基因调控区CpG二核苷酸甲基化是转录表观遗传调控的重要标志(2). 由于DNA甲基化在细胞分裂期间传递给子细胞，这些甲基CpG标记可以在发育过程中保持并提供表观遗传记忆(31). 在人类基因组中已经鉴定出许多蛋白质，它们可以通过甲基CpG结合域（MBD）与甲基化CpG残基特异结合(15,39). 将这些蛋白质招募到含有富含甲基化CpG-的拉伸-CpG岛的启动子，被认为会导致染色质结构的调节和转录的抑制。人类基因组编码五种MBD蛋白：MeCP2和MBD1至-4(6,14,23). 除MBD3外，这些蛋白质已被证明具有特定的甲基CpG结合活性。最近，一种新蛋白Kaiso被鉴定为甲基CpG结合蛋白，尽管该蛋白缺乏经典MBD，但似乎通过锌指结构域与甲基化DNA特异结合(30).
据报道，一些MBD蛋白与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）以及组蛋白甲基转移酶相互作用。MeCP2被描述为与Sin3/HDAC共升压复合物相互作用(18)和梵天(13)以及组蛋白H3赖氨酸-9甲基转移酶Suvar 3-9(12)，尽管这些相互作用可能不稳定，因为MeCP2主要作为单体存在于细胞内(12,18,19,26). MBD2和MBD3已被鉴定为Mi-2/NuRD复合物的核心亚单位(9,27)而Kaiso是含HDAC的N-CoR复合体的一部分，在核激素受体的转录调节中起重要作用(27,42,44). 总之，这些发现表明DNA甲基化、组蛋白脱乙酰化和组蛋白甲基化之间存在功能联系，并表明这些表观遗传事件在功能上协同调节转录和细胞记忆。
MBD2和MBD3均被描述为Mi-2/NuRD复合物的亚单位。有人提出，具有甲基CpG结合活性的MBD2用于将含有MBD3的Mi-2/NuRD复合物招募到甲基化启动子(44). 然而，对小鼠的敲除研究表明，MBD2和MBD3具有不同的非重叠功能：敲除MBD3会导致胚胎死亡，而敲除MBD2的小鼠是可行的，并且显示出相对细微的缺陷(16). 有趣的是，Sansom及其同事最近表明，MBD2的缺失可以防止肠道肿瘤的发生(32). 因此，尽管生化证据表明MBD2和MBD3是同一复合物的一部分，但敲除研究表明这两种蛋白都具有特定或部分重叠的功能。
为了深入了解MBD2和MBD3的蛋白质组成和功能，我们建立了稳定的细胞系，表达这些蛋白的标记版本。蛋白质复合物的纯化表明，MBD2和MBD3不是铜提纯的，而是相互排斥的。除了已知的Mi-2/NuRD亚基外，一种名为DOC-1的12kDa蛋白被鉴定为MBD3和MBD2复合物的新核心亚基。此外，发现PRMT5及其相关辅因子MEP50在体外与MBD2进行铜提纯和甲基化。最后，体内显示，PRMT5及其H4R3组蛋白甲基转移酶活性与MBD2以甲基化敏感的方式被招募到CpG岛，这表明精氨酸甲基转移酶在MBD2的抑制中发挥了意想不到的作用。总之，这些发现提供了证据，证明MBD2/NuRD和MBD3/NuRD定义了两种不同的蛋白质复合物，具有不同的生化和功能特性。
材料和方法
构造。
将编码带有EcoRI悬挑的Myc表位的寡核苷酸pRAV-myc1f和pRAV-myc1r克隆到pRAV-FLAG的EcoRI-消化载体片段中(20)生成pRAV-myc。该载体的EcoRI/BamHI片段包含一个ProtA结构域、两个烟草蚀刻病毒（TEV）裂解位点和一个myc表位，然后与EcoRI/BamHI消化载体pZ-1-N（Cellzome）连接以生成逆转录病毒载体pZXN。用MBD3质粒（RZPD）和MBD2质粒（图像克隆收集）中的EcoRI和XhoI悬液对缺乏RG延伸的MBD3、MBD2和MBD2进行PCR扩增，然后将其连接到EcoRI/XhoI消化载体pZXN中。
为了创建Strep-tagII（2TEV）Myc 2×血凝素（HA）盒，使用包含EcoRI位点和Strep-tag II表位的正向引物和包含EcoRI悬挑和两个HA位点的反向引物对pZXN的2TEV-Myc盒进行PCR扩增。将该片段连接到EcoRI消化载体psg5-HA TBP中。用含有BamHI限制性位点的正向引物和含有一个新HA表位和一个NotI限制性位点的反向引物再次对盒进行PCR扩增。该PCR产物用BamHI和NotI酶切，并连接到BamHI/NotI酶切质粒pcDNA5/FRT/TO/C-TAP（Bernard Luscher的礼物）中，生成pcDNA5/RRT/TO/stII（2TEV）myc tripleHA。MBD2用含有NotI和Xho1限制性位点的引物进行PCR扩增，并连接到pcDNA5/FRT/TO/stII（2TEV）myc tripleHA的NotI和XhoI位点。
在质粒pGEX2T（Amersham Pharmacia Biotech）中克隆了一个编码MBD2 RG延伸部分的片段（EGARGGGRGR），该片段包含BamHI和EcoRI悬挑。用含有BamHI和EcoRI外伸的引物PCR扩增全长MBD2、缺乏RG延伸的MBD和MBD3，并将其克隆在BamHI/EcoRI消化的pGEX2T中。可根据要求提供引物序列。
