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分子生物学细胞。2006年3月；17(3): 1261–1272.
数字对象标识：10.1091/桶。E05-10-0927号
预防性维修识别码：项目经理1382315
PMID：16371504

黑色素瘤细胞跨内皮迁移过程中Src家族激酶参与N-钙粘蛋白磷酸化和β-连环蛋白解离D⃞

齐剑飞,*† 王俊福,*‡ 奥列娜·罗曼纽克,*和Chi-Hung Siu先生*†
让·施瓦茨鲍尔，监控编辑器
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摘要

在与接种在单层内皮细胞顶部的肿瘤细胞共培养系统中，在黑色素瘤细胞跨内皮细胞迁移期间，N-钙粘蛋白被招募到异型接触中。然而，β-连环蛋白从N-钙粘蛋白中分离出来，并重新分布到迁移的黑色素瘤细胞的细胞核以激活基因转录。在本报告中，我们证明了Src在迁移的黑色素瘤细胞和邻近内皮细胞之间的异型接触中被激活。Src激活与N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化在时间上密切相关。黑色素瘤细胞中显性负性Src的表达阻断了N-钙粘素磷酸化、β-连环蛋白解离和迁移细胞中的核移位，这与Src家族激酶的参与相一致。在体外结合分析中，Src介导的N-钙粘蛋白胞质结构域磷酸化导致β-连环蛋白结合显著降低。虽然通过质谱法可以在N-钙粘蛋白细胞质域上鉴定出五个磷酸酪氨酸残基，但定点突变表明Tyr-860是参与β-连环蛋白结合的关键氨基酸。携带Y860F突变的N-钙粘蛋白的过度表达抑制了转染细胞在内皮细胞上的迁移。总之，这些数据表明，在黑色素瘤细胞经内皮细胞迁移过程中，Src家族激酶对N-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化在调节β-连环蛋白关联中的新作用。

简介

肿瘤转移是一个复杂的多步骤过程，包括癌细胞从原发肿瘤中分离、灌注、在血流中存活、外渗和在远处器官建立新病灶(奥尔等., 2000；菲德勒，2003). 外渗是肿瘤转移中最不为人所知的步骤之一，它涉及癌细胞与内皮细胞之间的动态相互作用。我们利用共培养实验研究了肿瘤细胞跨内皮细胞迁移（TEM）的机制(桑迪希等., 1997；沃拉等., 1998). 我们的结果强调了趋化因子和细胞粘附分子（CAM）在迁移过程中的作用(沃拉牌手表等2001年b月；拉姆吉辛格等., 2003)。

黑色素瘤细胞附着在单层内皮细胞上可诱导癌细胞下方内皮连接处两种主要CAM的局部溶解，即血管/内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）和血小板/内皮细胞粘附分子-1(桑迪希等., 1997；沃拉等2001年). 随着VE钙粘蛋白从内皮连接处重新分布，N-钙粘蛋白进入并集中在黑色素瘤细胞及其邻近内皮细胞之间的异型接触中，促进黑色素瘤细胞的TEM(桑迪希等., 1997；气等., 2005)。

有趣的是，在透射电镜下异型接触中，β-连环蛋白从N-钙粘蛋白粘附复合体中分离(气等2005年). 钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物的组装和分解调控被认为是组织发育和肿瘤转移过程中细胞间粘附相互作用动力学的基础(Gumbiner，2000年；武一和安倍，2005年). 因为钙粘蛋白介导的细胞-细胞相互作用的强度取决于其细胞质结构域通过β-连环蛋白与肌动蛋白细胞骨架的结合(武一，1995)β-catenin的丢失可能导致N-钙粘蛋白介导的粘附性降低，并促进肿瘤细胞跨内皮连接的迁移。

除了细胞间粘附外，β-catenin是Wnt信号通路中的关键信号转导子。细胞质β-连环蛋白通常被招募到含有GSK3β的多蛋白复合物中。GSK3β磷酸化β-catenin促进其泛素化和随后的蛋白酶体降解(Peifer和Polakis，2000年). 然而，在Wnt信号存在的情况下，GSK3β活性被抑制，导致β-连环蛋白在细胞核中积聚，在那里它与LEF/TCF转录因子家族相互作用以调节基因转录(Peifer和Polakis，2000年；Nelson和Nusse，2004年). 在透射电镜下，游离的β-连环蛋白也能够逃避降解，在黑色素瘤细胞核中积聚，并激活β-连环素介导的基因转录(气等., 2005). 已知的β-连环蛋白诱导基因包括N-钙粘蛋白和编码参与癌细胞侵袭过程的蛋白质的基因(布拉伯茨等., 1999；曼恩等., 1999；维埃伦加等., 1999；亨德梅耶等., 2004；气等2005年)。

需要解决的一个关键问题是，β-连环蛋白从黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触中分离的机制。我们之前的研究表明N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化作用(气等., 2005)尽管酶和机制尚待确定。一些报道暗示了Src在钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物分解中的调节作用(松下（Matsuyoshi）等., 1992；贝伦斯等., 1993；滨口等., 1993). 在这些研究中，Src诱导的β-catenin磷酸化与钙粘附素介导的细胞-细胞粘附的破坏有关。然而，其他报告表明，β-catenin在拆卸过程中是可有可无的(塔克达等., 1995；Irby和Yeatman，2002年；弗罗贝尔等., 2004)，表明可能涉及其他Src基底。

在本报告中，我们证明了与异型接触相关的Src激活导致N-钙粘蛋白磷酸化，随后在黑色素瘤细胞TEM期间β-catenin解离。进一步研究表明，N-钙粘蛋白胞质域中的Tyr-860是参与调节其与β-连环蛋白相互作用的关键氨基酸。

