UBL-UBA蛋白KPC2在G处p27降解中的作用₁细胞周期的阶段

摘要

真核细胞中细胞周期的进展由一系列由细胞周期蛋白和细胞周期依赖性激酶（CDK）组成的蛋白复合物控制(36). CDK抑制剂（CKIs）与细胞周期蛋白-CDK复合物的结合由多种抗有丝分裂信号触发，导致这些复合物的催化活性受到抑制，从而抑制细胞周期进展(56). 在已鉴定的各种CKI中，p27在控制细胞增殖中起着关键作用(40，45，61). 我们和其他人已经证明，p27基因缺失的纯合子小鼠比野生型动物大，并且表现出多器官增生以及癌症倾向(11，24，37). 这些观察结果支持这样一种观点，即p27在细胞增殖控制中发挥作用，是身体和器官大小的关键决定因素。

p27的丰度被认为是由多种机制控制的，这些机制在该蛋白的合成（转录和翻译）、蛋白水解和定位水平上起作用(1，7，16，18，32，33，44，51). p27的降解是由其在Thr上的磷酸化触发的¹⁸⁷通过cyclin E-CDK2复合物(55，64)并由泛素蛋白酶体系统执行(44，58). Thr的磷酸化¹⁸⁷是p27与Skp2结合所必需的，Skp2是SCF泛素连接酶（E3）复合物的F-盒蛋白成分，这种结合反过来导致p27的泛素化和降解(三，59，62). 与这种情况一致，我们证明了Skp2缺陷小鼠的体型缩小，并且细胞S期激酶相关蛋白2^−/−细胞显示p27的积累增加(38).

在正常细胞中，在G₀细胞周期的一个阶段，但在细胞重新进入G时迅速减少₁阶段。例如，静止淋巴细胞的有丝分裂激活或血清剥夺的胚胎成纤维细胞再次暴露于血清，会在刺激后3至9小时内诱导p27快速降解。然而，Skp2直到G₁-细胞周期的S转换（刺激后12至18小时），明显晚于在G₀-G公司₁(15). 此外，p27在G处从细胞核输出到细胞质₀-G公司₁(7，18，51，60)，而Skp2仅限于细胞核(30，34). p27表达的时间和空间模式与Skp2表达的时间模式和空间模式之间的差异表明存在着p27降解的Skp2-independent途径。事实上，G区p27的下调₀-G公司₁转换正常发生，对蛋白酶体抑制剂敏感细胞S期激酶相关蛋白2^−/−细胞，表明p27在G₀-G公司₁由蛋白酶体依赖但Skp2依赖的机制。在细胞S期激酶相关蛋白2^−/−p27降解仅在S和G细胞中受损₂相位，这种缺陷通过p27的积累导致Cdc2激酶的抑制(39). 粗提取物的生化分析细胞S期激酶相关蛋白2^−/−细胞显示在胞浆部分存在Skp2诱导的E3活性，该活性介导p27的泛素化(15). 这种泛素化并不依赖于Thr上p27的磷酸化¹⁸⁷，这是Skp2介导的泛素化的先决条件。

我们最近发现了一种泛素连接酶，命名为KPC（Kip1泛素化促进复合物），由KPC1和KPC2亚基组成，负责p27从G₀至G₁(19，26). KPC1在其COOH末端附近含有一个环指结构域，作为催化亚单位发挥作用。KPC2包含NH₂-末端泛素样（UBL）结构域、两个泛素相关（UBA）结构域和一个COOH-末端STI1（热休克伴侣蛋白结合）结构域，表明它是UBL-UBA蛋白质家族的成员，包括hHR23A和hHR23B以及hPLIC1和hPLIC12智人以及的Rad23和Dsk2酿酒酵母(6，13，17，25，48，50，53，65). 这些蛋白质的UBL结构域是与26S蛋白酶体的19S复合物相互作用所必需的(8，49，52，53，63)而UBA结构域与多泛素链相互作用(2，47，48，66). 因此，UBL-UBA蛋白被认为可以将多泛素化底物传递到26S蛋白酶体(5，48，49，63).