细胞培养和稳定细胞系。
MCF7、HEK 293、HeLa、Phoenix和293 FLP细胞保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Invitrogen）中，该培养基补充有10%的胎牛血清、100μg/ml青霉素和100 U链霉素/ml（Invit罗gen），37°C，5%CO2对于5-氮杂-2′-脱氧胞苷（AzaDc）处理，低密度接种MCF7细胞，并用1μM AzaDc72小时处理。根据以下程序生成逆转录病毒稳定细胞系。Phoenix两用包装电池（2.5×106细胞）接种在9厘米培养皿上，24小时后用20μg逆转录病毒质粒pZXN-MBD2a或pZXN-MBD2转染，缺乏RG拉伸或pZXN-MBD3，使用磷酸钙法。48小时后，通过0.22μm孔径过滤器过滤含病毒上清液。HeLa或293细胞（105每种）接种在六孔板中，并在8μg/ml Polybrene存在下用3ml过滤病毒上清液转导两轮感染，共24小时。然后在正常培养基中培养细胞24小时。然后用1μg/ml嘌呤霉素选择多克隆细胞群。然后选择克隆，隔离生长，并筛选重组蛋白表达。
根据以下程序生成了一个表达标记MBD2和MBD3的双稳定细胞系。使用磷酸钙法在9 cm培养皿上转染293个FLP细胞，培养皿中含有2μg pcDNA5/FRT/TO/stII（2TEV）myc tripleHA-MBD2和18μg POG44。36 h后用100μg/ml潮霉素筛选细胞。随后，衍生克隆并筛选重组蛋白表达和促癌素敏感性。然后用含有pZXN-MBD3的病毒转导一个好的克隆，并用100μg/ml潮霉素和1μg/ml嘌呤霉素进行双重筛选。
蛋白质纯化。
将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（420 mM KCl、20%甘油、20 mM HEPES、pH 7.9、0.2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.1%Triton X-100、10 mMβ-巯基乙醇、1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]和完整蛋白酶抑制剂[Roche]），并用B型杵进行20次搅拌均质。然后将提取物在4°C的转轮中培养1小时，以提取核蛋白。随后在100000×克.对全细胞提取物进行校准、速冻，并在−80°C下储存，直至进一步使用。
用2体积的结合缓冲液（150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1%NP-40、1 mM二硫苏糖醇[DTT]、1 mM-PMSF和完整蛋白酶抑制剂[Roche]）稀释来自串联亲和纯化（TAP）标记细胞系的全细胞提取物，然后用免疫球蛋白G（IgG）Sepharose珠培养（法玛西亚）在旋转轮中在4°C的温度下保持2小时。然后用10粒体积的洗涤缓冲液（500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.5%NP-40、1 mM DTT和1 mM PMSF）洗涤珠子三次，用10粒容量的TEV裂解缓冲液（150 mM NaCl、20 mmM Tris-HCl、pH值8.0、0.1%NP-40，1 mM DTT和0.5 mM EDTA）洗涤两次。然后将珠再次悬浮在含有TEV蛋白酶的1珠体积TEV裂解缓冲液中，并在4°C的转轮中培养过夜。TEV洗脱液用蛋白A珠（Pharmacia）预先洗脱，然后用Myc抗体（9E11）进行免疫沉淀。免疫沉淀物用10粒体积的洗涤缓冲液洗涤三次，用10粒容量的肽洗脱缓冲液洗涤两次（100 mM KCl、20%甘油、20 mM HEPES KOH、pH 7.9、0.2 mM EDTA、0.1%NP-40、5 mM DTT和0.5 mM PMSF）。通过在含有2 mg/ml Myc肽的肽洗脱缓冲液中在28°C温度下在热交换器中培养30分钟，从珠中洗脱蛋白质复合物。洗脱步骤进行两次，将两种洗脱液混合。
在与TAP标记程序类似的严格条件下，使用HeLa核提取物进行内源性免疫沉淀分析。使用的抗体为MBD3（日本IBL）和MBD2 07-198（上游生物技术）。
通过液相色谱-串联质谱（MS/MS）进行蛋白质分析。
将纯化的蛋白质复合物装载在十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上，并短暂运行以去除洗涤剂和用于洗脱的多余肽。然后固定凝胶通道，切成小块，随后还原并烷基化。蛋白质用胰蛋白酶（Promega）消化过夜，然后用三氟乙酸从凝胶中洗脱。肽鉴定实验使用纳米高压液相色谱安捷伦1100纳米流系统进行，该系统与7-Tesla线性四极离子阱傅里叶变换（FT）质谱仪（德国不来梅热电公司）在线连接，基本如前所述(28).
