MEK细胞外信号调节激酶和MKK3/6-38丝裂原活化蛋白激酶途径的顺序激活介导肿瘤发生ras（拉斯维加斯）-诱导早衰^†

质粒和试剂。

BabeHygro hTERT、BabePuro公司-Ha-rasV12型和BabePuro-MEK1Q56P分别来自R.A.Weinberg、D.Beach和S.Lowe。通过从腺病毒载体克隆相应的cDNA片段，构建BabePuro-MKK3E、-MKK6E、-MK K7D和-p38αWT(23,59)进入BabePuro载体。BabeHygro-MKK3A和-MKK6A是通过从腺病毒载体克隆各自的cDNA片段而构建的(23)BabeHygro载体。p38α、p38β、p38γ和p38δ的显性阴性突变等位基因从嘉惠汉族获得，并从pcDNA3载体中切除(20,26,27,35)并亚克隆到BabeHygro载体中。SB203580和U0126购自Calbiochem。肿瘤坏死因子α（TNF-α）购自Chemicon International，Inc。

逆转录病毒基因转导。

如前所述，使用两栖包装细胞系（LinX-A）进行逆转录病毒基因转导(54). 使用SB203580（8μM）、U0126（5μM）或载体控制的治疗通常在最初逆转录病毒感染时开始。感染后1至2天，用100μg潮霉素B/ml、400μg G418/ml和/或1μg嘌呤霉素/ml纯化经逆转录病毒转导的细胞。我们通常在选择前使BJ细胞的感染率达到30%至50%，在选择后达到90%至100%。

衰老分析。

用嘌呤霉素筛选感染适当逆转录病毒的细胞4天，以清除未感染的细胞，然后进行分析以分析早衰。完成药物选择的日期（感染后第5天）被定义为第0天。

对于增长曲线，10⁴将细胞以两份或三份的形式接种到12孔板中的每个孔中。每隔3至4天，从平板上对细胞进行胰蛋白酶消化，并计数细胞数量。每次拆分时，10⁴将细胞重新接种到新鲜的培养皿中的每个孔中，并让其生长到下一次分裂。使用公式PD=log计算人口倍增（PD）(n个2/n个1） /log2，其中n个1是播种的细胞数n个2是回收的细胞数(52). 如前所述，检测具有衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的细胞(51). 从每个培养孔中随机选择的区域中，至少有200个细胞被计数。

蛋白质印迹。

用于蛋白质印迹分析的裂解物通常在初始逆转录病毒基因转导后8至10天制备。在NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8.0]、120 mM NaCl、0.5%NP-40和完全蛋白酶抑制剂[Roche]）或RIPA缓冲液（含有1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸盐、0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]、1 mM Na的磷酸盐缓冲液_三VO（旁白）₄和完整蛋白酶抑制剂[Roche]）。通过离心清除裂解产物后，通过Bradford分析测定蛋白质浓度。在SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离20至80μg蛋白质，并转移至转布洛克硝化纤维素膜（Bio-Rad）。使用的主要抗体包括Ha-Ras（C-20；Santa Cruz）、磷酸化ERK（Thr202/Tyr204；细胞信号）、ERK（细胞信号），ERK2（C-14；Santa Cruz），肌动蛋白（Sigma），p16^{INK4A（墨水）}（DCS-50；Novocastra）、p53（来自Novocasra的CM1和来自Santa Cruz的FL-393）、磷酸化-p38（Thr180/Tyr182；细胞信号）、p38（细胞信号），磷酸化-MEK1/2（Ser217/221；细胞信号学）、磷酸基-MKK3/6，磷酸化JNK（Thr183/Tyr185；细胞信号传导）、JNK（细胞信号传导）和JNK1（C-17；圣克鲁斯）。辣根过氧化物酶结合山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（Santa Cruz）或山羊抗小鼠IgG（Jackson Laboratories）抗体用作二级抗体。使用增强化学发光（SuperSignal；Pierce）观察反应蛋白。