材料和方法

抗体

抗人N-cadherin、β-catenin、p120ctn和抗磷酸酪氨酸单克隆抗体（PY-20）的小鼠单克隆抗体从BD Transduction Laboratories（肯塔基州列克星敦）购买。为了对核β-连环蛋白进行免疫染色，使用了抗人β-连环素非磷酸化形式的小鼠单克隆抗体（加利福尼亚州圣地亚哥A.G.Scientific）。兔抗人N-钙粘蛋白抗体（H-36）购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州），用于免疫沉淀研究。抗Src和磷酸化Src（Tyr-416）的小鼠单克隆抗体购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY）。小鼠抗myc抗体购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。兔抗人β-catenin抗体购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。Alexa 488-或Alexa 568-结合的山羊抗鼠和山羊抗兔抗体购自Molecular Probes（Eugene，or）。

细胞系

人肺微血管内皮细胞（HMVEC）购自Clonetics（加利福尼亚州圣地亚哥），并在添加青霉素-链霉素（分别为100 U/ml和100μg/ml）的内皮介质EGM-2 MV（Clonetics）中培养。实验中通常使用第6代和第8代之间的HMVEC。人类黑色素瘤细胞系WM239（来自宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所Meenhard Herlyn博士）在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。所有细胞在含有5%CO的增湿大气中保持在37°C2

cDNA构建

pUSEamp载体中的野生型和显性阴性（DN）-Src cDNA均购自Upstate Biotechnology。DN-Src包含两个点突变（K296R/Y528F），导致激酶活性丧失和采用开放构象。他们被亚克隆到Xho公司我/巴姆pEGFP-N1载体的HI位点。利用从WM239黑色素瘤细胞中分离的总RNA，通过逆转录-PCR获得编码N-钙粘蛋白细胞质结构域的cDNA，然后将其克隆到速度我/巴姆含有C-末端6xHis标记的pQE-70载体的HI位点或巴姆HI（高）/生态含有N-末端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的pGEX-2T载体的RI位点。使用QuikChange II定点突变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）在N-钙粘蛋白胞质域中进行将酪氨酸转化为苯丙氨酸的点突变。β-连环蛋白cDNA被克隆到巴姆HI（高）/萨尔包含C末端6xHis标记的pTrcHis2载体的I位点。N-cadherin cDNA的完整编码区购自Invitrogen，然后亚克隆到巴姆HI（高）/Xho公司包含C末端myc-tag的pcDNA3.1 myc-His载体的I位点。N-cadherin Y860F突变是使用Stratagene的QuikChange II试剂盒产生的。所有突变和cDNA构建均经DNA测序证实。

细胞转染

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将质粒DNA转染到WM239黑色素瘤细胞中。对于N-钙粘蛋白-myc的瞬时表达，在转染后48小时对细胞进行分析。为了稳定转染Src-GFP，在转染后48小时应用选择培养基（1 mg/ml G418）。通过荧光显微镜筛选稳定菌落。

经内皮细胞迁移试验

如前所述进行体外TEM分析(桑迪希等., 1997；沃拉等., 1998). HMVEC细胞（1.5×105将200μl内皮培养基中的细胞（第5–8代）置于Matrigel涂层玻璃盖玻片（直径12 mm）的顶部，并静置5–6 h。盖玻片随后转移到新的24孔板中，并在含有10 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF）的0.5 ml内皮培养基内培养-α（Invitrogen/BRL，加拿大安大略省伯灵顿）促进CAM表达12小时。将单层冲洗三次，然后在不含TNF-α的0.5 ml新鲜内皮培养基中培养。用10μg/ml 1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐（分子探针）在37°C下标记黑色素瘤细胞5分钟。清洗后，细胞以2.5×10的速度重新悬浮6内皮培养基中的细胞/ml。黑色素瘤细胞（5×104细胞）添加到每个HMVEC单层。在不同时间点用多聚甲醛固定共培养物，并使用BODIPY-斑蝥素（分子探针）染色F-actin。使用Wild Leitz Orthoplan表观荧光显微镜对迁移进行定量分析。对于每张盖玻片，对共45个区域的三组随机区域进行轮回细胞评分。每组15个字段包含100-200个黑色素瘤细胞，每个数据点的常规评分>1000个黑色素细胞。

在抑制研究中，在AG1478（表皮生长因子受体抑制剂；10μM）、K252a（c-Met抑制剂；50 nM）、SU5402（成纤维细胞生长因子受体抑制物；50μM）和酪朊蛋白AG1295（血小板衍生生长因子受体抑制物；10μM）、，SU5416（血管内皮生长因子受体-2抑制剂；10μM）、I-Ome-tyrphostin AG538（胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；10µM）或PP2（Src家族激酶[SFK]抑制剂；10¦ΜM）。在所有抑制研究中，估计与内皮单层相关的黑色素瘤细胞总数，以确保迁移细胞数量的任何减少都不是由于细胞附着减少所致。

共焦显微镜免疫荧光染色

用2μM Cell Tracker Orange（分子探针）标记黑色素瘤细胞，然后将其放置在Matrigel涂层盖玻片上培养的内皮细胞单层上。用3.5%多聚甲醛在22°C下固定细胞5分钟，或用100%甲醇（预冷至-20°C）在冰上固定3分钟。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗三次后，在0.1%Triton X-100中使装有对甲醛的细胞渗透5分钟。在封闭1%牛血清白蛋白（BSA）后，细胞在室温下与一级和二级抗体孵育45分钟。洗涤后，将盖玻片安装在载玻片上，并在蔡司LSM410共聚焦显微镜下进行检查。

荧光素酶报告分析

TCF报告质粒试剂盒从Upstate Biotechnology购买，其中包含TOPflash、FOPflash和TK载体。使用Lipofectamine 2000以30:1的比例将黑色素瘤细胞与TOPflash（或FOPflash）和TK载体瞬时共转染。两天后，黑色素瘤细胞（3×105)接种在HMVEC单层（3×105细胞）在Matrigel涂层的24孔板中。在不同时间收集细胞，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega，Madison，WI）进行分析。使用Lumat LB光度计测量发光度（德国巴德·威尔德巴德Berthold Technologies）。萤火虫萤光素酶活性（TOPflash或FOPflash）与雷尼利亚荧光素酶活性（TK载体）用于评估β-catenin介导的转录变化。荧光素酶活性的倍增是通过将数据归一化为共培养0小时的数据来计算的。