ChIP分析。
MCF7细胞在室温下用1%甲醛交联15分钟，染色质如前所述制备(3,41)但不包括CsCl纯化。染色质被超声检测到平均大小为500 bp。来自100万个细胞的染色质用于孵育缓冲液中的每次免疫沉淀（1%Triton X-100、150 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0、0.5 mM EGTA、pH值8.0、10 mM Tris、pH值9.0、1 mg/ml牛血清白蛋白和蛋白酶抑制剂）。以下抗体的四微克用于免疫沉淀：PRMT5 12-303（Upstate Biotechnology）、MBD2 IMG-147（Imgenex）、MBD3（IBL，日本）、MTA2 PC656（Ongene）和抗二甲基孕酮H4（Arg3）（07-213）（Upstate-Biotechtology）。在4°C下培养过夜后，用0.1%SDS、1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸盐、0.15 M NaCl、1 mM EDTA、10 mM Tris（pH 8.0）、0.5 mM EGTA清洗免疫沉淀两次；一次使用0.1%SDS、1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸盐、0.5 M NaCl、1 mM EDTA、10 mM Tris（pH 8.0）、0.5 mM EGTA；一次使用0.25 M氯化锂、0.5%脱氧胆酸盐、0.5%NP-40、1 mM EDTA、10 mM Tris（pH 8.0）、0.5 mM EGTA；使用1 mM EDTA、10 mM Tris（pH 8.0）和0.5 mM EGTA进行两次。通过添加1%十二烷基硫酸钠和0.1 M NaHCO从小球中洗脱免疫复合物3然后在室温下培养15分钟。蛋白质-DNA交联在65°C的0.2 M NaCl中逆转4小时，然后通过酚氯仿萃取分离DNA。进行实时定量PCR分析，以评估蛋白向特定位点的募集。相对占用率是根据特定CpG岛的恢复百分比与对照BMX区域的恢复百分比得出的。然后根据三个独立的染色质分离物进行的染色质免疫沉淀（ChIP）实验计算平均值和标准偏差。
体外甲基化试验。
将来自MBD2稳定细胞系或野生型HEK 293细胞的全细胞提取物用3体积的IPP150（150 mM NaCl、20 mM Tris HCl、pH 8.0、0.1%NP-40、1 mM DTT和1 mM PMSF）稀释，并在4°C的转轮中用IgG Sepharose珠培养2 h。用10粒体积的IPP150清洗珠子三次，然后用1粒体积的PRMT5培养缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.6，500 mM NaCl，1 mM MgCl2)存在0.25μCiS公司-[14C] 腺苷蛋氨酸（Amersham）。谷胱甘肽S公司-如前所述，表达并纯化转移酶（GST）-PAH2、GST-MBD2、缺乏RG拉伸的GST-MBD2、GST-MBD3和GST-EGARGGGRGR(22). 这些纯化的蛋白质在添加0.25μCi的PRMT5培养缓冲液中培养S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸（Amersham）存在于纯化的MBD2复合物或纯化的黑腹果蝇PRMT5/MEP50/USP7高富集馏分(37). 在30°C下孵育2小时后，在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。然后干燥凝胶并将其暴露在磷化屏（Bio-Rad）上以鉴定甲基化蛋白质。
结果
纯化TAP标记的MBD2和MBD3。
生成稳定表达MBD2和MBD3标记版本的人胚胎肾（HEK 293）细胞，以确定其亚单位组成。从这些细胞系中提取的全细胞提取物的凝胶过滤分析表明，这两种蛋白质都存在于约1到1.5 MDa的高分子量部分中（图。).