为了深入了解KPC2在KPC介导的p27降解调控中的作用，我们现在描述了KPC2的结构-功能关系。我们的数据表明，KPC2促进由KPC1泛素化的p27分子转移到26S蛋白酶体，并有助于KPC1的稳定。我们发现STI1结构域是p27多泛素化和KPC1稳定所必需的，其功能基本上未知。因此，KPC2似乎与KPC1在G处协同调节p27降解₁细胞周期的阶段。

材料和方法

结果

我们最近确定了KPC，一种由KPC1和KPC2亚单位组成的E3，负责G中p27的降解₁阶段。KPC1在其COOH末端附近含有一个环指结构域，起到催化亚单位的作用，而KPC2在其NH附近含有UBL结构域₂末端、两个UBA结构域和一个靠近COOH末端的STI1结构域（图。​（图1A）。1安培). KPC2的整体结构与UBL-UBA家族成员hHR23A和hHR23B（人类同源物酿酒酵母Rad23）、hPLIC1和hPLIC2（人类同源物酿酒酵母Dsk2），尽管STI1结构域的位置和数量在不同的分子中不同。这些结构特征表明KPC2也是该蛋白家族的一员。

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图1。

KPC2的结构。（A） 人类KPC1和KPC2以及hHR23B和hPLIC1的域组织。（B） 人类KPC2（残基14至96）和hHR23B（残基1至79）UBL结构域氨基酸序列的比对。图中显示了相同（黑色）和类似（灰色）氨基酸。指出了hHR23B UBL结构域的二级结构元素。星号表示hHR23B中对与S5a的COOH末端泛素相互作用基序相互作用很重要的残基。（C） 人KPC2和hHR23B的UBL结构域的模型结构（蛋白质数据库代码1UEL）。hHR23B残基的侧链对结合到S5a的COOH末端泛素相互作用基序很重要，如图所示。使用Modeller程序建立了KPC2 UBL域的模型结构。对关键氨基酸进行标记和编号。

hHR23B的UBL结构域能够与19S蛋白酶体复合体的S5a（非ATP酶亚基）结合(12，17，65)折叠成α/β结构，由五股扭曲的β片组成，具有长的α螺旋骨架，与泛素的结构极为相似(12). 对人KPC2的UBL结构域（残基14到96）和hHR23B的UBL区域（残基1到79）的氨基酸序列进行比对后发现，在KPC2中形成hHR23B二级结构元素的残基类似（图。​（图1B）。1B年). hHR23B与S5a相互作用的残基(12)也保存在KPC2的UBL结构域中（残基Lys⁶²，伊利⁶⁴，阿拉⁶⁶，阿拉⁶⁷，瓦尔⁸⁸、和Leu⁹⁰)；卢⁸和Tyr⁴⁸然而，也有助于与S5a相互作用的hHR23B在KPC2中不保守。使用程序FUGUE比较KPC2的UBL序列与数据库中已知三级结构的序列(57). 泛素（蛋白质数据库代码1UBQ）的结构预计与KPC2的UBL结构域的结构最为相似，具有Z轴得分6.52分，信度≥99%。另外五种含有泛素样折叠的蛋白质产生了Z轴得分>4.0。因此，这些结果表明KPC2的残基14-96采用泛素样折叠。我们用Modeller程序建立了KPC2的UBL域的结构模型(29)（图。​（图1C）。1摄氏度). 模型结构表明，hHR23B的UBL结构域中负责与蛋白酶体亚基S5a相互作用的残基类似地位于KPC2的UBL结构域中，并且KPC2和hHR23B的UBL结构域共享相同的折叠。

为了研究KPC2是否与蛋白酶体相互作用，我们通过凝胶过滤柱层析分离NIH 3T3细胞裂解物，并通过免疫印迹分析检查KPC2、19S蛋白酶体复合体的非ATP酶亚基S10和S12以及20S蛋白酶体的α亚基的洗脱图谱。虽然在组分9和10中有少量KPC2与S10、S12和20S蛋白酶体亚基共稀释，但大多数蛋白质在组分13至17中检测到（图。​（图2A）。2安培). 先前用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后，KPC2的洗脱曲线发生了变化，更多的蛋白质与第8至11段中蛋白酶体的S10、S12和α亚基共溶。这些结果表明，用蛋白酶体抑制剂处理细胞可促进KPC2与蛋白酶体的结合。UBL-UBA蛋白hPLIC1、hPLIC2和Rad23也有类似的观察结果(25，52).

