高迁移率族1促炎细胞因子活性的结构基础

肽合成

在犹他州立大学生物技术中心（美国犹他州洛根）合成肽并进行HPLC纯化，纯度为90%。通过鲎试验测定，合成肽制剂中未检测到内毒素。

细胞培养

小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞和小鼠成纤维细胞L929细胞（美国类型培养收藏馆，马里兰州罗克维尔，美国）在添加了10%热灭活胎牛血清（Gemini，Catabasas，CA，USA）的RPMI 1640培养基（RAW 2647cells）或DMEM（L929 cells）（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中培养，青霉素（50单位/mL）和链霉素（50μg/mL）（Life Technologies）在含有5%CO的加湿培养箱中₂和95%的室内空气。细胞在90%的汇合处使用，并在无血清Opti-MEM I培养基（Life Technologies）中进行处理。如前所述，用5 mL HEPES缓冲RPMI培养基进行腹腔灌洗，获得C3H/HeJ小鼠的硫乙醇酸合法腹腔巨噬细胞(13). 细胞在含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养，如上所述。

聚合酶链反应（PCR）

通过PCR扩增，从人脑快速克隆cDNA（Clontech，Palo Alto，CA，USA）中克隆出重组人HMGB1（651bp），使用以下引物：正向引物5′GATGGCAAAGGATCCTAAG 3′和反向引物5’GCGGCCGC公司TTATTCATCATCATCTTC 3′。一个非I站点被添加到了带下划线的反向引物中。通过PCR扩增从人脑快速克隆cDNA（Clontech）中克隆人HMGB1的截短型。引物为B盒（233bp）、5′AAG TTC AAG GAT CCC AAT GCA AAG 3′和5′GCG GCC CAA TAT GCA ATA TCC TTT TC 3′；和一个盒子（261 bp），5′GAT GGG CAA AGG AGA TCC TAA G 3′和5′TCA CTT TTT TGT CTC CCC TTT GGGG 3′。每个突变体都添加了一个终止密码子，以确保蛋白质大小的准确性。

蛋白质表达与纯化

按照制造商的说明，使用TA克隆方法将PCR产物亚克隆到pCRII-TOPO载体EcoR I位点上（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。扩增后，用EcoR I消化PCR产物，并将其亚克隆到带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的表达载体（pGEX）中（美国新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）。阳性克隆的正确定向通过两条链的DNA测序得到证实。重组质粒转化为蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株BL21（美国威斯康星州麦迪逊诺瓦根），在含有氨苄西林（50μg/mL）的2×YT培养基中37°C下培养5至7小时，剧烈摇晃直至A处的光密度₆₀₀达到1到1.5。通过添加1 mM异丙基诱导融合蛋白表达-d日-硫代吡喃半乳糖苷在37或25°C下放置3小时（对于B盒）。细菌在冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS）加1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma Chemical）和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）中进行超声处理。离心后（8000×克)为了去除细菌碎片，使用谷胱甘肽Sepharose树脂柱（Pharmacia）对细菌裂解液进行亲和纯化。表达、纯化GST载体蛋白，并使用重组GST-HMGB1蛋白作为实验对照。蛋白质洗脱液经PBS大量透析，以去除多余的还原型谷胱甘肽，通过多粘菌素B柱（Pierce，Rockford，IL，USA），冷冻干燥，并在使用前在无菌PBS中再溶解。SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证了蛋白质的完整性。纯度主要超过85%。

从HMGB1或B盒上拆下GST标签

在含HMGB1或B盒的细菌裂解物与谷胱甘肽-Sepharose亲和柱结合后，用10柱体积的冰冷PBS洗涤柱以去除未结合的蛋白质，然后用10柱体积的蛋白酶缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8，150mM NaCl和1mM EDTA）平衡。对于每毫升谷胱甘肽Sepharose珠，在含有1 mM二硫苏糖醇的1 mL蛋白酶缓冲液中添加80单位的精密蛋白酶（2000单位/mL，Pharmacia）。在室温下缓慢旋转消化3小时。消化完成后，将悬浮液离心500倍克5分钟，使Sepharose珠颗粒化；收集含有HMGB1或B盒蛋白的洗脱液。