TAP-MBD2和TAP-MBD3组装成功能类似Mi-2/NuRD的复合体。（A） 来自表达TAP-MBD2或TAP-MBD3的稳定细胞系的全细胞提取物的超6凝胶过滤。使用ProtA抗体通过Western blotting分析组分。列的空隙显示在分数7和8之间。（B） 重组组蛋白重组的核糖体模板被乙酰化酿酒酵母SAGA或NuA4复合物，随后在不存在或存在胰蛋白酶大豆琼脂的情况下与TAP-MBD2或TAP-MBD3复合物孵育(38). H3或H4乙酰化的量分别使用双乙酰化组蛋白H3 Lys-9、14或四乙酰化H4的抗体通过Western blotting测定。MBD2和MBD3复合物与核小体模板的结合通过使用Myc和HDAC2抗体的Western blotting进行测定。（C） 如前所述，在GAM12探针上使用纯化的MBD2和MBD3复合物进行电泳迁移率变化分析(27). 移动的甲基化探针用箭头表示。自由探头用星号表示。
为了评估纯化的复合物是否具有酶活性，我们对SAGA和NuA4复合物乙酰化的核小体模板进行了脱乙酰化分析(38). MBD2和MBD3蛋白复合物对组蛋白H3和组蛋白H4显示出强大的曲古抑菌素A敏感性去乙酰化活性（图。). 为了进一步研究纯化复合物的功能，使用甲基化DNA探针进行电泳迁移率变化分析，结果表明只有MBD2复合物能够与甲基化DNA结合。正如之前报道的那样，尽管存在高度保守的MBD，但MBD3对甲基化DNA没有亲和力(40)（图。，比较车道2和4）。
MBD2和MBD3相互排斥。
先前的研究报告称MBD2和MBD3是同一复合物的一部分(9). 纯化MBD2和MBD3复合物的银染显示MBD2制剂中缺少约35kDa的蛋白质（图。，用箭头标记）。Western blotting鉴定该蛋白为MBD3，并揭示MBD2复合物中不存在MBD3（图。，比较车道1和2）。MBD2制剂中MBD3的缺乏不能用293细胞中内源性MBD3缺乏来解释（图。，车道3）。这些数据表明，MBD2和MBD3不是同一复合体的一部分，但它们甚至可能相互排斥。然而，如果MBD2和MBD3作为异二聚体存在于Mi-2/NuRD复合物中，则MBD之一的过表达可能导致从MBD2/MBD3异二聚体群体向MBD2/MBD2或MBD3/MBD3同源二聚体群体的转移。为了评估这种可能性，我们建立了一个稳定的表达MBD2和MBD3的细胞系，该细胞系具有不同的标记组合。MBD3用ProtA结构域和Myc表位标记，而MBD2用Strep-tagII和HA表位标记。Western blotting显示这两种蛋白都在稳定的细胞系中表达（图。，车道6）。在IgG珠上纯化ProtA-Myc-MBD3导致MBD3的纯化（图。，车道3）；在免疫沉淀中未检测到标记的MBD2。类似地，在链球菌凝集素珠上纯化Strep-tagII-HA-MBD2a导致MBD2纯化，而ProtA-Myc-MBD3没有铜纯化（图。，车道1）。HDAC1与标记的MBD2和MBD3共纯化，表明这两种标记的蛋白质在功能复合物中组装。为了进一步证实这些观察结果，对HeLa细胞中内源性MBD2和MBD3进行了免疫沉淀实验（图。). MBD2的免疫沉淀导致MBD2纯化，但MBD3未纯化。类似地，MBD3的免疫沉淀导致两种多肽的纯化，而MBD2没有铜纯化。基于它们的相对迁移，我们推测这两种多肽是MBD3和缺乏MBD的较小变体MBD3L2。总之，这些实验强烈表明MBD2和MBD3是互斥的。
MBD2和MBD3相互排斥。（A） 来自HEK 293细胞的纯化的MBD2和MBD3复合物的银染凝胶。MBD3用箭头表示。（B） 使用MBD3抗体通过Western blotting分析纯化的TAP-MBD2和TAP-MBD3复合物以及从HEK 293或HeLa细胞中提取的全细胞提取物。（C） 分别使用Strep-tachin或IgG珠免疫沉淀MBD2和MBD3。途径：1、对stII-3HA-MBD2-ProtA-Myc-MBD3提取物进行链霉菌纯化；2、HEK 293野生型提取物的链球菌纯化；3、用stII-3HA-MBD2 ProtA-Myc-MBD3提取物纯化IgG；4、用HEK 293野生型提取物纯化IgG；5、输入HEK 293提取物；6，输入stII-3HA-MBD2 ProtA-Myc-MBD3提取物。用HA或ProtA抗体通过Western blotting分析洗脱的蛋白质。用HDAC1抗体探测印迹显示HDAC1与MBD2和MBD3共沉淀。（D） 内源性MBD2和MDB3的免疫沉淀。使用针对MBD3（IBL，日本）或MBD2（Upstate Biotechnology）的抗体对HeLa细胞的全细胞提取物进行免疫沉淀。使用相同的抗体进行蛋白质印迹。
