质粒转化后产生，如材料 和 方法也产生了相应的GFP标记菌株（YPH499/pYT1026、YPH499/pYT10207和YPH499%/pYT1028），并且对细胞增殖或Top2p核定位没有干扰（数据未显示）。Top2p琥珀酰化的（C和D）Western blot分析体内菌株924-YPH499的提取物（尺寸+)或924-4bAS399（Siz−)表达HF-Smt3p的生理水平并携带不同的前2名等位基因通过IMAC进行分离。FT，流量；EL，洗脱液。野生型排名前2基因和所有前2名对等位基因进行HA标记。使用抗FLAG（C）和抗HA（D）抗体通过Western blotting分析从色谱柱中洗脱的HF–Smt3p结合物。Top2p的共轭形式（仅存在于Siz+ 排名前2单元格）用星号表示。
野生型细胞中只有一小部分Top2p被酰化(B类阿坎特 等。2002)，这使得对这个池的分析非常具有挑战性。为了促进SUMO结合物的富集，我们替换了天然的SMT3型具有表达多组氨酸和FLAG标记的Smt3蛋白（HF–Smp3p）的构建体的基因，并引入双尺寸1尺寸2使用野生类型删除排名前2，带有HA标签（Siz−在里面)，或标记为HA的前2名ΔC和3xKR等位基因（Siz+）。IMAC分馏使HF–Smt3p共轭物富集，表明SIZ1型和SIZ2公司导致Top2p酰化损失的基因(). 消除单个SIZ公司该基因并没有导致Top2p sumoyalization的显著减少（数据未显示）。Top2p的E3相关SUMO修改体内仅限于COOH终端尾部()尤其是IMAC在前2顺式突变体ΔC和3xKR，该突变体复制了Siz中Top2p sumoylation的缺失−单元格(). 尽管Top2p–ΔC蛋白的丰度低于野生型Top2p或Top2p-3xKR()，按比例放大的纯化没有揭示这种截短的蛋白质的任何sumoyalization（数据未显示）。因此，Top2p由Smt3p修改体内主要位于COOH末端，Siz1p和Siz2p在催化这种修饰中起着关键但相互冗余的作用。
E3在微小染色体传播中的积极调节作用由Top2p介导：
测试E3在微小染色体分离中的作用()与Top2p功能有关，我们分析了微小染色体在前2名3xKR和ΔC突变体，并将其与SIZ1型和SIZ2公司双缺失菌株。对微小染色体稳定性的分析表明前2名突变体的分离保真度降低，这类似于尺寸1-Δ/尺寸2-Δ（Siz−)应变，应变(). 此外，我们发现Siz−和前2名突变对三突变株的微染色体稳定性具有上位性（两者结合前2名和尺寸突变），因为在这些突变中未观察到微染色体稳定性的增加性降低(). 因此，我们证明Smt3p E3在染色体稳定性中的积极调节作用是修饰拓扑异构酶II的COOH尾部的一致性sumoylation位点。
Smt3p结合缺陷top2突变和SUMO E3缺陷在控制小染色体稳定性中的上位相互作用。（A） pRS415微染色体的传递效率。测量了微小染色体的稳定性（参见材料 和 方法)野生型（BY4733）为30°尺寸1/尺寸2突变株（4bAS399）前2名变体（pYT1033、pYT103或pYT105）。（B） SUMO E3突变体和前2名Smt3p结合缺陷突变稳定双中心小染色体。pAS72是一种条件双心室微染色体，在30°下在野生型（BY4733）和尺寸1/尺寸2（4bAS399）菌株前2名如中所述的变体（pYT1033、pYT103或pYT105）材料 和 方法.