免疫沉淀和蛋白激酶分析。

使用[γ]免疫沉淀p38蛋白和随后的蛋白激酶分析-³²P] ATP的执行如前所述(23,28). 在RIPA缓冲液（含有1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸盐、0.1%SDS、1mM Na的磷酸盐缓冲液）中溶解30%至50%汇合处的细胞_三VO（旁白）₄和完整蛋白酶抑制剂[Roche]）。使用抗p38（细胞信号传导）抗体从等量的裂解物中纯化p38蛋白(23)或肌动蛋白（Sigma）和蛋白质A-Sepharose CL-4B（Amersham Pharmacia Biotech）。蛋白激酶分析在37°C下进行30分钟，体积为50μl，含7μg谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-ATF2（残基1至109），10μM ATP，10μCi的[γ-³²P] ATP、20 mM HEPES（pH 7.6）、20 mM-MgCl₂，25 mMβ-甘油磷酸，0.1 mM钠_三VO（旁白）₄和2 mM二硫苏糖醇。反应用Laemmli样品缓冲液终止，产物在SDS-PAGE上分离，并用荧光成像仪进行可视化和定量。按照制造商的说明，使用来自细胞信号的p38 MAP激酶分析试剂盒进行非放射性p38激酶分析。

按照制造商的说明，使用来自细胞信号的p44/42 MAP激酶分析试剂盒和SAPK/JNK MAP激酶测试试剂盒测量ERK和JNK激酶活性。

细胞周期分析。

用嘌呤霉素选择2天后（感染后3天），用Ha转导的细胞-rasV12型在含有0.2%胎牛血清的培养基中培养21 h，然后用30μM溴脱氧尿苷（BrdU）（Sigma）标记3 h。用胰蛋白酶将细胞从培养板中取出，并在4°C的70%乙醇中固定过夜。然后在室温下用2 N HCl-0.5%Triton X-100处理细胞30分钟，然后用0.1 M Na中和₂B类₄哦₇然后在室温下与异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗BrdU抗体（Becton Dickinson）孵育1小时。最后，用PBS-1%牛血清白蛋白-0.5%吐温20清洗细胞，再悬浮在含有5μg/ml碘化丙啶的PBS中，并用二维流式细胞术检测荧光素和碘化丙锭。

具有组成活性的MKK3和MKK6诱导早衰。

p38 MAPK可通过两个上游MAPKKs，MKK3和MKK6的磷酸化激活，以响应细胞外刺激(10,21,22,46,47). MKK3和MKK6分别通过Ser207/Thr211和Ser189/Tr193的双重磷酸化激活。用谷氨酸（E）取代这些丝氨酸/苏氨酸残基会导致组成活性形式的MKK3和MKK6（MKK3E和MK6E），它们可以独立于上游信号磷酸化和激活p38(22,47). 因此，我们研究了这两个突变MKK激活p38是否会导致衰老。通过逆转录病毒基因转导，MKK3E和MKK6E在早期传代的BJ成纤维细胞中表达（图。​（图2A）。2安培). 虽然Ha-RasV12导致p38和ERK的磷酸化，但MKK3E和MKK6E只增加了p38的激活磷酸化，而不增加ERK的活化磷酸化（图。​（图2A）。2安培). MKK3E和MKK6E也刺激p38激酶活性（见图。​图8C）。8摄氏度). 用未激活的载体控制（BP）或野生型p38α基因转导的BJ细胞显示正常生长率（图。​（图2B）。2B型). 相反，MKK3E或MKK6E的表达导致BJ细胞的生长停滞（图。​（图2B）。2B型). 被阻滞的细胞获得了衰老样的形态（图。​（图2C）。2摄氏度). 此外，我们估计超过80%的MKK3E-或MKK6E-表达细胞积累了SA-β-gal，而很少有载体控制细胞显示这种衰老标记（图。2C和D). 这些结果表明，p38的组成性激活可能导致早衰。

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图2。

活性MKK3或MKK6激活p38可诱导过早衰老。（A） 利用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）对PD18转导的BJ细胞进行Western blot分析。MKK3、MKK6、磷酸-ERK（P-ERK1/2）、ERK2、磷酸-p38（P-p38）、p38、p16的水平^{INK4A（墨水）}感染后10天检测p53。（B） 在PD18感染载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）或野生型p38α（p38αWT）后第7天至第11天BJ细胞的PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（C） 感染后第12天对SA-β-gal（pH 6.0）染色后，用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）转导的hTERT永生化的BJ细胞（BJ）或BJ细胞的形态。（D） 面板C中所示细胞群中SA-β-gal阳性细胞百分比的量化。数值为两个独立孔的平均值±SD。每个样本至少计数200个细胞。