DNase I处理

在含有HMGB1突变蛋白的细菌裂解物与GST柱结合后，以80单位/mL谷胱甘肽Sepharose珠添加DNase I，并在室温下在含有100 mM NaAc（pH 5）和5 mM MgCl的缓冲液中培养20 min₂.用5个柱体积的冷冻PBS清洗柱；然后用还原型谷胱甘肽洗脱蛋白质，如制造商（Pharmacia）所述。DNA酶I处理前后，对含有HMGB1蛋白的琼脂糖凝胶进行溴化乙锭染色，以验证DNA降解。

LPS含量

蛋白质洗脱液通过多粘菌素B柱去除任何污染的LPS。细胞培养中使用的蛋白质的LPS含量通过显色鲎阿米巴细胞裂解物分析测定（美国马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker公司）。HMGB1中LPS含量为219pg/μg蛋白质，B盒中为19pg/μg/μg，A盒中为16pg/μgGST载体中为4pg/μg。为了进行刺激实验，将多粘菌素B添加到6单位多粘菌毒素B/pg LPS的细胞培养基中。

RNA提取和核糖核酸酶保护试验

为了进行mRNA测量，将RAW 264.7细胞置于100-mm板中，并在含有B盒或载体的Opti-MEM I培养基中处理0至24小时。根据制造商的说明，从板上刮下细胞，并使用RNAzol B方法分离总RNA（Tel-Test“B”Inc，Friendswood，TX，USA）。TNF mRNA（287 bp，BD PharMinen，San Diego，CA，USA）通过RNase保护试验（Ambion，Austin，TX，USA。琼脂糖甲醛凝胶上RNA样品的溴化乙锭染色验证了RNA的等负荷和完整性（数据未显示）。

核提取物制剂

10岁时对RAW 264.7细胞进行电镀⁶每个6厘米培养皿中培养细胞，并单独用培养基（对照）或B盒培养不同时间段，如图所示。用冰镇PBS清洗细胞两次，并在含有2%FBS的1mL PBS中从平板上刮下。将细胞转移到1.5mL微滤管中，在14000×克持续10s，去除上清液。将细胞颗粒悬浮在缓冲液I中（10 mM KCL，1.5 mM MgCl₂，0.3 M蔗糖，500μM PMSF，1.0 mM原钒酸钠，1 mM DTT，10 mM Tris HCl，pH 7.8），并在室温下培养15分钟。添加Nonide®P40至最终浓度10%后，在310×克3分钟后，将上清液丢弃。将核芯块轻轻悬浮在缓冲液II中（500μM PMSF、1.0 mM原钒酸钠、1 mM DTT、420 mM KCl、1.5 mM MgCl₂，20%甘油，10 mM Tris HCl，pH 7.8），并在室温下培养15分钟。在14000×克培养10分钟，将上清液转移到新鲜试管中；蛋白质浓度通过Bradford分析测定（Bio-Rad，Hercules，CA）。核提取物在使用前保存在-80°C。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

双链核因子NF-κB寡核苷酸序列如下：5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C 3′；反义，3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G 5′（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。寡核苷酸用γ末端标记-³²使用T4多核苷酸激酶（Promega）的P ATP（美国马萨诸塞州波士顿新英格兰核电站）。核蛋白（3μg）与γ孵育-³²在2μg poly[d（I-C）]（Boehringer Mannheim，Indianapolis，in，USA）存在下，在带移缓冲液（65 mM NaCl，1 mM DTT，0.14 mM EDTA，8%甘油和13 mM HEPES，pH 8.0）中的P-标记的NF-κB探针溶液在室温下保持20分钟。对于竞争实验，通过将核提取物与100倍摩尔过量的未标记寡核苷酸同时添加到标记探针中，或在添加放射性标记探针之前与非免疫抗体（2μg/mL）预孵育1小时，进行超移分析。结合反应混合物在含有5%甘油和0.25×TBE缓冲液的4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。PAGE后，使用增感屏将凝胶干燥并在-80°C下暴露于Biomax-5膜（美国纽约州罗切斯特伊士曼柯达公司）中过夜，并进行密度分析。

激酶分析

将来自C3H/HeJ小鼠的硫代乙醇酸合法的初级巨噬细胞以2×10的比例接种⁶/在6厘米的培养皿中，用B盒或HMGB1（10μg/mL）刺激0至60分钟。刺激后，用冰镇PBS洗涤细胞，并用含有钒酸盐和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的SDS样品缓冲液进行裂解。样品经过超声波处理，煮沸5分钟，然后离心（10000×克，5分钟，4°C）；然后进行Western免疫印迹分析。