纯化MBD2和MBD3复合物的FT-MS/MS分析。
为了进一步表征纯化的MBD2和MBD3复合物，进行了液相色谱FT-ICR MS分析（表). 与上述结果一致，MBD2复合物不含MBD3，反之亦然，证实并扩展了我们的结论，即MBD2和MBD3在293细胞中是互斥的。为了明确确定观察到的MBD2和MBD3的互斥性是否对293细胞具有特异性，或者在其他细胞中是否也具有特异性。从该细胞系纯化MBD3后，纯化出一种缺乏MBD2的Mi-2/NuRD复合物，这表明在HeLa细胞中，MBD2和MBD3也是互斥的（未公布的数据）。
表1。
纯化MBD2和MBD3复合物的FT-MS/MS分析
| 蛋白质特性 | 纯化（HEK 293细胞）
|
|---|
MBD2型
| 百万分之三
|
|---|
| 肽的数量 | %序列覆盖率 | 肽的数量 | %序列覆盖率 |
|---|
| 米-2 CHD4 | 163 | 50 | 123 | 43 |
| Mi-2 CHD3 | 65 | 25 | 48 | 22 |
| MTA1公司 | 72 | 60 | 39 | 44 |
| MTA1变体 | 54 | 61 | 28 | 48 |
| MTA2型 | 29 | 65 | 42 | 56 |
| MTA3型 | 46 | 51 | 28 | 36 |
| MTA3拼接变体 | 21 | 57 | 16 | 49 |
| P66α | 41 | 55 | 42 | 59 |
| P66β | 57 | 65 | 44 | 58 |
| HDAC1型 | 40 | 50 | 22 | 35 |
| HDAC2型 | 49 | 44 | 35 | 45 |
| RbAp46型 | 22 | 41 | 18 | 34 |
| Ap48卢比 | 18 | 37 | 17 | 43 |
| 文件-1 | 3 | 36 | 3 | 36 |
| MBD3型 | | | 18 | 41 |
| MBD2a型 | 35 | 58 | | |
| PRMT5项目 | 18 | 30 | | |
| MEP50型 | 7 | 21 | | |
| 进口蛋白α-6亚基 | 3 | 6 | | |
| 进口蛋白α-5亚基 | 3 | 5 | | |
| 进口蛋白α-4亚单位 | 5 | 7 | | |
在293个细胞中，MBD2和MBD3复合物中均鉴定出Mi-2α和Mi-2β。Schreiber实验室先前已将这些蛋白质分别鉴定为Mi-2/NuRD组分CHD3和CHD4(35). 目前，我们不知道这两种亚型是否正在形成异二聚体，或者Mi-2α和Mi-2β是否组装成不同的复合物。在这两种配合物中，RbAp48和-46以及核小体脱乙酰化活性的催化模块HDAC1和-2都被鉴定出来。此外，如前所述，在这两种复合物中都鉴定出高度相关的p66α和p66β蛋白(5). 我们没有发现与组蛋白去甲基化酶LSD1相匹配的肽，据报道，该酶与Mi-2/NuRD复合物相互作用(34). 一种称为cdk2-associated protein 1的12-kDa蛋白被鉴定为MBD2和MBD3复合物的新型Mi-2/NuRD成分。cdk2-associated protein 1或DOC-1（在口腔癌1中缺失）是一种推定的肿瘤抑制因子，据报道在口腔癌发生和结肠癌过程中被灭活(36,43). 此外，MBD2而非MBD3洗脱液含有大量与精氨酸甲基转移酶PRMT5及其相关蛋白MEP50匹配的肽。最后，鉴定了几种与不同重要蛋白α核转运蛋白相匹配的肽。这些蛋白在MBD3复合物中缺失，表明与MBD2存在特异性相互作用。MBD2与重要蛋白的结合可能表明MBD2在细胞质和细胞核之间穿梭。