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图8。

p38激活方式ras（拉斯维加斯）由活跃的MEK-ERK途径介导。（A） 组成活性MEK1增加p38磷酸化。所示为选择后第6天用载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）或MEK1Q56P（MEK1Q56）转导的BJ细胞的Western blot分析结果，表明MEK1（MEK1）、磷酸化ERK（P-ERK1/2）、ERK2（ERK2）、磷酸酯酶p38（P-p38）、p38（p38）和p16的蛋白水平^{INK4A（墨水）}（第16页）。（B） 阻止MEK-ERK活性抑制ras（拉斯维加斯）-诱导p38磷酸化。所示为感染后第10天，在存在载体对照（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下，用载体对照（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、MKK3E（MK3E）或MKK6E（MKK6E）转导的BJ细胞的Western blot分析结果，并显示磷酸化p38和p38水平。（C） 在感染后第10天，在载体对照（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）、组成型活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MKK6E）或活性MEK1（MEK1Q56P）存在下，用载体对照（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）在PD 30转导的BJ细胞免疫沉淀的p38的蛋白激酶活性。[γ-³²P] 以ATP和GST-ATF2为底物。这些数字表示归一化到背景后磷酸化ATF2底物的相对数量。用荧光成像仪对信号进行可视化和量化。

致癌的ras（拉斯维加斯）-诱导性早衰与复制性衰老的不同之处在于它与端粒无关。尽管人类端粒酶催化亚单位hTERT在体外表达时可防止复制性衰老(2)，它不能拯救致癌ras（拉斯维加斯）-诱导性早衰(60). MKK3E和MKK6E也能诱导用hTERT永生化的BJ细胞衰老（图。2C和D). 当不用MKK3/6转导时，这些表达hTERT的细胞增殖远远超过PD 150，而对照BJ细胞在PD 80至90时经历复制衰老（数据未显示）。因此，p38激活诱导的衰老也没有被hTERT的强制表达所挽救，这表明两者都是致癌的ras（拉斯维加斯）而激活的p38通过与介导复制性衰老不同的途径诱导衰老。

与Ha-RasV12一样，MKK3E和MKK6E诱导p53和p16的表达^{INK4A（墨水）}（图。​（图2A）。2安培). 虽然p53在早衰中的作用仍有争议，但p16^{INK4A（墨水）}之前被证明参与了ras（拉斯维加斯）-诱导衰老(64)因此在我们的研究中也可能介导由活化的p38诱导的衰老。因此，我们进一步探讨了p16的机制^{INK4A（墨水）}p38激活后积累。第16页^{INK4A（墨水）}根据使用p16的Northern印迹分析测定，活性MKK3或MKK6激活p38后，mRNA上调三到四倍^{INK4A（墨水）}cDNA作为探针（图。​（图3）。三). 因此，虽然我们不能排除MKK3/6也可能调节p16蛋白水平，但至少部分p16的积累是由于其mRNA的上调。

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图3。

活性MKK3和MKK6上调16^{INK4A（墨水）}信使核糖核酸水平。用载体控制（BP）或编码活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）的逆转录病毒转导BJ细胞8天后，从BJ细胞中分离出总RNA。在琼脂糖凝胶上分离8微克RNA，转移到尼龙膜上，并与p16杂交^{INK4A（墨水）}随机引物标记cDNA探针。用荧光成像仪对信号进行可视化和量化。数字代表p16的相对强度^{INK4A（墨水）}信号归一化为背景信号和GAPDH信号后的信号（未显示数据）。