作为尺寸1-Δ/尺寸2-Δ,前2名3xKR和ΔC突变仅破坏了含有着丝粒的小染色体的稳定性(和染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明Top2p蛋白存在于酵母着丝粒中（参见)Top2p的过度sumoylation已被证明会破坏着丝粒的内聚(B类阿坎特 等。2002)，我们研究了E3依赖的Top2p sumoylation是否参与动粒功能。因此，我们测试了相同的()一组稳定维持双着丝粒小染色体的突变体。双着丝粒染色体的稳定性已被证明是检测动粒熟练度的一种可靠而敏感的遗传检测方法，因为除非动粒功能受到顺式或反式突变(M（M）伊斯特雷叶和B织布机2003). 为了消除小染色体重排作为双中心小染色体稳定的可能途径，我们使用了条件双中心小染色单体，其中一个动粒在实验前被有效的诱导转录失活。如所示，的前2名3xKR和尺寸1-Δ/尺寸2-Δ突变在稳定双中心小染色体的能力以及单中心小染色体分离表型方面具有上位性(). 因此，SUMO E3依赖性调控途径可能主要控制着位于着丝粒的Top2p池的功能，该调控途径有助于在微小染色体分离中Top2p功能的正调控。
sumoylated Top2p的染色体地址：
我们假设需要特定的Top2p sumoylation生理水平才能将其靶向着丝粒区域。然而，由于上述在细胞中定位一种特定蛋白质的一小部分酰化亚单位的困难，验证这一假设在技术上具有挑战性。为了克服这个技术问题，我们利用Top2p–Smt3p融合作为就地sumoylated Top2p模型。这种方法是基于用肽键泛素融合物替换异肽键结合泛素的生理相关的最新数据(C类伊沙诺夫和B英语-S公司阿顿2004;S公司埃及血统 等。2004). 因此，我们插入了SMT3型ORF整合排名前2构造，以便生成帧内Top2p（核心）–Smt3p–Top2（尾部）融合，并将Smt3p插入本地Top2p序列的Leu-1235和Val-1236之间（在中下划线). 这种融合将Smt3p组成性地放置在Top2p尾部的第一个和第二个sumoylation位点之间。携带HA标记和GFP标记的综合版本的单倍体菌株排名前2:SMT3型融合是可行的，Top2p–Smt3p–GFP融合定位于整个细胞核（数据未显示）。此外，Top2p–Smt3p似乎在模仿sumoylated Top2p体内，因为这样的融合导致了表面贴装4-Δ背景(). HA和GFP标记排名前2:SMT3型融合也导致了显著的有丝分裂延迟(和未显示的数据），表明Smt3p融合到细胞中所有Top2p分子可能对增殖有害。
测试Top2p–Smt3p融合是否如遗传分析预测的那样在着丝粒富集(和)对于sumoylated Top2p，我们对HA标记的Top2p–Smt3p进行了ChIP分析。将从表达Top2p–Smt3p–HA、Top2p-HA和Top2p•ΔC–HA的菌株中提取的染色质用抗HA抗体进行免疫沉淀，并按所述进行PCR分析(S公司特伦尼科夫 等。2001;W公司英国 等。2004). PCR探针的设计目的是将5.5kb的区域定位在欧洲标准化委员会4堆芯顺序(). 虽然与Top2p–ΔC–HA相比，Top2p-HA在着丝粒周围基因座上仅表现出最小的富集，但Top2p-Smt3p-HA融合在欧洲标准化委员会4附近(). 由于尚不清楚Top2p在基因组中是否有特定的富集位点，因此很难确定观察到的结合富集是否代表着严格的着丝粒周围现象，或者整个Top2p–Smt3p库是否更集中于定义的基因组位点。然而，随机选择一组基因组位点的ChIP分析（根据W公司英国 等。2005)没有发现Top2p–Smt3p的任何富集（数据未显示），这表明与未修饰形式相比，sumoylated Top2p可能在着丝粒区域富集，这与我们的遗传结果一致().