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图2。

KPC2与蛋白酶体的相互作用。（A） 凝胶过滤色谱上KPC2与蛋白酶体亚基的共溶。NIH 3T3细胞在10μM MG132或载体存在下孵育6 h，裂解并通过凝胶过滤柱色谱分离。用KPC2、19S蛋白酶体复合体的S10或S12亚单位以及20S蛋白酶体的核心α亚单位（亚单位1、2、3、5、6和7）的抗体对所得组分（以及细胞裂解物[lane L]）进行免疫印迹分析。标记蛋白（甲状腺球蛋白669kDa；铁蛋白440kDa、牛血清白蛋白67kDa和核糖核酸酶A 13.7kDa）的洗脱位置和空隙体积(V（V）_o个)显示。（B） 19S蛋白酶体复合物S5a亚单位与KPC2的共免疫沉淀。将HEK293T细胞在有无MG132的情况下（左、右面板）孵育4 h，裂解，并用KPC2兔抗体或对照兔IgG进行免疫沉淀（IP）。用抗KPC1、KPC2、S5a和糖原合成酶激酶-3β的抗体（内部对照）对所得沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。（C） S12和KPC2的免疫共沉淀。如图所示，用编码KPC2（标记有三个FLAG表位）或S12（标记有HA表位）的表达质粒转染HEK293T细胞。然后将其与MG132孵育4 h，裂解，并用FLAG或HA抗体进行免疫沉淀。用相同的抗体对产生的沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也直接进行免疫印迹分析。（D） S10与KPC2的各种突变体共免疫沉淀。表达所示三种FLAG标记KPC2衍生物或转染空载体（Mock）的HEK293T细胞与MG132孵育4 h，裂解，并用FLAG抗体进行免疫沉淀。用S10或FLAG抗体对所得沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。

因此，我们接下来研究了HEK293T细胞中内源性KPC2和蛋白酶体之间潜在的生理相互作用。用MG132孵育细胞，用KPC2抗体或对照免疫球蛋白G（IgG）对细胞裂解物进行免疫沉淀，并对所得沉淀进行免疫印迹分析。蛋白酶体亚单位S5a和KPC1被KPC2抗体特异性共沉淀（图。​（图2B）。第2页). 此外，在未接触MG132的细胞中，KPC2和S5a之间的关联程度显著降低，但KPC2和KPC1之间的相互作用程度没有显著降低。为了证实KPC2和蛋白酶体之间的相互作用，我们用表达载体转染HEK293T细胞，表达载体包括在其COOH末端标记有三个FLAG表位的KPC2和在其NH末端标记的S12₂末端有HA。将转染细胞与MG132孵育后，用HA或FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。对所得沉淀物的免疫印迹分析表明，KPC2与S12相关（图。​（图2C2摄氏度).

鉴于其他UBL-UBA蛋白的UBL结构域被认为是与蛋白酶体相互作用所必需的，我们研究了KPC2的UBL域在其与蛋白酶体的关联中的作用。在HEK293T细胞中表达具有COOH末端三FLAG标签的野生型或突变形式的KPC2，将细胞与MG132孵育，并对细胞裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹分析（图。​（图2D）。二维). 野生型KPC2与内源性蛋白酶体亚单位S10相互作用。出乎意料的是，KPC2（ΔUBL）缺少UBL域（见图。​图7），7)，绑定到S10以及野生型KPC2。KPC2（ΔUBAn），缺少NH₂-末端UBA结构域，也与S10相关，但程度降低。KPC2（ΔUBL-UBAn），缺少UBL域和NH₂-终端UBA域，不与S10相互作用。COOH末端UBA结构域[KPC2（ΔUBAc）突变体]的缺失不影响KPC2与S10的相互作用。仅由NH组成的突变体₂-跨UBL和UBAn域的KPC2末端区域被发现足以与S10相互作用。总之，这些数据表明，与其他UBL-UBA家族蛋白质相比，更广泛的NH₂-KPC2的末端区域需要与26S蛋白酶体相互作用。我们还证实，KPC2结构的这些改变不会影响这种蛋白质的细胞内分布（数据未显示）。