TNF-α诱导BJ成纤维细胞衰老。

因为p38被致癌激活ras（拉斯维加斯）或活性MKK3和MKK6可导致原代BJ成纤维细胞过早衰老，我们探讨了其他p38激活剂也可能诱导这些细胞衰老的可能性。TNF-α是一种炎症细胞因子，已被证明可激活p38(32,50). 在BJ成纤维细胞中，TNF-α治疗诱导磷酸化p38的积累（图。​（图4A）4A级)p38活性增加（图。​（图4B）。4B类). 当用TNF-α持续治疗时，BJ细胞的生长速度比对照细胞慢（图。​（图4C）。4摄氏度). TNF-α治疗人群中30%以上的细胞SA-β-gal阳性（图。​（图4D），4D（四维）)表明TNF-α诱导的生长抑制至少部分是由于过早衰老。与Ha-RasV12-或MEK1Q56P-诱导的早衰相比，TNF-α诱导的衰老表型不太严重。这可能是因为Ha-RasV12或MEK1Q56P比TNF-α更能激活p38（图。​（图4B）。4B类). 总的来说，这些数据表明TNF-α激活p38也会导致原代BJ成纤维细胞过早衰老。

而在表达致癌基因的细胞中未检测到JNK活性ras（拉斯维加斯）或激活MEK1（图。​（图4B），4B类)，TNF-α以剂量依赖的方式导致JNK磷酸化增加（图。​（图4A）4A级)并诱导JNK活性朝向c-Jun的磷酸化（图。4A和B). TNF-α未诱导BJ细胞中ERK的激活（数据未显示）。

活性MKK7激活JNK不会诱导衰老。

致癌基因的过度表达ras（拉斯维加斯）导致磷酸化JNK水平增加（图。​（图1C）。1摄氏度). 在一种激酶试验中，TNF-α或活性MKK7诱导的JNK活性被很好地检测到，JNK激酶活性在ras（拉斯维加斯）-或MEK1-表达细胞（图。​（图4B）。4B类). 然而，有可能ras（拉斯维加斯）仍然刺激JNK活性，但仅达到激酶检测无法检测到的水平。此外，诱导BJ细胞衰老的TNF-α也激活了JNK（图。4A和B). 因此，我们进一步研究了JNK激活在早衰中的作用。用编码MKK7组成活性突变体（MKK7D）的重组逆转录病毒感染早期传播的BJ细胞，其中Ser271和Thr275突变为Asp(41,59). MKK7D导致JNK1和JNK2的磷酸化显著增加，而不影响p38的磷酸化状态（图。​（图5A）5A级)并大大刺激了JNK磷酸化c-Jun的能力（图。​（图4B）。4B类). 然而，表达MKK7D的BJ细胞并没有过早衰老。这些细胞不断增殖，感染载体控制的细胞也不断增殖（图。​（图5B），5亿)并且没有显示衰老表型。活性MKK7没有诱导p16的积累^{INK4A（墨水）}，或者（图。​（图5A）。5A级). 因此，JNK途径的激活不足以导致过早衰老。结合Ha-RasV12没有显著诱导JNK活化的观察结果，这些数据表明，JNK的活化不太可能是致癌物质诱导的早衰的主要介质ras（拉斯维加斯）.

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图5：。

活性MKK7激活JNK不会诱导衰老。（A） 磷酸化JNK（P-JNK）、JNK1、磷酸化p38（P-p38）、p16的水平^{INK4A（墨水）}用Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK7（MKK7D）或载体对照（BP）转导PD 24的BJ细胞10天后，通过Western blot分析测定肌动蛋白。（B） BJ细胞PD在PD 24用Ha-RasV12（Ras）、组成活性MKK7（MKK7D）或载体控制（BP）转导。第0天表示感染后的第五天。数值为三倍的平均值±标准偏差。