为了解决上述警告并模拟野生型情况，其中只有一小部分Top2p被酰化，我们将单倍体菌株与整合的HA标记和GFP标记杂交排名前2:SMT3型融合到野生型排名前2菌株。由此产生的菌株具有组成修饰（融合到Smt3p）Top2p和野生型Top2p，只有GFP或HA标签可以检测到融合形式。对表达SPB标记Spc42p-mRFP的菌株中Top2p–Smt3p–GFP定位的分析表明，融合虽然仍广泛定位于细胞核，但在有丝分裂细胞的纺锤体旁形成了独特的集中区(、箭头和). 修改后的Top2p池的这种定位与它在着丝粒区域周围的富集相一致。然而，当Top2p–ΔC–GFP()或野生型Top2p–GFP（未显示）融合在相似构建的二倍体菌株中进行了研究。这一结果表明，Top2p–Smt3p–GFP的近-SPB富集是由Smt3p介导的。
讨论
Siz1p/Siz2p的染色体功能：
SUMO E3蛋白似乎作为特异性因子，将sumoylation事件导向真核细胞中的特定靶点(J型奥森森2004;M（M）乌勒 等。2004). 在芽殖酵母中，Siz1和Siz2蛋白定位在细胞核中，是大部分sumoylation所必需的(J型奥森森和G上止点2001;T型阿卡哈西 等。2001亿). 然而尺寸1尺寸2双突变体是可行的，这表明大多数Smt3p结合事件对于细胞的基本内务管理功能是不必要的。在这项工作中，我们证明了SUMO E3是微小染色体传输保真度所必需的。这表明，正常染色体动力学所需的某些蛋白质可能因缺乏E3依赖性sumoylation而功能受损。尽管我们无法检测到相对较短的III号染色体或较长的含有rDNA的染色体的显著不稳定，但我们确实发现远端染色体标记的有丝分裂重组显著增加（未显示），这表明SUMO E3在染色质中的额外作用。
一项同时进行的研究证实，Siz1和Siz2蛋白通过促进两种质粒编码蛋白的抑制性sumoylation，参与抑制2μ质粒的扩增(C类母鸡 等。2005). 这说明了Smt3p在染色质中的负调控作用。本地−染色体表型（有丝分裂时不能分离姐妹染色单体）smt3–331型突变(B类iggins公司 等。2001)还表明Smt3p超共轭对染色体分离有负面影响，因为该突变显示了sumoylated蛋白（a.S特伦尼科夫，未发布数据）的方式类似于表面贴装4突变体(L（左）我和H奥克斯特拉瑟2000;S公司特伦尼科夫 等。2001)缺乏异肽酶活性。相反，我们可以在尺寸1/尺寸2作为Smt3p在芽殖酵母染色体物质分离中的积极调节作用的证明。建立SUMO E3因子是微小染色体传递保真度所必需的事实，使我们能够将Top2p确定为Smt3p靶蛋白，可能介导E3在染色体分离中的作用。
Top2p tail是一种强大的SUMO E3基板：
据报道，芽殖酵母中的几个基本染色体蛋白具有SUMO修饰体内：Top2p、Pol30p、Pds5p和Ycs4p(B类阿坎特 等。2002;小时oege公司 等。2002;S公司柚木 等。2003;D’恋情 等。2004). 然而，在大多数这些案例中，关于sumoylation的生物学作用的实验证据被证明是不确定的。最近的蛋白质组分析(P（P）安塞 等。2004;W公司奥尔施勒格尔 等。2004;Z轴侯 等。2004;小时安妮（annich） 等。2005)Smt3p目标的酿酒酵母建议修改之前报告的一些目标(例如，Pds5p和Ycs4p）无法通过这些技术检测(W公司奥尔施勒格尔 等。2004). 这与我们的数据相符在体外()表明这些蛋白质是Smt3p结合的不良底物。蛋白质组学方法表明，许多其他染色体蛋白质，包括凝集素亚基Brn1p、Smc4p和Smc2p以及一些凝集素亚基，都是Smt3p底物体内(W公司奥尔施勒格尔 等。2004). 重新测试这些蛋白质以进行修饰在体外()以及体内（未显示），使用Smt3p“指纹”技术(P（P）安塞 等。2004)，未能检测到显著的修饰，表明这些蛋白质也是不良底物。在PCNA（Pol30p）的情况下，其sumoylation的E3依赖性(小时奥吉 等。2002;小时阿拉茨卡 等。2004)已演示在体外(S公司电话和U爱尔兰2003)并由我们确认（Y.T阿卡哈西，未发表的数据），但在染色质背景下，Pol30p没有显示出修饰在体外（未显示数据）。这些数据表明，虽然许多染色体蛋白可以被SUMO修饰体内在许多情况下，这种修饰与这些蛋白质的染色质结合不相容。因此，可以假设，对许多蛋白质来说，sumoylation是染色质结合的抑制剂。