免疫沉淀和免疫印迹分析

用于生化分析，4×106将内皮细胞在涂有Matrigel的60mm板上，在含有10ng/ml TNF-α的内皮培养基中培养12小时。将细胞洗涤三次，然后在新鲜内皮培养基中孵育。黑色素瘤细胞（4×106)在内皮细胞单层上沉积，共培养5h后溶解。为了制备0-h共培养样品，黑色素瘤细胞在裂解前放置在基质上5 h，裂解液与内皮单层的裂解液混合，内皮单层在基质上培养17 h（12 h+5 h）。

对于免疫沉淀，细胞在免疫沉淀（IP）裂解缓冲液中进行裂解（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，1 m M原钒酸钠，蛋白酶抑制剂混合物和1%NP-40）。将上清液与3μg一级抗体在4°C下孵育过夜。在4°C下进一步孵育1 h之前，添加蛋白质A-琼脂糖（10 mg）。将Sepharose珠粒化，并在IP裂解缓冲液中洗涤三次。在SDS-PAGE之前，将珠上的蛋白质在100°C的样品缓冲液中溶解5分钟。

为了对总细胞裂解物进行免疫印迹分析，细胞在凝胶裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，2%十二烷基硫酸钠和2 mM苯甲基磺酰氟）中进行裂解。SDS-PAGE后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，然后在PBS中用5%脱脂牛奶封闭，然后与一级抗体孵育1 h。为了探测磷酸酪氨酸和磷酸Src，将膜封闭在Tris缓冲盐水中的1%BSA中，并与相应的单抗孵育4°C过夜。将膜清洗并在辣根过氧化物酶结合二级抗体中孵育1 h，然后用ECL试剂（加拿大魁北克省贝尔杜夫市Amersham Biosciences）进行开发。为了量化，在Fluor-S成像仪（Bio-Rad，Hercules，CA）中分析印迹，并通过减去相同大小的印迹空白区域获得每个带的像素值。

重组钙粘蛋白的体外磷酸化及分析

在含有25 mM Tris-HCl、pH 7.2、30 mM MgCl的40μl最终体积中进行体外磷酸化2，5 mM氯化锰2，0.5 mM EGTA，0.25 mM VaO4纳三、0.5 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.1 mM ATP、5μg His-tagged或GST-tagged N-cadherin胞质域和50 U重组Src蛋白（Upstate Biotechnology）。在30°C下进行反应10分钟至5小时。在相同条件下，在存在10μM PP2或不存在ATP的情况下进行控制反应。

体外磷酸化后，通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析His-tagged N-cadherin细胞质结构域，以确定磷酸酪氨酸残基的总数。然后制备磷酸化蛋白的胰蛋白酶肽，并通过质谱分析来定位特定的磷酸酪氨酸残基。

蛋白质结合分析

对于结合研究，在200μl结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.3，150 mM NaCl，3 mM MgCl）中培养0.6 pmol的His-taggedβ-catenin和1.2 pmol的磷酸化或非磷酸化GST-tagged N-cadherin胞质域（野生型或突变重组蛋白）21 mM EDTA、1 mM DTT和0.1%NP-40）在4°C下保持1 h。允许蛋白质复合物在4°C下与40μl 50%谷胱甘肽-脑葡萄糖颗粒浆液结合1h。然后，将珠粒用结合缓冲液洗涤三次。在SDS-PAGE和免疫印迹分析之前，将结合在珠子上的蛋白质溶解在样品缓冲液中并煮沸5分钟。

结果

Src家族激酶抑制剂防止黑色素瘤细胞TEM中β-连环蛋白解离

我们以前的工作表明，酪氨酸磷酸化在调节β-连环蛋白从N-钙粘蛋白中的分离中起作用(气等., 2005). 为了确定参与这一过程的酪氨酸激酶，我们在透射电镜下测试了几种特定酪氨酸激酶抑制剂，包括AG1478、K252a、SU5402、酪蛋白AG1295、SU5416、I-Ome-tyrphostin AG538和PP2对黑色素瘤细胞的作用。用Cell Tracker Orange标记黑色素瘤细胞，并进行TEM分析。黑色素瘤细胞在内皮细胞单层附着的初始阶段表现出圆形形态（图S1A）。然后，他们开始将假足插入内皮连接处（图S1B）。移行细胞通常采用细长的纺锤形（图S1C），而内皮下方的细胞显示成纤维细胞形态（图S1D）。为了比较不同激酶抑制剂的作用，我们检测了具有纺锤形形态的迁移细胞。在这些激酶抑制剂中，只有PP2能有效消除迁移黑色素瘤细胞与其周围内皮细胞之间异型接触处的磷酸酪氨酸染色。PP2还阻止β-连环蛋白的分离及其在细胞核中的积聚(图1A). 这些结果表明SFK参与了异型接触时的酪氨酸磷酸化事件。

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Src-特异性抑制剂PP2对N-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化和黑色素瘤细胞TEM的影响。标记的黑色素瘤细胞（红色）在内皮细胞单层上培养，存在不同的激酶抑制剂。只有PP2抑制N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化和β-连环蛋白的分离。AG1478的数据显示为其他非抑制性化合物的代表。（A） 在共培养5小时时固定TEM分析盖玻片，并对磷酸酪氨酸、β-连环蛋白或N-钙粘蛋白（绿色）进行免疫染色。箭头表示黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触，开放箭头表示内皮连接处的β-连环蛋白标记。箭头表示核β-连环蛋白在迁移的黑色素瘤细胞中积聚。棒材，10μm。（B） 在AG1478或PP2存在的情况下进行共培养。在0和5小时收集样本，用N-钙粘蛋白抗体进行免疫沉淀。通过对N-钙粘蛋白、β-连环蛋白或磷酸酪氨酸的免疫印迹分析免疫沉淀物，PP2抑制β-catenin解离。（C） 在AG1478或PP2存在的情况下进行TEM分析。在5 h时对迁移细胞的百分比进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。