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图7。

KPC2在调节p27降解中的作用。本研究中产生的KPC2缺失突变体的示意图。KPC2包含一个UBL结构域（残基14到96）、两个UBA结构域（残留基196到230和289到325）和一个STI1结构域（残余基352到391）。检测KPC2衍生物（i）与蛋白酶体、多泛素化蛋白质和KPC1结合能力的实验结果；（ii）支持p27泛素化；和（iii）总结了表达KPC2 shRNA的NIH 3T3细胞中KPC1的失稳或p27降解的损害。ND，未确定。

Rad23的UBA结构域与多泛素链相互作用(2，6，48). 为了研究KPC2是否也与多泛素化蛋白结合，我们将GST-KPC2融合蛋白与S100部分HeLa细胞孵育。用谷胱甘肽珠沉淀与GST-KPC2相关的蛋白质，并用多泛素抗体进行免疫印迹分析。与Rad23一样，发现KPC2与多泛素化蛋白相互作用（图。​（图3A）。3A级). 为了绘制与多泛素化蛋白结合所需的KPC2区域，我们生成了包含KPC2缺失突变体的GST融合蛋白，并对其进行相同的结合分析。KPC2（ΔUBL）和KPC2（ΔSTI1），后者缺乏STI1结构域，都保留了与多泛素化蛋白结合的能力（图。​（图3A）。3A级). 相反，KPC2（ΔUBAc）仅与多泛素化蛋白弱结合，KPC2几乎完全丧失了与这些蛋白相互作用的能力。

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图3。

KPC2的UBA结构域在与多泛素化蛋白结合中的作用。（A） KPC2衍生物与多泛素化蛋白质的体外结合。野生型KPC2或其突变体的GST和GST融合蛋白与HeLa细胞的S100组分在4℃孵育2 h，然后用谷胱甘肽珠沉淀。用多泛素或GST抗体对珠子结合材料进行免疫印迹分析。S100部分也直接进行免疫印迹分析。（B） KPC2衍生物与多泛素化蛋白质的体内结合。用标记有三个FLAG表位的野生型或突变形式的KPC2的质粒转染的HEK293T细胞与MG132孵育4小时，裂解，并用FLAG抗体进行免疫沉淀。用多泛素或FLAG抗体对产生的沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。IB，免疫印迹；免疫沉淀；聚Ub，聚泛素化。

为了证实这些体外观察结果，我们用野生型或突变型KPC2表达载体转染HEK293T细胞，在其NH处标记有三个FLAG表位₂终点站。用MG132培养细胞，以促进KPC2与多泛素化蛋白的潜在相互作用，裂解并用FLAG抗体进行免疫沉淀。与体外结合数据一致，野生型KPC2和KPC2（ΔUBL）与多泛素化蛋白有效结合，而KPC2（△UBAc）与这些蛋白的相互作用水平大大降低，KPC2（δUBA）没有表现出这种关联（图。​（图3B）。3B公司). 这些结果表明KPC2通过其UBA结构域与多泛素化蛋白结合，尤其是NH₂-终端UBA域。

我们之前已经证明KPC1和KPC2在细胞质中广泛共存(19). 为了评估细胞中KPC2与KPC1的关联程度，我们通过凝胶过滤柱上的色谱分离HEK293T细胞裂解物，并通过免疫印迹分析检查KPC1和KPC2的洗脱图谱（图。​（图4A）。4A级). KPC2（50 kDa）与KPC1（140 kDa。我们还对内源性蛋白质进行了交互共免疫沉淀实验，发现内源性KPC1和KPC2的很大一部分相互关联（图。​（图4B）。4B类). 这些结果表明，KPC1和KPC2在HEK293T细胞中以异二聚体或异四聚体的形式存在。