引人注目的是，在MBD2和MBD3复合物中发现了所有三种MTA蛋白，即MTA1、-2和-3，以及两种MTA剪接变体（表). 研究表明，MTA蛋白表现出组织特异性差异表达，从而产生不同的Mi-2/NuRD复合物(4,11,21,44). 令人惊讶的是，在所有主要的NuRD亚基中都发现了大量不同的翻译后修饰（未发表的数据）。先前的研究描述了Mi-2α、Mi-2β、p66α、p66β、HDAC1和HDAC2的磷酸化位点(1). 我们证实了NuRD复合体中存在这些磷酸化位点，并且在后者以及MBD2、MTA1、MTA2和MTA3中发现了过多的新位点。在保守结构域中检测到一些翻译后修饰，因此这些修饰可能在调节蛋白-蛋白质或蛋白-DNA相互作用或微调酶活性中发挥作用。此外，约90%的这些修饰发生在高度保守的残基中，支持这些修饰在整个进化过程中的作用。
PRMT5与二甲基化物MBD2结合并对称。
通过FT-MS/MS在MBD2复合物中检测到PRMT5，但MBD3肽洗脱液中没有PRMT5。). 对MBD2复合物亚基的氨基酸序列的检查表明，MBD2具有较长的RG重复序列N末端延伸至MBD（图。)而RG重复序列在MBD3或其他亚单位中不存在。因为RG基序是PRMT5的底物(10)，我们测试了MBD2 RG拉伸是否是PRMT5的基板。在存在的情况下培养纯化的MBD2复合物S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸导致单一放射性带在凝胶中TAP标记的MBD2位置迁移（图。). 为了证实这些观察结果，我们将全长MBD2或MBD2的RG延伸融合到GST，并测试含有PRMT5的纯化MBD2复合物是否可以甲基化这些融合蛋白。如图中左侧面板所示。MBD2复合物能够特异地甲基化这些重组底物，但不能作为GST-PAH2对照。为了评估PRMT5是否特异性地甲基化MBD2的RG延伸，缺少RG延伸的MBD2或MBD3融合到GST并与纯化MBD2复合物孵育。如图中右侧面板所示。MBD2复合物能够特异性地甲基化MBD2的RG延伸，但MBD3或MBD2缺乏RG延伸。使用纯化的含PRMT5的馏分控制甲基化反应果蝇属显示出与MBD2复合物类似的活性，从而证实了该试验中PRMT5的特异性。此外，在纯化MBD2复合物的FT-MS/MS运行中对翻译后修饰肽的搜索确实发现了一个含有三个二甲基精氨酸残基的肽（未公布的数据）。综上所述，这些实验强烈表明，PRMT5甲基化MBD2上位于RG丰富氨基酸中的几个精氨酸残基上的MBD2在体外紧靠MBD2的MBD上游延伸。
PRMT5与MBD2的N-末端RG-丰富重复序列相互作用并甲基化。（A） 纯化的TAP-MBD2和TAP-MBD3复合物使用PRMT5抗体通过Western blotting进行分析。（B） 带有RG重复序列的MBD2序列带下划线。（C） 纯化MBD2复合物与S公司-[14C] 腺苷蛋氨酸。甲基化蛋白质用箭头表示。自由标签用星号表示。使用IgG珠纯化MBD2复合物。左侧面板描述了纯化MBD2复合物的Western blot分析，或使用抗ProtA-辣根过氧化物酶抗体的293对照纯化。箭头显示TAP标记的MBD2。（D） （左面板）重组GST-RG（n）和GST-MBD2的体外甲基化S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸和纯化的PRMT5/MEP50馏分（中间面板）或纯化的MBD2复合物（顶部面板）。GST-PAH2作为阴性对照。（右面板）重组GST-RG（n）、缺乏RG拉伸的GST-MBD2和存在S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸和纯化的PRMT5/MEP50馏分（中间面板）或纯化的MBD2复合物（顶部面板）。自由标签用星号表示。底部面板中显示了GST-PAH2、GST-RG（n）、GST-MBD2、缺少RG拉伸的GST-MBD2和GST-MBD3的加载控制。（E） 来自HEK 293细胞的纯化N-末端截短MBD2复合物的银染色凝胶。该表显示了FT-MS/MS分析，包括所有识别的蛋白质及其各自的肽数量和序列覆盖率。