需要激活p38ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。

虽然活化的MKK3或MKK6激活p38足以导致自身过早衰老，但仍有可能ras（拉斯维加斯）-诱导的衰老不是由p38介导的。因此，p38激活可能不需要ras（拉斯维加斯）诱导衰老。或者，p38的激活可能是从ras（拉斯维加斯）激活至过早衰老。为了区分这些可能性，我们利用了SB203580，一种吡啶基咪唑衍生物，它可以特异性地抑制p38的激活，但不能抑制其他MAPK途径的激活。SB203580阻断活性p38α和p38β磷酸化并激活其下游靶点的能力(9,15,16). 治疗ras（拉斯维加斯）-用SB203580表达的细胞降低了p38磷酸化ATF2的能力（见图。​图8C），8摄氏度)而对ERK1和ERK2的磷酸化没有影响ras（拉斯维加斯）（图。​（图6C，6摄氏度，顶部面板）。此外，用SB203580治疗并没有改变ras（拉斯维加斯）-通过免疫沉淀法从细胞中分离ERK后，在体外激酶试验中测定ERK对其天然底物之一Elk1磷酸化的诱导活性（图。​（图6C，6摄氏度，底部面板）。作为对照，使用MAPKKs MEK1和MEK2的特异性抑制剂U0126通过致癌来阻断MEK-ERK通路的激活ras（拉斯维加斯）(11,17). 在BJ细胞中，U0126抑制ras（拉斯维加斯）-ERK1和ERK2的诱导磷酸化（图。​（图4C，4摄氏度，上部面板），并在体外激酶分析中降低ERK活性以磷酸化Elk1（图。​（图6C，6摄氏度，底部面板）。

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图6。

p38激活的特异性抑制ras（拉斯维加斯）救援ras（拉斯维加斯）-诱导过早衰老。（A） 在含有载体对照物SB203580、U0126或U0126和SB203580.的情况下，在PD18时用载体对照物（BP）或Ha-RasV12（Ras）转导的BJ细胞PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（B） 在含有载体对照物（Con）、SB203580（SB）、U0126（U）或U0126和SB203580。数值为三份的平均值±SD。（C） 在含有载体对照物（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下，利用载体控制物（BP）或Ha-RasV12（HaRasV12）在PD18时转导的BJ细胞的Western blot分析，显示Ras、磷酸化ERK（P-ERK）、ERK和p16的水平^{INK4A（墨水）}底部面板（P-Elk1融合）显示了从相同细胞中免疫沉淀的ERK的激酶活性，如使用Elk1作为底物的体外激酶分析所测定的。磷酸化底物通过Western blot分析和抗磷酸-Elk1抗体进行可视化。（D） p38β、p38γ和p38δ的显性负等位基因被挽救ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。表达p38β[p38β（AF）]、p38γ[p38γ（AF。从感染后第5天（指定为第0天）开始跟踪这些细胞的PD。数值为三份的平均值±SD。

当Ha-RasV12型在SB203580存在下转导到BJ细胞中，与载体对照存在时相比，防止了早衰（图。​（图6A）。6A级). U0126治疗还可以挽救表达Ha-RasV12的BJ细胞的过早衰老（图。​（图6A），6A级)证实了MEK-ERK激活在ras（拉斯维加斯）-诱导衰老(36,64). 此外，SB203580和U0126还将SA-β-gal活性阳性的Ha-RasV12表达细胞的百分比从80%以上显著降低至10%至30%（图。​（图6B），6亿)这些化合物阻断了p16的诱导^{INK4A（墨水）}通过ras（拉斯维加斯）（图。​（图6C），6摄氏度)这表明，当p38或MEK-ERK通路被激活时，衰老过程的开始被阻断ras（拉斯维加斯）在这些细胞中被阻止。这些结果表明p38的激活对致癌至关重要ras（拉斯维加斯）诱导BJ原代成纤维细胞过早衰老。当ras（拉斯维加斯）激活p38被特异性阻断，即使MEK-ERK通路仍然活跃，也不会发生早衰。

为了确认p38的基本作用，ras（拉斯维加斯）-用不同p38亚型、p38α（FA）、p38β（FA。p38的这些突变等位基因在双磷酸化位点（α、β和γ的TGY到FGA，δ的KGM）内发生突变，并已被证明以显性负向方式抑制细胞内内源性p38的活性(20,26,27,35). p38β（FA）、p38γ（FA）或p38δ（KM）的表达部分缓解了致癌引起的生长抑制ras（拉斯维加斯）（图。​（图6D），第6天)表明p38的这三种亚型参与ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。与其他p38亚型不同，p38α（FA）对生长的负调控作用不明显ras（拉斯维加斯）（未显示数据）。这些带有p38显性干扰突变等位基因的结果进一步证实了p38活性对致癌至关重要ras（拉斯维加斯）诱导BJ成纤维细胞过早衰老。

p38不需要有丝分裂活性ras（拉斯维加斯）.