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图4。

通过与KPC2的相互作用稳定KPC1。（A） 用凝胶过滤柱色谱分离HEK293T细胞裂解物，并用KPC1或KPC2抗体对所得组分进行免疫印迹分析。星号表示与KPC2抗体交叉反应的蛋白质的位置。（B） HEK293T细胞裂解物用KPC1或KPC2抗体或对照IgG进行免疫沉淀，所得沉淀物（以及1%的输入裂解物）用KPC1和KPC2抗体进行免疫印迹分析。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（C） 用环己酰亚胺（50μg/ml；CHX）处理稳定表达KPC1（标记有FLAG表位）且带有或不带有KPC2（标记有HA表位）的NIH 3T3细胞指定时间，然后用FLAG、HA或HSP90抗体对细胞裂解液进行免疫印迹分析（对照）。（D） 从NIH 3T3细胞制备的裂解物稳定表达KPC2 mRNA或EGFP mRNA特异性shRNAs（对照），用KPC1、KPC2或HSP70抗体进行免疫印迹分析（对照）。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（E） 表达所示三种FLAG标记的KPC2衍生物的HEK293T细胞裂解液用FLAG抗体免疫沉淀，所得沉淀用KPC1或FLAG抗体进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。免疫球蛋白_L（左），免疫球蛋白轻链。（F） 表达KPC2或EGFP shRNAs的NIH 3T3细胞被编码所示人类KPC2衍生物（标记有HA表位）的逆转录病毒载体或相应的空逆转录病毒（Mock）感染。随后用KPC1、HA、KPC2或HSP70抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（对照）。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（G） 用KPC1载体（标记有FLAG表位）和野生型（WT）KPC2、KPC2（ΔSTI1）或KPC2（△UBL-SI1）载体转染HEK293T细胞，每种载体都标记有HA表位或相应的空载体（Mock）。用FLAG或HA抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用相同的抗体对所得沉淀（以及1%的输入裂解物）进行免疫印迹分析（上面板）。或者，转染细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸1小时，清洗并孵育指定的追逐期，之后用FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术分析所得沉淀物（左下方）。The intensities of the³⁵S标记的KPC1条带通过扫描密度测定法进行定量（右下方）。IB，免疫印迹。

我们观察到，当该蛋白与转染细胞中的KPC2共表达时，KPC1的丰度更大。为了确定这一观察结果是否可归因于KPC2对KPC1的稳定作用，我们在没有或存在HA标记KPC2的载体的情况下，用FLAG标记KPC1的载体稳定地转染NIH 3T3细胞。细胞与环己酰亚胺（50μg/ml）孵育不同时间以阻止蛋白质合成，并通过免疫印迹分析测定KPC1降解率（图。​（图4C）。4摄氏度). KPC1在同时表达KPC1和KPC2的细胞中比单独表达KPC1的细胞更稳定。为了研究KPC2在生理条件下是否增加KPC1的稳定性，我们检测了RNAi耗尽KPC2对NIH 3T3细胞内源性KPC1稳定性的影响（图。​（图4D）。4D（四维）). 与感染对照载体的细胞相比，感染了编码KPC2 mRNA特异性短发夹RNA（shRNA）的逆转录病毒载体的细胞，KPC2的丰度下降了80%以上。RNAi对KPC2的消耗也导致KPC1数量的显著减少，这似乎与KPC2数量的减少成正比。这些结果表明，KPC2是稳定KPC1所必需的。

为了确定与KPC1相互作用所需的KPC2区域，我们用NH表达载体转染HEK293T细胞₂-末端三个FLAG标记的KPC2衍生物，并检测这些蛋白质与内源性KPC1相关的能力（图。​（图4E）。第四版). KPC2（ΔUBAn）、KPC2（△UBAc）和KPC2（δSTI1）保留了与KPC1结合的能力，而KPC2（λUBL）没有，表明KPC2和KPC1之间的相互作用是由KPC2的UBL域介导的。我们还检测了其他各种KPC2突变体，包括KPC2（ΔUBA），它缺少UBAn结构域的COOH末端区域，以及KPC2（△UBL-UBAc），它缺乏UBL和UBAc结构域（见图。​图7）。7). 所有缺少UBL结构域的突变体（ΔUBL、ΔUBL-UBAn和ΔUBL-UBAc）都不能与KPC1相互作用（图。​（图4E），第四版)，表明此域是绑定所必需的。然而，考虑到UBL域本身并没有与KPC1关联，这个域还不足以进行绑定。与这些观察结果一致，KPC2（ΔUBA）不与KPC1相互作用，而UBL-UBAn与KPC1交互作用，表明KPC2的UBAn域也有助于与KPC1的相互作用。