为了研究MBD2的RG延伸是否是PRMT5和MBD2复合物之间相互作用所必需的，我们生成了一个稳定的细胞系，表达MBD2序列中从第二个蛋氨酸开始的截断的MBD2蛋白，因此缺乏RG延伸。纯化和FT-MS/MS分析后，发现了Mi-2/NuRD组分、新的核心亚单位DOC-1和重要蛋白α。然而，与PRMT5或MEP50匹配的肽未被识别（图。). Western blotting证实PRMT5存在于粗提物中，但在截短的MBD2洗脱液中不存在（数据未显示）。综上所述，这些结果强烈表明，PRMT5与MBD2的N-末端RG-丰富延伸相互作用，并将该RG延伸甲基化。
MBD2将PRMT5招募到染色质中。
为了评估PRMT5是否对MBD2染色质起作用，我们对MCF7乳腺癌细胞的内源性蛋白进行了染色质免疫沉淀实验。分析了先前在MCF7细胞中被甲基化并被MBD蛋白结合的不同CpG岛靶标(7,24,25)（图。). 使用MTA2、MBD2和MBD3抗体进行染色质免疫沉淀，然后进行实时定量PCR分析，发现这些蛋白在两个CpG岛上募集，其中一个位于P14第一外显子附近农业研究基金第二个CpG岛位于P16第一外显子之前INK4a公司（图。). 其他几个测试的CpG岛没有招募MTA2、MBD2和MBD3。接下来，我们使用抗PRMT5的抗体进行了ChIP，这揭示了PRMT5对P14的招募农业研究基金和第16页INK4a公司CpG群岛。这些结果提供了体内MBD2和精氨酸甲基转移酶PRMT5之间的功能联系。
MBD2招募PRMT5到染色质。（A） ChIP实验中使用的引物集的示意图。外显子用黑色矩形表示。CpG岛以灰色表示。底漆对用箭头表示。（B） MCF7细胞MBD2、MBD3、PRMT5和MTA2的ChIP分析。显示了控制BMX区域的相对占用率。数值是三个独立的染色质分离的ChIP实验结果的平均值和标准偏差。（C） 5-氮杂胞苷处理的MCF7细胞的ChIP分析。用MBD2、MBD3、MTA2、PRMT5和抗二甲基istone H4（Arg3）抗体进行免疫沉淀。显示了控制BMX区域的相对占用率。数值是三个独立的染色质分离的ChIP实验结果的平均值和标准偏差。
本研究中描述的生化实验表明，MBD2和MBD3相互排斥，PRMT5与MBD2相互作用，但与MBD3不相互作用。ChIP实验表明，MBD2和PRMT5以及MBD3被招募到P14农业研究基金和第16页INK4a公司CpG群岛。为了研究MBD2、PRMT5和MBD3向这些位点的募集是否依赖于CpG甲基化，我们用AzaDc（一种DNA甲基化的特异性抑制剂）处理MCF7细胞，然后研究MBD2、MBD3、PRMT6和MTA2向P14的募集农业研究基金和P16INK4a公司CpG群岛。如图所示。，AzaDc处理导致MBD2结合显著丧失。引人注目的是，可以观察到PRMT5与位点的结合减少，这表明MBD2和PRMT5是与P14结合的农业研究基金和第16页INK4a公司CpG岛以甲基化敏感的方式存在。相反，MBD3向这些位点的募集仅受到中度影响。MTA2是MBD2和MBD3复合物中的一种蛋白质，其含量减少了约50%。因此，MBD2和PRMT5以甲基化依赖的方式被招募到CpG岛，而MBD3仅部分受到影响，这支持了MBD2/PRMT5和MBD3至少在某种程度上作为不同的复合物聚集在CpG岛屿上的观点。已知启动子的PRMT5募集与组蛋白的精氨酸甲基化相关(8). 调查PRMT5是否被招募到P14农业研究基金和第16页INK4a公司CpG岛与组蛋白H4的精氨酸甲基化相关，我们使用针对二甲基化组蛋白H4R3的抗体对经或不经AzaDc处理的MCF7细胞进行染色质免疫沉淀实验。如图所示。将PRMT5招募到P14农业研究基金和P16INK4a公司CpG岛与精氨酸二甲基化组蛋白H4R3水平的富集相关。引人注目的是，用AzaDc处理MCF7细胞导致二甲基化组蛋白H4R3水平降低。因此，PRMT5招募到P14农业研究基金和第16页INK4a公司CpG岛与组蛋白H4R3甲基化相关。
总之，本研究中描述的实验表明MBD2和MBD3在不同的Mi-2/NuRD类配合物中组装，并且相互排斥。此外，PRMT5与MBD2结合并甲基化，并在体内以甲基化依赖方式与含MBD2的Mi-2/NuRD复合物一起招募到CpG岛。