抗体生产

在兔子（Cocalico Biologicals，Inc，Reamstown，PA，USA）或母鸡（Aves Labs，Tigard，or，USA，美国）中培养抗B盒的多克隆抗体，并通过Western blotting检测效价。根据制造商的说明（美国伊利诺伊州罗克福德皮尔斯），使用蛋白A琼脂糖从抗-B盒抗血清中纯化IgG。IgY是从B盒免疫蛋黄中分离出来的，由Aves Labs（Tigard，OR，USA）提供。抗-B盒兔抗体按照标准程序使用氰溴化物活化的Sepharose珠进行亲和纯化，可从Cocalico Biologicals Inc.获得。在暴露于重组HMGB1的巨噬细胞培养物中证实了HMGB1抗体的中和活性，并检测了抗体抑制TNF释放的能力。

动物实验

雄性Balb/C和C3H/HeJ小鼠（6至8周）购自Harlan Sprague-Dawley（印第安纳波利斯，印第安纳州，美国），在实验中使用之前允许其适应7天。小鼠被安置在北岸大学医院动物设施内，处于标准的温度、光照和黑暗周期。所有动物程序都经过北岸大学医院动物设施IACUC的审查和批准。

LPS杀伤能力

Balb/C小鼠被给予LD₇₅腹腔注射LPS剂量（15 mg/kg），并用纯化的兔抗-B盒IgG抗体（非免疫兔IgG作为对照，每次腹腔注射600μg）或纯化的抗-B盒子IgY，每次注射60或600μg。LPS给药后0、12和24小时注射。每天监测死亡率，持续2周。

盲肠结扎和穿刺（CLP）

CLP的执行如前所述(25). 简单地说，Balb/C小鼠通过肌肉注射75 mg/kg氯胺酮（美国伊利诺伊州道奇堡，道奇堡）和20 mg/kg甲苯噻嗪（美国密苏里州圣约瑟夫，博林格·英格尔海姆）进行麻醉。进行15 mm中线切口，暴露盲肠。在离盲肠尖端5 mm处，离回盲瓣5 mm处放置6-0 prolene缝合带。然后用22号针头刺穿结扎的盲肠残端一次，不直接挤压粪便。盲肠被替换回正常的腹内位置。腹部伤口用两层连续缝合线闭合，腹膜和筋膜分开，以防止液体泄漏。所有动物均以20 mL/kg体重皮下注射生理盐水进行复苏。每只小鼠在手术后30分钟接受皮下注射亚胺培南（0.5 mg/只小鼠，200μL无菌盐水）（Primaxin，Merck&Co Inc，West Point，PA，USA）。CLP后12、24或36小时开始，每天两次腹膜内注射抗B盒兔IgG（60或600μg/小鼠，400μL无菌PBS），持续3天。对照组注射相应剂量的非免疫IgG。术后1周内记录死亡率；对幸存者进行了2周的随访，以确保没有发生晚期死亡。

B盒毒性

这个d日-氨基半乳糖致敏模型已经被描述(26,27). 小鼠腹腔注射20 mgd日-在200μL PBS和B盒、A盒或载体蛋白中加入200μL的半乳糖胺-HCL/小鼠。每天记录注射后72小时内的死亡率；对幸存者进行了2周的随访。

组织学评价

d日-半乳糖胺致敏小鼠用B盒处理7h后处死；器官被收获并固定在10%甲醛中。组织切片用苏木精和伊红染色以进行组织学评估（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市标准公司）。

细胞因子测量

如前所述，使用标准L929细胞毒性生物测定法测定TNF浓度(28). IL-1β、IL-6和IL-10水平由制造商（美国明尼阿波利斯R&D System Inc）提供的商业ELISA试剂盒测定。