为了描述KPC2稳定所需的KPC2区域，我们通过转染编码小鼠KPC2 mRNA特异shRNA的逆转录病毒载体，在内源性KPC2缺失的NIH 3T3细胞中表达了人类KPC2的HA标记野生型或突变型。KPC2 shRNA特异性下调内源性小鼠KPC2的表达，而不影响异位人类KPC2的表现。免疫印迹分析显示，人类野生型KPC2、KPC2（ΔUBAn）或KPC2（△UBAc）的表达，而不是KPC2（δUBL）的表达逆转了由RNAi介导的内源性小鼠KPC2耗竭诱导的KPC1失稳（图。​（图4F），4楼)，表明KPC2与KPC1的关联是KPC1稳定的必要条件。相反，在表达KPC1（ΔSTI1）的细胞中，KPC1似乎比用相应的空载体转染的细胞更不稳定。我们通过脉冲相位分析进一步测试了KPC2的STI1结构域对KPC1稳定性的影响（图。​（图4G）。4G网络). 将FLAG标记的KPC1载体与HA标记的野生型KPC2或KPC2（ΔSTI1）突变体载体或空载体一起瞬时转染HEK293T细胞。KPC2（ΔSTI1）促进KPC1降解。KPC2（ΔUBL-STI1）缺乏UBL和STI1结构域，并且不与KPC1相互作用，也促进了KPC1降解，但与KPC2的作用相比，其降解程度大大降低（图。​（图4G）。4G网络). 因此，这些数据表明KPC2的STI1域有助于KPC1的稳定。

Rad23的UBA结构域被证明可以抑制多泛素链的组装(6，43). 为了研究KPC2结构域在p27泛素化中的作用，我们共表达了His₆-和FLAG标记的KPC1以及昆虫细胞中带有HA标记的野生型KPC2突变形式，并将重组复合物纯化至接近同质性，以测试其在ATP、Uba1、UbcH5A和GST-泛素存在下体外催化p27泛素化的能力。在这些条件下，在没有E3（仅存在E1和E2）的情况下观察到p27的泛素化。在野生型KPC2、KPC2（ΔUBAn）或KPC2（ΔUBAc）存在的情况下，p27的多泛素化同样明显，但在KPC2（ΔSTI1）存在的情况下，其程度大大降低（图。​（图5）。5). 这些数据表明，KPC2的STI1结构域对于KPC介导的p27泛素化是不可或缺的。

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图5：。

KPC2突变体对体外p27泛素化的影响。检测KPC1和KPC2衍生物的重组复合物在Uba1、UbcH5A、GST-泛素和ATP存在下介导p27多泛素化的能力。用p27或GST抗体对反应产物进行免疫印迹（IB）分析（上部两个面板）。底部面板显示反应中使用的重组KPC1（标记有FLAG表位）和KPC2衍生物（标记有HA表位）数量的免疫印迹分析。野生型；GST-Ub、GST-泛素。

我们应用RNAi来确定内源性KPC2耗竭对从G₀至G₁在NIH 3T3细胞中。在去除血清96小时后，表达小鼠KPC2 shRNA或EGFP shRNA（对照）的细胞被刺激重新进入细胞周期，方法是以～40%的密度进行重放，并在完全培养基中培养不同时间。然后用p27抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。与对照细胞相比，在表达KPC2 shRNA的细胞中，血清再刺激诱导的p27数量减少受到明显抑制（图。​（图6A）。6A级). 考虑到KPC2 shRNA下调KPC2表达也导致KPC1数量减少，目前尚不清楚KPC1和KPC2或仅KPC1是否需要在G₀-G公司₁过渡。为了解决这个问题，我们用编码人KPC2衍生物的逆转录病毒感染表达小鼠KPC2 shRNA的NIH 3T3细胞，并检测这些蛋白质对p27降解的影响（图。​（图6B）。6亿). 野生型人类KPC2或KPC2（ΔUBAc）的表达挽救了p27降解中的损伤，因为它们都挽救了KPC1的不稳定性（图。​（图4F）4楼)由内源性KPC2耗竭诱导，而KPC2（ΔSTI1）不稳定KPC1。相反，KPC2（ΔUBAn）的表达稳定了KPC1（图。​（图4F），4楼)，它没有逆转p27降解的损伤。尽管与野生型KPC2相比，KPC2（ΔUBAc）结合多泛素化蛋白的能力大大降低，但突变体的这种低水平结合可能足以补偿敲除细胞中内源性KPC2过度表达时的损失。然而，与NH相比，COOH末端UBA结构域的缺失对KPC2的整体结构的危害较小，这也是可能的₂-终端UBA域。鉴于KPC2（ΔUBL）既不能结合也不能稳定KPC1，我们无法评估KPC2 UBL结构域在p27降解中的功能重要性。这些观察结果表明，KPC2与KPC1合作调节p27的降解，而NH₂-KPC2的末端UBA结构域是p27降解所必需的，这可能是由于它与多泛素化p27和蛋白酶体相互作用的结果。