自致癌以来ras（拉斯维加斯）在正常二倍体人成纤维细胞中诱导增殖和过早衰老，我们进一步研究p38是否也对有丝分裂活性至关重要ras（拉斯维加斯）在原代成纤维细胞中，过早衰老是对致癌的晚期反应ras（拉斯维加斯）表达，而ras（拉斯维加斯）激活是生长刺激(36). 事实上，直到Ha最初转导后7至10天，生长停滞才明显-rasV12型BJ细胞中的基因（生长曲线分析中的第1天到第4天；参见材料和方法）（图。​（图1A1安培和数据未显示）。

为了检测ras（拉斯维加斯）之后不久，在BJ细胞群中测量了BrdU掺入ras（拉斯维加斯）转导。感染后4天以及感染细胞用致瘤嘌呤霉素纯化后立即ras（拉斯维加斯）当细胞在低血清浓度下生长时，表达导致BrdU掺入增加两到三倍（图。​（图7），7)证实了先前在IMR90人成纤维细胞中的发现(36). 该试验揭示了致癌的作用ras（拉斯维加斯）BJ细胞在有丝分裂刺激后发生早衰。这个ras（拉斯维加斯）-当p38被SB203580抑制时，诱导的BrdU掺入增加并没有被阻止（图。​（图7），7)表明致癌的有丝分裂活性ras（拉斯维加斯）不依赖于激活的p38。这些结果表明，虽然p38激活对ras（拉斯维加斯）-诱导的早衰，有丝分裂活性ras（拉斯维加斯）似乎与p38无关。

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图7。

p38不需要有丝分裂活性ras（拉斯维加斯）感染后三天，将在PD18转导带有载体控制（BP）或Ha-RasV12（Ras）的早期传代BJ细胞在载体控制或SB203580（SB）存在下置于低血清培养基中20 h，并用BrdU标记3 h。收集细胞，用FITC-结合抗BrdU抗体和碘化丙啶染色，并用双色流式细胞仪分析BrdU掺入和DNA含量。上框表示包含BrdU的单元（在S阶段），左下框表示G₁单元格，右下框表示G₂/M个单元格。显示每个细胞群中BrdU阳性细胞的百分比。

p38通过以下途径持续激活MEK-ERK而被激活ras（拉斯维加斯）.

本研究和以往研究的结果表明，MEK-ERK和MKK3/6-p38 MAPK通路都是致癌所必需的ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。此外，ERK或p38单独由其上游激酶激活可诱导过早衰老。这些观察结果表明，MEK-ERK和MKK3/6-p38可能在介导ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。支持这一假设，U0126和SB203580同时抑制MEK-ERK和MKK3/6-p38通路在预防ras（拉斯维加斯）-诱导衰老（图。6A和B). 虽然MEK-ERK和MKK3/6-p38构成了两条独立的MAPK通路，它们介导对不同细胞外信号的反应，但我们的结果表明，持续刺激一条通路的可能性是ras（拉斯维加斯）表达可能导致另一个的激活。

由于MKK3或MKK6激活p38并没有增加ERK磷酸化（图。​（图2A），2安培)，我们检测了活性MEK-ERK通路对p38活性的影响。为了激活ERK通路，MEK1（MEK1Q56P）的组成活性突变体(5)被转导到BJ细胞。活性MEK1增加了ERK的活化磷酸化（图。​（图8A）8安)导致原代BJ成纤维细胞过早衰老（见图。​图11），11)与之前在其他原发性成纤维细胞中的发现一致(36,64). 组成活性MEK1的表达也诱导了Thr180和Tyr182上p38的磷酸化（图。​（图8A）8安)并且增加了p38的激酶活性，使其朝向ATF2的磷酸化（图。​（图8C）。8摄氏度). 因此，MEK-ERK通路的组成性激活导致p38的激活。