为了检测PP2对N-钙粘蛋白黏附复合体磷酸化状态的影响，在没有或存在PP2的情况下，在内皮单层上培养黑色素瘤细胞5小时。对N-钙粘蛋白复合物进行免疫沉淀并进行免疫印迹分析。在没有PP2的情况下，N-钙粘蛋白被酪氨酸磷酸化，与N-钙粘素共沉淀的β-连环蛋白的量在共培养5小时时减少了>60%(图1B). 因为p120ctn可以被酪氨酸磷酸化(水手等., 2001)在SDS凝胶中，它在N-钙粘蛋白之前迁移，有必要确定磷酸化带是否确实是N-钙粘素而不是p120ctn。当对N-钙粘蛋白的免疫沉淀物进行免疫印迹分析时，发现N-钙粘素和p120ctn之间只有很小的距离。然而，酪氨酸磷酸化带明显与N-钙粘蛋白结合（图S2A）。在另一个实验中，免疫沉淀物中的N-钙粘蛋白复合物被1%的SDS破坏，然后使用抗N-钙粘素或抗p120ctn抗体重新沉淀。免疫印迹分析表明，N-钙粘蛋白而非p120ctn在共培养5 h时被酪氨酸磷酸化（图S2B）。

然而，N-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化在PP2存在下被消除，β-连环蛋白结合水平在共培养期间保持不变。相比之下，代表其他非抑制试剂的表皮生长因子受体抑制剂AG1478不影响N-钙粘蛋白磷酸化或β-连环蛋白从N-钙粘素中分离(图1B). 在所有病例中，未检测到β-连环蛋白磷酸化。

当在PP2存在下进行TEM分析时，黑色素瘤细胞的迁移减少了60%，尽管粘附在内皮细胞单层上的细胞数量与对照组相当。然而，AG1478对TEM没有任何不利影响(图1C). 这些结果表明SFK在N-钙粘蛋白磷酸化和迁移过程中起着关键作用。

Src在转移性黑色素瘤细胞与内皮细胞的异型接触中被激活

Src激酶家族包括9个成员，其中Src已被证明主要参与钙粘蛋白-连环蛋白复合物的调节以及癌症转移(Nelson和Nusse，2004年；Yeatman，2004年). 因此，我们研究了Src在癌细胞TEM中的潜在作用。用绿色荧光蛋白（GFP）标记的野生型（WT）Src或DN-Src稳定转染黑色素瘤细胞(图2A). WT-Src-GFP定位于细胞-细胞接触区和细胞质，但在细胞核中明显缺失(图2B). 在TEM分析中，检查了来自初始附着阶段（以其圆形为特征）和来自迁移阶段（以其纺锤形或成纤维细胞形态为特征）的细胞（图S1、A和C）。在最初附着和迁移阶段，在黑色素瘤细胞及其周围内皮细胞的异型接触中观察到高水平的WT-Src-GFP(图2C)。

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黑色素瘤细胞TEM期间异型接触处的Src激活。（A） 在WM239黑色素瘤细胞中表达GFP标记WT和DN Src的稳定转染体的免疫印迹。内源性Src用箭头表示，GFP标记的Src由箭头表示。（B） 共聚焦图像显示WT-Src-GFP在黑色素瘤细胞转染物中的定位。（C） 共聚焦图像显示了细胞附着和迁移期间异型接触处WT-Src-GFP的浓度。箭头表示转染的黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触。（D） 非转染黑色素瘤细胞透射电镜下异型接触激活Src（p-Src）的免疫定位。（a和b）固定于1小时的共培养物显示黑色素瘤细胞处于附着阶段。（c和d）固定在5小时的共培养，显示了迁移阶段。对对照共培养物（a和c）和固定前用1 mM渗透酸盐预处理5分钟的共培养物进行p-Src免疫染色。黑色素瘤细胞标有星号。箭头表示黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型接触，箭头表示同型内皮细胞连接。棒材，10μm（B、C和D）。（E） 免疫印迹显示PP2在TEM期间消除了Src激活。在有或无PP2的情况下，将黑色素瘤细胞培养在内皮单层上。在0或5小时收集细胞，并针对p-Src和Src进行免疫印迹检测。（F） 免疫印迹显示WT-Src和DN-Src转染剂中的p-Src水平。（G） 将Src转染物培养在内皮单层上，在0或5小时收集细胞进行p-Src免疫印迹分析。在F和G中，箭头表示WT-或DN-Src-GFP，而箭头表示内源性Src。

因为我们以前的工作表明，N-钙粘蛋白复合物的酪氨酸磷酸化只发生在迁移过程中，而不发生在细胞附着阶段(气等., 2005)上述结果表明，Src可能在细胞附着阶段不活跃，但在迁移过程中在异型接触中被激活。为了验证这一假设，用针对活性p-Src（在Tyr-416上磷酸化的Src）的单克隆抗体对共培养物进行染色。当黑色素瘤细胞穿过内皮连接时，在异型接触区检测到p-Src弱点状染色(图2D，c). 为了最大限度地观察p-Src染色，在固定前用酪氨酸磷酸酶抑制剂渗透酸盐处理共培养物5分钟。p-Src染色在迁移细胞的异型接触区以及内皮细胞之间的同型接触区中清晰可见(图2D，d). 相反，在细胞附着阶段，异型接触中没有p-Src染色(图2D、a和b). 与这些结果一致，免疫印迹分析显示，在共培养5小时时，p-Src水平增加了5倍。然而，当在PP2存在的情况下进行共培养时，这种增加被废除(图2E)。

使用过度表达WT-Src-GFP或DN-Src-GFP的稳定转染黑色素瘤细胞进行Src活化的进一步研究。免疫印迹分析表明，WT-Src或DN-Src的过度表达可消除内源性Src激活的基础水平(图2F). WT-Src-GFP显示出清晰的p-Src信号，而在DN-Src波段中未检测到p-Src(图2F). 为了检测WT-Src是否像内源性Src一样被激活，将转染细胞培养在内皮单层上，并对0-或5-h样品的免疫印迹进行Src和p-Src检测。WT-Src在共培养5h时，p-Src水平增加了3倍以上(图2G). WT-Src和DN-Src均在5h时部分抑制内源性Src的激活(图2G). 由于WT-或DN-Src仅阻断转染物中内源性Src的激活，因此5-h共培养物中内源Src激活水平低可能反映了内皮细胞中的Src活化。