相反，我们对染色质结合的Top2p的分析表明，它是迄今为止所测试的染色体SUMO靶点中Smt3p结合最有效的受体。我们证明了Top2p可以被聚合在体外并阐明了SUMO E3在该修饰中的关键作用(和). 我们确定，Top2p-sumoylation在染色质结合形式中不受抑制，这使得该底物在其他SUMO靶点（尤其是PCNA）中具有独特性，并表明Top2p-sumoylation具有高度的功能专一性。Top2p尾部三个合意赖氨酸残基的突变在很大程度上消除了Top2p被Smt3p修饰的能力体内并大大抑制在体外改性反应(). 删除整个Top2p尾部（Top2p–ΔC）消除了残余的非特异性修饰在体外（未显示数据）。这些结果证实了这些站点在Top2p修改中的作用(B类阿坎特 等。2002)并确定Top2p尾部的修饰是由SUMO E3介导的。
Siz1p/Siz2p在微小染色体传递中的功能是修饰Top2p：
而在高等真核生物中UBC9公司染色体分离明显缺失在体外(A类祖马 等。2003)但不是体内(小时阿亚西 等。2002)，酵母细胞中SUMO E2功能的破坏损害有丝分裂染色体分离(D类埃克霍夫 等。2004). 我们确定主要SUMO E3活性的消耗(Siz1p公司和尺寸2p)也会导致体内偏析缺陷(和). 此外，我们发现在SUMO受体位点的Top2p尾部缺失和三重赖氨酸-精氨酸残基突变对与SUMO E3双突变体相似的微染色体传递具有不稳定作用和上位性。虽然之前对Top2p SUMO目标站点进行了过度修改表面贴装4突变体被证明会损害着丝粒周围的凝聚力，点突变对这些修饰位点的消除导致了几乎无法检测到的凝聚力表型(B类阿坎特 等。2002). 因此，Smt3p修饰Top2p在野生型酵母细胞中的作用仍不清楚。
结果表明，Siz1p和Siz2p活性的同时丧失与前2名SNM等位基因和未修饰的Top2p表明，SUMO E3在染色体分离中的作用可能仅限于特定Top2p亚群的Smt3p修饰。拓扑异构酶II的磺酰化酿酒酵母（数据未显示）和脊椎动物（SUMO-2）(A类祖马 等。2003)Top2p的sumoylated池在有丝分裂染色体分离中起着重要作用。由于Top2p的sumoylated水池非常小()，这一Top2p分子亚群可能参与着丝粒-动粒动力学。事实上，通过将靶点直接融合到SUMO（结构性SUMO修饰），利用一种新的建模方法，我们能够证明Top2p修饰池在着丝粒处富集(). 这个水池的确切功能仍然未知，但我们的基因数据()Top2p的过度卵黄化破坏了着丝粒周围姐妹染色单体的凝聚力(B类阿坎特 等。2002)提示Top2p在生理水平上被酰化时，参与了双极性动粒定向的建立或维持。
sumoylated Top2p在着丝粒和姐妹染色单体结合中所起的作用是什么分子机制？由于染色质结合的Top2p易于修饰在体外(). 可以想象有丝分裂激活(J型奥森森和G上止点2001;T型阿卡哈西 等。2001年a)Siz1p和/或Siz2p活性导致着丝粒区域的局部Top2p sumoylation。反过来，Top2p尾部的SUMO部分可以通过稳定将两个姐妹染色单体结合在一起的位点上的Top2p二聚体来促进凝聚力。由于Top2p尾部的sumoylation位点靠近二聚体中的DNA释放门(C类汉普（hampoux）2001)可以推测，SUMO修饰的尾部可能会延迟酶促拓扑异构酶II反应完成后DNA链的释放；因此，允许使用内聚机制替代内聚素夹。
在本报告中，我们证明了酿酒酵母SUMO E3在微小染色体传递中的作用与Top2p尾部Smt3p修饰的途径相同。虽然在形式上可能体内还有另一种Siz1p/Siz2p底物蛋白连接Siz1p/Siz2p E3活性和Top2p修饰，所有这些数据都可以通过Siz1p/Siz2p对Top2p的直接酰化来解释在体外(). 因此，可以得出结论，Siz1p和Siz2p在有丝分裂分离中发挥的重要作用体现在Smt3p-modifid Top2p的小池中，可能位于着丝粒附近。