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图11。

Ha-RasV12-和MEK1Q56P-诱导的衰老都需要激活p38。图中所示为PD17时转导的BJ细胞与Ha的生长曲线-rasV12型（Ha-RasV12）或组成活性MEK1（MEKQ56P）、MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E），在有车辆控制器、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下。数值为选择后指定日期三次测定的平均值±标准偏差。

先前研究的结果和此处显示的结果（图。​（图1C）1摄氏度)已经证明致癌ras（拉斯维加斯）激活ERK和p38通路。我们观察到激活的MEK1可能导致p38激活，这可能导致ras（拉斯维加斯）可能通过激活MEK-ERK途径刺激p38活性。事实上，U0126处理对MEK活性的抑制大大降低了Ha-RasV12诱导p38磷酸化的能力（图。​（图8B）8B类)和p38活性对ATF2磷酸化的影响（图。​（图8C）。8摄氏度). U0126没有降低活性MKK3或MKK6诱导的p38磷酸化（图。​（图8B），8B类)，表明U0126被阻止ras（拉斯维加斯）-通过抑制MEK活性而非直接抑制MKK3/6诱导p38激活。因此，p38通过致癌激活ras（拉斯维加斯）需要功能性MEK-ERK途径。这一发现表明，在原代人类成纤维细胞中，p38不被致癌物质激活ras（拉斯维加斯）直接，但更确切地说是由于ras（拉斯维加斯）-MEK-ERK通路的诱导激活。

MKK3/6通过致癌介导p38激活ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。

我们已经证明p38活性的刺激是MEK-ERK被致癌物激活的结果ras（拉斯维加斯）p38通过其上游激酶MKK4、MKK3和MKK6的磷酸化激活(10,21,22,32,46,47). 因此，我们研究了MKK4、MKK3和MKK6是否参与了p38的激活ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。

在早期传代的BJ细胞中，MEK1Q56P和Ha-RasV12诱导MKK3/6的活化磷酸化（分别在MKK3的Ser189/Tr193和MKK6的Ser207/Thr211上）(21,46,47)（图。​（图9A）。9安). 另一方面，虽然用NaCl处理BJ细胞导致MKK4的强烈激活，但Ha-RasV12和MEK1Q56P并没有刺激MKK5的活化磷酸化（图。​（图9A）。9安). 这个ras（拉斯维加斯）-活性MKK3/6水平的诱导增加依赖于活性MEK，因为U0126对MEK活性的抑制消除了Ha-RasV12诱导磷酸化MKK6/6积累的能力（图。​（图9B）。9亿). 与MEK在MKK3/6激活中的作用一致，U0126还阻断了MEK1Q56P诱导的MKK3/4磷酸化（图。​（图9B）。9亿). 因此，可以通过以下方式激活MKK3/6ras（拉斯维加斯）在早衰开始期间以MEK依赖方式。我们的数据表明，MKK3/6可能在调节p38激活以应对致癌反应中起重要作用ras（拉斯维加斯）和活性MEK，MKK4可能不参与该途径。

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图9：。

MKK3/6通过致癌介导p38激活ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。（A） Ha-RasV12和MEK1Q56P诱导活性MKK3/6的积累，但对活性MKK 4的水平没有影响。磷酸-MKK3/6（P-MKK3/6）、肌动蛋白、磷酸-MKK4（P-MKK4）和MKK4的水平在用载体对照（BP）、致癌Ras（HaRasV12）或组成型活性MEK1（MEK1Q56P）在PD 33处转导BJ细胞10天后通过蛋白质印迹法测定。在用700 mM NaCl处理15分钟（NaCl）或不处理（−）的BJ细胞（PD 26）中，也测定了磷酸化MKK4（P-MKK5）和MKK3的水平。（B） Ha-RasV12和MEK1Q56P上调磷酸化MKK3/6依赖于MEK活性。在载体控制（BP）、Ha-RasV12（Ras）或MEK1Q56P（MEK1）、载体控制（Con）或U0126（U）存在的情况下，在PD39处转导BJ细胞7天后，通过Western blotting测定磷酸化MKK3/6（P-MKK6/6）和肌动蛋白的水平。（C） 致癌激活p38需要MKK3ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。在PD33处用Ha-RasV12（Ras）、MEK1Q56P（MEK1）或载体对照转导MKK3显性阴性等位基因（MKK3A）或表达载体对照（BH）的BJ细胞中，通过Western blot分析测定磷酸化p38（P-p38）和MKK2的水平。