DN-Src的表达抑制β-连环蛋白信号转导和TEM

为了检测透射电镜下DN-Src表达对β-catenin分布的影响，在共培养试验中检测了WT-和DN-Src-转染体(图3A). DN-Src的表达导致异型接触中p-Src染色显著减少，透射电镜下高水平的β-catenin与异型接触相关。相反，WT-Src转染剂在异型接触中表现出p-Src富集，而非β-catenin。因此，β-catenin从异型接触中分离似乎与Src活化密切相关。

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DN-Src表达对黑色素瘤细胞Src激活、β-catenin信号和TEM的影响。（A） 共聚焦图像显示Src-GFP转染物TEM期间β-catenin和p-Src的免疫定位（星号）。在对p-Src进行免疫染色之前，用过碘酸钾处理细胞5分钟。箭头表示Src-GFP转染物与内皮细胞之间的异型接触，箭头表示β-catenin的核标记和核周标记。棒材，10μm。（B） 通过PP2或DN-Src转染抑制转移性黑色素瘤细胞中β-catenin介导的基因转录。用TOPflash载体瞬时转染细胞，然后在内皮单层上培养(▪) 或PP2缺失（□）。在共培养5 h时收集细胞并分析荧光素酶活性。将共培养5h时的荧光素酶活性归一化为共培养0h时的荧光素酶活性，并计算荧光素酶活的相对增加量。数据表示平均值±SD（n=3）。（C） PP2或DN-Src转染抑制黑色素瘤细胞TEM。在存在的情况下对细胞进行TEM分析(▪) 或PP2缺失（□）。在5 h时对迁移细胞的百分比进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。

与我们之前的观察一致(气等., 2005)上述结果还表明，WT-Src转染剂的核周区和细胞核内存在大量的β-连环蛋白，而DN-Src的细胞核中未检测到β-连环素(图3A). 已知细胞核中β-连环蛋白的积累可调节基因表达。为了评估Src激活对β-catenin依赖性转录的作用，用TOPflash载体瞬时转染黑色素瘤细胞，该载体在荧光素酶报告基因之前含有TCF/LEF结合位点。然后将这些细胞培养在内皮单层上5小时。荧光素酶活性的增加反映了β-连环蛋白依赖性基因转录的增加。在没有PP2的情况下，在WM239黑色素瘤细胞、GFP对照转染体和WT-Src转染体共培养5小时后，观察到荧光素酶活性增加了6倍(图3B). 将PP2添加到共培养物中可消除所有转染细胞和对照细胞中β-catenin介导的转录。相反，在没有或存在PP2的情况下，DN-Src转染体中的荧光素酶活性保持在背景水平(图3B)。

在TEM分析中，DN-Src转染子迁移较差，在PP2存在或不存在的情况下，只有20%的细胞迁移5小时(图3C). 相反，对照转染剂和WT-Src转染剂分别显示55%和70%的迁移。在所有情况下，PP2处理抑制TEM，导致20-25%的迁移(图3C)。

Src干扰β-连环蛋白结合N-钙粘蛋白的体外磷酸化

为了提供Src能够磷酸化N-钙粘蛋白的直接证据，制备了His-tagged N-钙粘素胞质域，并使用重组Src进行体外磷酸化反应。免疫印迹分析表明，N-钙粘蛋白胞质结构域被Src有效磷酸化，磷酸化反应在10分钟内几乎达到饱和。磷酸化反应依赖于ATP，对PP2抑制敏感(图4A)。

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体外N-钙粘蛋白胞质结构域的磷酸化破坏了其与β-连环蛋白的相互作用。（A） 活性Src对重组N-cadherin胞质域（N-cad-cyt）的磷酸化。将磷酸化反应进行不同的时间，并将反应的等分样品进行SDS-PAGE。用抗N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸抗体检测免疫印迹。（B） β-catenin与磷酸化N-钙粘蛋白胞质域（N-cad-cyt）结合的减少。GST标记的N-cad-cyt在有或无ATP的情况下由Src在体外磷酸化，然后与His-taggedβ-catenin孵育。用谷胱甘肽珠分离蛋白质复合物，并用免疫印迹检测β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸。

接下来，研究了Src介导的N-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化对β-连环蛋白与N-钙粘素结合的影响。建立体外结合实验，研究GST标记的N钙粘蛋白胞质结构域与His标记的β-连环蛋白之间的相互作用。使用谷胱甘肽珠分离蛋白质复合物，然后进行免疫印迹分析。β-连环蛋白与N-钙粘蛋白的细胞质结构域结合，但不与GST结合。然而，β-catenin与Src-磷酸化N-钙粘蛋白胞质结构域的结合显著减少(图4B)。

Src鉴定N-钙粘蛋白磷酸化酪氨酸残基

采用MALDI-TOF质谱法鉴定Src-磷酸化酪氨酸残基。His标记的N-钙粘蛋白细胞质结构域含有8个酪氨酸残基，在体外被Src磷酸化。在Src磷酸化之前，N-cadherin细胞质结构域在质谱中显示一个～19kDa的单峰。磷酸化后，出现了五个新的明显峰，相邻峰之间的分离度为～80 Da(图5A). 由于磷酸基团的质量为80Da，结果表明，N-钙粘蛋白胞质结构域上的五个酪氨酸残基在体外被Src磷酸化。