讨论
在本研究中，我们开始深入了解MBD2和MBD3的功能。我们应用蛋白质标记方法从哺乳动物细胞中纯化MBD2和MBD3复合物。引人注目的是，尽管这些蛋白质被描述为同一复合物的一部分，但我们发现它们位于不同的复合物中。在纯化的MBD3复合物中无法检测到MBD2，反之亦然。从一个表达MBD2和MBD3的双稳定细胞系中分离纯化MBD2与MBD3，该细胞系具有相似水平的不同标记，证实了它们的互斥性。此外，内源性MBD2没有免疫沉淀MBD3，反之亦然。最后，从稳定表达标记MBD3的HeLa细胞纯化的MBD3复合物中也无法检测到MBD2（未公布数据）。Feng和Zhang使用传统色谱法从HeLa核提取物中纯化含MBD2的MeCP1复合物，发现MBD3可进行铜提纯，他们认为这些蛋白质确实是同一复合物的一部分(9). 然而，该纯化部分实际上可能是Mi-2/NuRD复合物的混合物，其中一些含有MBD2，另一些含有MBD3。由于它们可能对不同的色谱树脂具有非常相似的结合亲和力，因此在整个纯化过程中，它们最终会形成相同的组分。Jiang和同事进行了酵母双杂交分析和GST下拉，发现MBD2和MBD3直接相互作用(17). 虽然我们不能排除一小部分MBD2和MBD3相互作用，但我们的实验清楚地表明，绝大多数MBD2与MBD3蛋白独立地组装在不同的Mi-2/NuRD类复合物中，我们建议将其分别称为MBD2/NuRD和MBD3/NuRD。基于不同的亚基组成，特别是在MBD2而不是MBD3中存在PRMT5、MEP50和importin复合物，我们假设这些复合物在细胞内具有不同的功能。图中描述的AzaDc-ChIP实验支持了这一假设。显示甲基化依赖MBD2/PRMT5对P14的补充农业研究基金和P16INK4a公司CpG岛，而MBD3向这些位点的募集在很大程度上独立于甲基化。
PRMT5和Mi-2/NuRD复合体。
液相色谱-MS/MS和Western blot分析显示精氨酸甲基转移酶PRMT5及其相关蛋白MEP50与MBD2/NuRD复合物相关，而MBD3/NuRD复合物中缺乏这些蛋白。PRMT5是MBD2/NuRD复合物的核心亚单位，还是与MBD2/NuRD复合物强烈相互作用的蛋白质，尚待确定。PRMT5通过MBD2的RG-rich N末端被招募到MBD2/NuRD复合体。此外，我们提供了证据表明，PRMT5可以甲基化MBD2的RG延伸。因此，我们假设MBD2的RG延伸可能兼作基质和PRMT5的对接位点。研究表明，PRMT5可能通过在组蛋白H3和H4尾部添加抑制性精氨酸甲基标记来抑制肿瘤抑制基因(29). 与此一致，我们发现PRMT5与P14上的MBD2共定位农业研究基金和第16页INK4a公司CpG岛，这与组蛋白H4R3二甲基化相关，从而在体内提供PRMT5和MBD2之间的功能联系。
Mi-2/NuRD，蛋白质复合物家族。
自7年前首次描述以来，Mi-2/NuRD复合物通常被视为一个包含许多核心多肽的生化实体。然而，我们的研究清楚地揭示了MBD2/NuRD和MBD3/NuRD复合物与不同亚基组成的存在。来自多个实验室的先前观察揭示了额外的Mi-2/NuRD复合物的存在，例如由不同的MTA变体定义的，这可能允许对不同的Mi-2/NuRD复合物进行进一步的微调(4,11,21,33,44). 最后，除了改变蛋白质组成外，不同Mi-2/NuRD亚基的翻译后修饰（未发表的数据）也可能在调节其功能方面发挥重要作用。
本研究中描述的结果使我们提出了不同Mi-2/NuRD复合物抑制的前馈机制。单个蛋白质复合体内聚集的不同酶活性可能协同作用调节MBD2靶基因的抑制：靶位点周围核小体的脱乙酰化，以及相关PRMT5在H4尾部添加的转录抑制精氨酸甲基标记(29). 此外，还可能发生ATP酶Mi-2催化的染色质重塑。围绕MBD2/PRMT5靶向位点的低乙酰化和精氨酸甲基化核小体反过来可为MBD3/NuRD复合物提供结合支架，该复合物对低乙酰化核小体具有高亲和力（数据未显示）。这导致MBD2/NuRD和MBD3/NuRD复合物在一些CpG岛上同时出现。MBD3/NuRD复合物进一步脱乙酰核小体可以促进脱乙酰化的传播和维持转录抑制。解开每个Mi-2/NuRD复合体的独特功能是一项艰巨的任务。