B盒概括了全长HMGB1在体内的致死性，抗-B盒抗体可降低内毒素和败血症致死性

为了评估B盒本身是否能在体内介导致死性，在标准化的d日半乳糖胺致敏小鼠致死模型(26,27). B盒给药在Balb/C小鼠中引起了显著的剂量依赖性致死，而对HMGB1 A盒或从缺乏B盒的载体纯化的对照蛋白没有产生致死反应(表1). 全身注射B盒对d日-半乳糖胺致敏、内毒素抵抗（C3H/HeJ）小鼠（数据未显示）。暴露于B盒后7h，小鼠血清IL-6和IL-1β水平显著升高；此时血清TNF没有增加(图3A). 服用B盒7小时后采集的心脏、肾脏、肝脏和肺的苏木精和伊红染色切片显示，肺或肾没有明显异常形态学变化（未显示）。然而，对心脏切片的检查显示，有证据表明缺血，心肌纤维中的横纹和无定形粉红色细胞质消失。肝脏切片显示轻度急性炎症反应，部分肝细胞脱落和凋亡，偶尔出现多形核白细胞（参见图3B). 这些特定的病理变化与给予全长HMGB1后观察到的病理变化相当（数据未显示），证实了B盒本身在体内重现了对HMGB1的致命病理反应。

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图3

B盒在体内有毒。A： B盒治疗的小鼠血清IL-6和IL-1β水平升高。Balb/C小鼠腹腔注射20 mgd日-每只小鼠的盐酸氨基半乳糖（在200μL PBS中）和1 mg B盒或载体蛋白（在200μL PBS中）。7小时后采血；用ELISA法分析血清中的TNF、IL-1β和IL-6(n个=每组4至7只小鼠）*P（P）与对照组相比<0.05。B： B盒治疗Balb/C小鼠的组织病理学。小鼠（每组3只）d日-半乳糖胺（20 mg/小鼠）加上B盒或载体（1 mg/小鼠，腹腔注射）。7小时后将小鼠斩首处死。组织被采集并固定在10%的缓冲甲醛中。制备石蜡包埋组织切片，并用苏木精和伊红染色以进行组织学评估（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市标准公司）。与对照组小鼠相比，B盒治疗导致心肌缺血改变和心肌纤维横纹丢失（箭头所示）。如急性活动性肝炎所示，B盒对肝脏的损害最大。可见凋亡肝细胞被多形核白细胞包围（箭头所示）。

为了确定靶向B盒的抗体是否能保护Balb/C小鼠免受延迟内毒素致死，用中和性抗B盒IgY抗体或无关对照IgY被动免疫Balb/C小鼠。注射抗-B盒抗体可显著和剂量依赖性地预防致死性内毒素血症(图4)，使用无关IgY治疗的小鼠存活率从31%提高到使用抗-B盒抗体治疗的73%(P（P）< 0.05). 使用中和抗-B盒兔IgG也获得了类似的结果（抗-B盒子存活率=62%，而非免疫兔IgG=27%；n个=每组26只小鼠，P（P）< 0.05). 与内毒素诱导的反应相比，盲肠结扎和穿孔诱导的小鼠败血症中HMGB1水平也显著升高，HMGB1释放动力学延迟（HY和KJT，提交的手稿）。为了确定抗-B盒对主动感染诱导的脓毒症啮齿动物模型是否有效，对小鼠进行盲肠结扎和穿孔诱导腹膜炎和脓毒症，并被动免疫抗-B盒子抗体。盲肠穿孔发生12小时后给予IgG纯化的抗B盒兔抗体显著提高了存活率（用对照IgG治疗的小鼠存活率=22%，而接受抗B盒IgG治疗的小鼠存活率=65%；n个=每组18至20人，P（P）< 0.03,表2). 手术后24小时开始抗体治疗时也获得了类似的结果（非免疫IgG组生存率=27%，而抗-B盒生存率=72%；n个=每组18个，P（P）< 0.03). 盲肠结扎和穿刺后将第一剂抗体延迟36小时未能提供保护，这表明抗B盒抗体可以在败血症发作后至少24小时有效靶向HMGB1。抗体剂量反应研究表明，针对B盒的中和抗体可在内毒素血症和败血症期间特异性保护全长HMGB1的毒性（参见表2).

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图4

抗-B盒抗体可保护小鼠免受LPS致死。雄性Balb/C小鼠（每组10至18只）接受LD治疗₇₅LPS剂量（15 mg/kg，腹腔注射）。在LPS给药后的第0、12和24小时给予IgY纯化的抗B盒抗体或非免疫IgY（每次60或600μg/小鼠，腹腔注射）*P（P）与Fisher精确试验测试的对照组相比，<0.05。