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通过Src体外磷酸化后鉴定N-钙粘蛋白细胞质域上的磷酸-酪氨酸残基。光谱成对显示了在存在或不存在ATP的情况下发生磷酸化反应的肽。磷酸化肽以新的峰值出现，质量增加80 Da。（A）通过Src在体外磷酸化His-tagged N-cadherin细胞质结构域，然后进行MALDI-TOF质谱分析。（B和C）His-tagged N-cadherin胞质结构域在体外被Src磷酸化，然后被胰蛋白酶消化。对胰蛋白酶肽进行MALDI质谱分析。（B） 肽AADNDPTAPP中磷酸化Y852、Y860、Y884和Y886残基的鉴定Y（Y）DSLLVFDYEGSGSTAGSLSSLNSSSSGGEQD公司Y（Y）D类Y（Y）LNDWGPR（5448 Da）。（C） 多肽MDERPIHAEPQ中磷酸化Y820的鉴定Y（Y）PVR（1838 Da）和RMDERPIHAEPQY（Y）PVR（1994年数据）。

为了定位特定的磷酸-酪氨酸残基，在用MALDI-TOF质谱分析之前，用胰蛋白酶消化Src-磷酸化的N-钙粘蛋白细胞质结构域。根据相差80 Da的成对峰的出现来鉴定含有磷酸酪氨酸残基的肽。五个磷酸酪氨酸残留物中的四个残基位于一个长肽内，即AADNDPTAPPYDSLVFDYEGSTAGSLSSLNSSSSGGEQDYDYLNDWGPR（5448 Da）(图5B)产生5528、5608、5688和5767 Da的磷酸肽。由于该肽中只有四个酪氨酸残基（Y852、Y860、Y884和Y886），因此它们都被磷酸化。第五个磷酸酪氨酸残基出现在两个肽中，即MDERPIHAEPQY（Y）PVR（1838 Da）或RMDERPIHAEPQY（Y）PVR（1995 Da），由同一肽的差异消化产生，分别产生1918和2075 Da的磷酸肽(图5C). 因为这些肽中只有一个酪氨酸残基，所以Y820被磷酸化。

负责β-连环蛋白解离的N-钙粘蛋白上磷酸酪氨酸的定位

为了鉴定破坏β-连环蛋白与N-钙粘蛋白结合的特异性磷酸-酪氨酸残基，将质谱鉴定的五个酪氨酸残基分别突变为苯丙氨酸。携带这些突变的GST融合蛋白通过Src进行体外磷酸化。对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白进行了测定，以确定它们是否能够降低His-taggedβ-catenin。五个酪氨酸残基中的任何一个突变都不会显著改变重组蛋白的磷酸化水平(图6A)这表明五个酪氨酸残基在体外被同等磷酸化。在所有磷酸化突变蛋白中，只有Y860F突变蛋白没有表现出β-连环蛋白结合水平受损(图6，A和B)表明N-钙粘蛋白中Y860的磷酸化是导致其与β-连环蛋白相互作用中断的原因。Tyr-860位于与钙粘蛋白-β-连环蛋白结合相关的核心区域相对应的高度保守序列中(Huber和Weis，2001年；徐等., 2002) (图6C)。

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N-cadherin Y860磷酸化对体外β-catenin结合的影响。（A） 在N-钙粘蛋白胞质结构域上鉴定的五个酪氨酸残基分别突变为苯丙氨酸。GST标记的突变蛋白从细菌中纯化，然后在体外通过Src磷酸化。磷酸化蛋白与His-taggedβ-catenin进行结合试验。用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠分离蛋白质复合物，并用抗β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸的抗体检测免疫印迹。携带Y860F突变的蛋白质的磷酸化不影响其与β-连环蛋白的结合（星号）。（B） 突变N-钙粘蛋白胞质结构域和β-连环蛋白之间结合分析的定量。在结合试验之前，突变的N-cadherin细胞质域在存在（黑条）或不存在（灰条）ATP的情况下进行体外Src磷酸化反应。这个年-轴显示下拉复合物中结合的β-catenin与N-cadherin细胞质结构域的比率。*，学生的t吨p>0.1检验表明，磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的β-catenin结合水平没有显著差异。数据表示平均值±SD（n=3）。（C） 不同经典钙粘蛋白核心β-连环蛋白结合区的保护。人类N-钙粘蛋白的Tyr-852和Tyr-860以及其他钙粘蛋白序列中的相应残基以粗体显示。实线表示通过x射线晶体学鉴定的小鼠E-钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物中的核心相互作用区域(Huber和Weis，2001年). 虚线表示通过肽竞争在N-钙粘蛋白中识别的核心区域(徐等., 2002). *, VE-cadherin–β-catenin相互作用所必需的酪氨酸残基(波特等., 2005)。

N-钙粘蛋白Y860F突变对透射电镜的抑制作用

为了进一步证明Y860的磷酸化是TEM期间β-catenin解离的原因，用myc标记的野生型N-钙粘蛋白构建物或myc标记突变体（Y860F）N-钙粘素构建物瞬时转染黑色素瘤细胞。进行免疫印迹分析以确定myc标记的N-钙粘蛋白的表达(图7A). 免疫染色结果显示，通常只有10-15%的转染细胞表达myc标记蛋白。

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突变N-cadherin表达对黑色素瘤细胞β-catenin分离和TEM的影响。（A） 用myc标记的野生型或突变型（Y860F）N-cadherin瞬时转染WM239细胞。免疫印迹分析证实myc标记蛋白的表达。箭头表示内源性N-钙粘蛋白，箭头表示myc标记的野生型N-钙粘素（通道2）或myc标记突变型N-cadherin（通道3）的表达。控制单元显示在通道1中。（B） 转染物与内皮单层共培养5小时，然后固定，并使用myc单克隆抗体和兔抗β-连环蛋白抗体进行双重染色。Myc染色用于鉴定转染细胞（星号），共聚焦图像仅显示β-catenin染色：表达Myc标记的突变型N-cadherin（a）的黑色素瘤细胞和表达Myc标签的野生型N-cadtherin（b）的黑素瘤细胞。箭头表示转染剂和内皮细胞之间的异型接触。棒材，10μm。（C） 用野生型N-cadherin-myc或突变型N-cadherin-myc瞬时转染黑色素瘤细胞，并以3:1的比例与内皮单层细胞共培养。在0或5小时收集样本，用抗myc抗体进行免疫沉淀。用抗β-连环蛋白、N-钙粘蛋白和磷酸酪氨酸的抗体探测免疫沉淀物的蛋白印迹。pTyr阳性带对应于myc标记的N-钙粘蛋白。（D）瞬时表达野生型或突变myc标记N-钙粘素的转基因细胞接受TEM分析。在共培养5小时时对myc阳性细胞的迁移进行评分。数据表示平均值±SD（n=3）。