MKK3/6参与ras（拉斯维加斯）-使用MKK3和MKK6的显性阴性突变体进一步证明了MEK介导的p38激活。这些非活性突变体（MKK3A和MKK6A）是通过用丙氨酸取代双磷酸化位点中的两个丝氨酸/苏氨酸残基而构建的(23). 在表达MKK3、MKK3A显性阴性等位基因的BJ细胞中，Ha-RasV12和MEK1Q56P诱导p38活化磷酸化的能力显著降低（图。​（图9C）。9摄氏度). 在用MKK6A转导的BJ细胞中获得了类似的结果（数据未显示）。这些研究证实了MKK3和MKK6在介导ras（拉斯维加斯）-和MEK诱导的p38激活。综上所述，我们的研究结果表明，当MEK被致癌Ras激活时，可能通过激活BJ人成纤维细胞中的MKK3/MKK6来刺激p38活性。

通过激活MEK-ERKras（拉斯维加斯）在MKK3/6-p38激活和衰老之前。

发现MKK3/6-p38通路被激活是MEK-ERK通路被致癌物激活的结果ras（拉斯维加斯）提示MEK-ERK通路的激活可能先于MKK3/6-p38通路的激活ras（拉斯维加斯）如果MEK对MKK3/6-p38通路的激活不是通过直接信号途径实现的，而是涉及间接、缓慢的途径，例如转录调控或其他需要新蛋白质合成的机制，那么这种时间差异将更加明显。为了确定MEK-ERK和MKK3/6-p38通路激活的时间，我们跟踪了这两条通路状态的时间进程，从BJ细胞首次转导Ha后的第3天到第9天-RasV12型（图。​（图10）。10). 到第3天，MEK和ERK已经被强烈激活。由于最少需要3天时间才能获得用ras（拉斯维加斯），我们无法在第3天之前监测MEK和ERK的状态。然而，由于磷酸化-MEK和磷酸化-ERK在第3天时已经达到其最高水平，MEK-ERK途径很可能被激活ras（拉斯维加斯）在第3天之前，这与通过以下途径直接激活MEK-ERK相一致ras（拉斯维加斯）相反，MKK3/6和p38的磷酸化不受ras（拉斯维加斯）直到第4天。我们没有观察到磷酸化MKK3/6的诱导与磷酸化p38的诱导之间有任何时间间隔，这表明p38是由MKK3/4直接激活的。p16蛋白在第4天适度诱导，然后在第6天达到更高水平。显示SA-β-gal衰老标记的细胞在第5天开始积累，第6天在群体内达到最大百分比。

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图10。

MEK-ERK的激活先于MKK3/6-p38的激活和过早衰老。Ha-Ras、磷酸-MEK1和2（P-MEK1/2）、磷酸-ERK1和2中（P-ERK1/2），ERK2、磷酸-p38（P-p38）、p38、磷酸-MKK3和6（P-MKK3/6）、p16的水平^{INK4A（墨水）}在PD35用载体控制（V）或Ha-RasV12（R）转导BJ细胞后的不同天（第3~9天）通过Western blotting测定肌动蛋白。在这些相同的细胞群中，SA-β-gal阳性细胞的百分比显示在底部。

这些数据表明，MEK-ERK通路被ras（拉斯维加斯）p16的积累和衰老表型的出现甚至晚于p38的激活。结果支持我们的结论，当p38被激活时ras（拉斯维加斯）由于MEK-ERK持续激活，导致过早衰老。

我们感谢彼得·赖特和理查德·勒纳的支持。我们感谢R.A.Weinberg、D.Beach、S.Lowe、J.Smith和J.Han提供试剂，感谢Kathrina Pestano提供行政协助。

P.S.由斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的启动基金资助，是埃里森医学基金会（Ellison Medical Foundation）的新学者。S.H.得到了美国国防部和加州癌症研究计划的资助。