两种转染剂均与内皮细胞共培养，并染色myc和β-catenin(图7B). Myc-染色可对转染的黑色素瘤细胞进行阳性鉴定。与亲本WM239细胞相似(图1A)野生型N-钙粘蛋白转染物在黑色素瘤细胞与其周围内皮细胞的异型接触处显示出很少的β-连环蛋白染色，而核β-连环素染色明显。相反，表达Y860F突变体N-cadherin的转染体在异型接触区显示出显著的β-连环蛋白染色，但在细胞核中几乎没有β-连环素染色。

为了进一步分析N-cadherin–myc复合物，将瞬时转染的黑色素瘤细胞以3:1的细胞比例培养在内皮单层上，以便能够免疫沉淀足够的myc标记的N-cadherin用于免疫印迹研究。共培养5小时后，野生型N-钙粘蛋白-myc被磷酸化，β-连环蛋白水平降低与复合物有关(图7C)，模式与WM239细胞相似(图1B). 相反，Y860F N-钙粘蛋白-myc在共培养5小时时显示酪氨酸磷酸化降低，但对β-连环蛋白的分离没有影响。

为了评估突变的N-钙粘蛋白对TEM的影响，在内皮单层上培养瞬时表达野生型N-钙粘素-myc或突变的N-钙粘素-mmy的黑色素瘤细胞。对固定标本进行myc双重免疫染色，以鉴定转染的黑色素瘤细胞和β-catenin，以显示内皮细胞。只对myc阳性的黑色素瘤细胞进行评分。与转染载体或野生型N-cadherin-myc构建物的细胞相比，表达突变N-cadherin的黑色素瘤细胞的迁移细胞数量减少了约50%(图7D). 结合体外数据，这些结果表明，在黑色素瘤细胞TEM期间，N-钙粘蛋白上的Y860磷酸化导致β-连环蛋白分离。

讨论

在本文中，我们提供证据表明，一个或多个Src家族激酶参与了黑色素瘤细胞TEM期间N-钙粘蛋白介导的细胞粘附和信号的调节。具体来说，我们发现Src定位于异型接触，当黑色素瘤细胞在内皮细胞上迁移时，Src被激活。N-cadherin的细胞质域是Src的体外底物，N-cadherin中Tyr-860的磷酸化破坏了β-catenin结合，而黑色素瘤细胞中带有Y860F突变的N-cadherin的过度表达具有显性负效应。

原癌基因c-Src属于非受体酪氨酸激酶的Src家族，其中Src最常与肿瘤进展相关(框架，2002；Summy和Gallick，2003年；Yeatman，2004年). 众所周知，Src可以促进细胞增殖、存活、粘附、运动、侵袭性和血管生成。因为Src在许多信号转导途径中起着关键作用，所以Src的高表达或活性与癌症远处转移有关(博伊尔等., 2002；Myoui公司等., 2003)。

与TEM中Src参与的概念一致，SFK抑制剂PP2或DN Src的过表达抑制β-连环蛋白的解离和信号传导。黑色素瘤细胞的迁移能力也受到影响。然而，PP2和DN-Src都抑制Src家族的其他激酶。一些报告表明，SFK，如Fyn和Yes，也可能调节钙粘蛋白介导的粘附(欧文斯等., 2000；皮埃德拉等., 2003). 因此，我们不能排除Src以外的SFK在黑色素瘤细胞TEM中的潜在参与。

值得注意的是，我们的结果表明，内源性Src在TEM期间被严格调控激活。从细胞附着的初始阶段起，Src就与黑色素瘤细胞及其周围内皮细胞之间的异型接触有关。但激活的Src只有在黑色素瘤细胞穿透内皮连接处的异型接触中才能检测到。Src激活的时间与N-钙粘蛋白的磷酸化和β-连环蛋白从异型接触中的分离密切相关(气等., 2005)。

结构研究表明，Src包含一个N末端肉豆蔻酰化位点，该位点将其连接到内质膜，两个Src同源结构域（SH3和SH2），一个酪氨酸激酶结构域和一个C末端尾部(徐等1999年). Src活性由磷酸化和涉及SH2和SH3结构域的分子内相互作用调节(框架，2002). Tyr-527的磷酸化导致Src的C末端区域与其SH2结构域结合，从而产生“封闭”和非活性构象。已知Src通过细胞中的多种机制激活，例如分子内置换、Tyr-527的去磷酸化和Tyr-416的磷酸化(框架，2002；Yeatman，2004年). 免疫印迹分析表明，与异型接触相关的至少一部分Src在Tyr-416处磷酸化。一些蛋白激酶和磷酸酶已被发现与钙粘蛋白复合物有关(布雷迪·卡尔内等., 1995；Lilien和Balsamo，2005年). 然而，目前尚不清楚在TEM期间哪些基因参与了Src的激活，也不知道黑色素瘤细胞和内皮细胞之间的异型相互作用如何导致Src激活。

Src被认为可以调节细胞间相互作用的动力学(框架，2002). Src激酶活性的增加通常导致钙粘蛋白粘附功能的下调(Gumbiner，2000年；欧文斯等., 2000；弗罗贝尔等., 2004). 然而，钙粘蛋白粘附复合体中Src底物的身份仍有争议。我们的体外和细胞培养研究表明，N-钙粘蛋白是活化Src的直接底物。N-钙粘蛋白的磷酸化似乎是一个高度特异性的事件，因为在与N-钙粘素共同免疫沉淀的其他蛋白质中未检测到磷酸化酪氨酸。

在大多数细胞中，N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白在酪氨酸残基上没有磷酸化或磷酸化较弱(松吉等., 1992；贝伦斯等., 1993；滨口等., 1993；芝本等., 1994)尽管在结肠癌细胞中转染活性c-Src（Src531）会导致N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化，但不会导致β-连环蛋白(Irby和Yeatman，2002年). 与经典的I型钙粘蛋白相反，VE型钙粘蛋白，一种经典的II型钙粘蛋白，可以被严重酪氨酸磷酸化(兰普尼亚尼等., 1997；埃塞尔等., 1998). 血管内皮生长因子对Src的激活诱导VE钙粘蛋白和β-连环蛋白的酪氨酸磷酸化，导致VE钙粘蛋白与β-连环蛋白相互作用的破坏（Weis等.,2004年a,b条). 有趣的是，VE-cadherin的去磷酸化与细胞接触完整性的增强相关，而β-catenin的去磷酸(纳鲁特等., 2002). 后一个观察结果与我们的发现一致，即N-钙粘蛋白的磷酸化状态调节其与β-连环蛋白的相互作用。

我们的研究结果强调了N-钙粘蛋白的Tyr-860在β-catenin结合中的关键作用。结晶研究表明，小鼠E-cadherin胞质结构域与β-catenin之间的相互作用界面广泛，涉及β-catening犰狳重复序列的全长和E-cadherin胞质结构区的C末端100残基(Huber和Weis，2001年). 然而，经典I钙粘蛋白中保守的核心区域似乎对E-钙粘蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用至关重要。人类N-钙粘蛋白的Tyr-852和Tyr-860都位于该区域(图6C). 紧邻这两个酪氨酸残基的分别是天冬氨酸和谷氨酸，它们与β-catenin中的两个赖氨酸残基形成盐桥有关。将两个β-连环蛋白赖氨酸残基中的任何一个突变为谷氨酸会破坏与钙粘蛋白的结合，表明这两个离子键在钙粘蛋白-β-连环素相互作用中的重要作用(格雷厄姆等., 2000). 另一方面，Tyr-860位于N-钙粘蛋白核心β-catenin结合位点的中间，这已由肽竞争研究确定(莉莲等., 2002). 可以想象，N-钙粘蛋白中Tyr-860的磷酸化可能通过引入干扰相邻盐桥的负电荷干扰与β-catenin的结合。尽管这种酪氨酸残基在VE-cadherin中是保守的，但最近的一份报告表明，它并不参与β-catenin与VE-cadherin的结合(波特等., 2005). 相反，发现其N端前面的酪氨酸残基一个氨基酸在磷酸化后导致β-连环蛋白解离(图6C). 然而，这种酪氨酸在经典I钙粘蛋白中不存在。在VE-cadherin和经典I钙粘蛋白之间的β-catenin结合区也观察到氨基酸组成的其他差异。这些差异可能解释了β-catenin与经典I和经典II钙粘蛋白相互作用的分子细节的差异。

当β-连环蛋白不与钙粘蛋白结合时，它将被细胞质中的GSK3β–APC–Axin复合物螯合，并被靶向降解(Jamora和Fuchs，2002年). 相反，我们发现在0-和5-h共培养期间，β-catenin的总水平没有变化(气等., 2005)这表明分离的β-catenin存在稳定机制。GSK3β具有组成活性，但可被Wnt或生长因子快速抑制。然而，Wnt和生长因子等可溶性因子可能不参与TEM期间β-catenin的稳定，因为共培养条件培养基对黑色素瘤细胞或内皮细胞中的β-catentin水平几乎没有影响（Qi和Siu，未发表数据）。我们推测，Src的激活可能提供了一种潜在的机制来稳定从N-钙粘蛋白释放的β-连环蛋白。已知Src可激活丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶途径(佩努埃尔和马丁，1999年). 最近的一些报道表明，这两种途径都可以导致GSK3β在Ser-9的磷酸化，并使其酶活性失活，从而抑制β-连环蛋白的降解(桥本等., 2002；丁等., 2005；毛帕斯·施瓦尔姆等., 2005). 在黑色素瘤细胞的TEM过程中，确定这两种途径中的一种或两种是否参与β-连环蛋白的稳定是有意义的。

当β-连环蛋白从N-钙粘蛋白黏附复合体中分离出来时，它开始在细胞核中积累并激活迁移的黑色素瘤细胞中的基因转录。核β-连环蛋白在结肠癌细胞浸润前沿也经常被观察到(布拉伯茨等., 2001；亨德梅耶等., 2004)提示β-catenin信号可能参与侵袭。在已知的β-连环蛋白靶基因中，有一些编码参与癌细胞侵袭过程的蛋白质，如CD44(维埃伦加等., 1999)，尿激酶纤溶酶原激活剂(亨德梅耶等., 2004)，尿激酶型纤溶酶原激活物受体(曼恩等., 1999)，基质金属蛋白酶（MMP）-7(布拉伯茨等., 1999)和膜型基质1-MMP(高桥等., 2002). 侵袭相关基因的上调可能通过促进基底膜的侵袭来增强迁移过程。随着涉及肿瘤细胞渗出的主要信号通路的分子细节被阐明，现在为预防转移的治疗方法的未来发展开辟了新的可能性。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢Rama Khokha博士和Jaro Sodek博士的宝贵建议和讨论。质谱分析由Ling Xu博士和Ying Yang博士（加拿大安大略省多伦多市多伦多大学医学院质谱实验室）进行。这项工作得到了加拿大卫生研究院的运营拨款（MT-14703）的支持。J.Q.是诺诺入学奖学金和多伦多大学公开奖学金的获得者。J.W.获得了中华人民共和国山东省研究委员会的奖学金。

笔记

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E05–10–0927)2005年12月21日。

缩写词：CAM，细胞粘附分子；人肺微血管内皮细胞；MALDI-TOF，矩阵辅助激光解吸电离/飞行时间；Src家族激酶；TEM，内皮细胞迁移。

D⃞本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org)。

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文章来自细胞的分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会