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图6。

KPC2对p27降级的要求。（A） RNA干扰导致KPC2缺失对p27降解的影响。稳定表达KPC2或EGFP shRNAs的NIH 3T3细胞在G₀分阶段接触抑制和血清剥夺，然后通过在～40%的密度下重放并在完全培养基中孵育指定时间来刺激重新进入细胞周期。然后用p27或HSP70抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（左面板）。p27条带的强度被量化并绘制出来（右侧面板）。（B） 通过引入人KPC2衍生物补充表达小鼠KPC2 shRNA的NIH 3T3细胞中受损的p27降解。表达KPC2或EGFP shRNA的NIH 3T3细胞用所指示的人KPC2衍生物的逆转录病毒载体（用HA表位标记）或用相应的空逆转录病毒（Mock）感染。然后检测细胞在G期的p27降解情况₁如图A.IB，免疫印迹。

讨论

静止状态下CKI p27的含量较高（G₀)但在细胞进入细胞周期时，泛素蛋白酶体系统降解蛋白质，导致蛋白质迅速减少。我们最近发现了一种泛素连接酶复合物KPC，它由KPC1和KPC2亚基组成，并在G₀-G公司₁过渡(19，26). 尽管环指蛋白KPC1被证明是催化亚单位，但UBL-UBA蛋白KPC2的作用尚不清楚。我们现在证明KPC2稳定KPC1，招募多泛素化蛋白，并与26S蛋白酶体相互作用，从而促进p27的降解（图。​（图7）。7). 根据我们目前的观察结果，我们认为KPC2的功能是将泛素化蛋白质传递到蛋白酶体。因此，KPC1（调节器）、KPC2（适配器）和26S蛋白酶体（效应器）的复合体似乎适合确保在细胞从静止状态进入细胞周期时快速有效地去除p27。

UBL-UBA蛋白家族的成员，包括hHR23A和hHR23B以及hPLIC1和hPLIC2，被认为可以将多泛素化底物传递到蛋白酶体(5，8，47-49，52，53，63). 与其他UBL-UBA蛋白类似，KPC2结合蛋白酶体和多泛素化蛋白，这些相互作用分别由UBL和UBA结构域介导。因此，KPC2具有其他UBL-UBA蛋白质的基本生化特性。然而，我们的分析表明KPC2也具有其他UBL-UBA蛋白所不具备的特性。缺少UBL结构域的KPC2突变体因此保留了与蛋白酶体相互作用的能力，并且发现KPC2的两个UBA结构域都是与多泛素链结合所必需的。在前一种情况下，KPC2突变体可能与内源性KPC2或其他因子相互作用，从而绕过对UBL结构域的绝对要求。在后一种情况下，NH可能₂-KPC2的末端和COOH-末端UBA结构域独立地需要与多泛素结合，或者一个结构域的缺失会影响另一个的功能。与之前的观察一致，我们发现大量过量的KPC2抑制p27泛素化（数据未显示）。然而，这些结果是否真正反映了生理状况尚待确定。

KPC2与E3连接酶KPC1形成复合物，并通过泛素蛋白酶体途径促进其特定底物p27的降解。hHR23与E3s E6AP、p300和后期促进复合体/环体结合，参与p53和其他细胞周期调节因子的降解(14，27，54，69). Rad23通过其UBL域与U盒型泛素连接酶Ufd2相互作用(22，49). 此外，PLIC蛋白通过UBL结构域与蛋白酶体和E6AP相互作用(25). 泛素折叠也在其他各种蛋白质中被识别，包括c-Raf-1的Ras结合域和Bem1p的PB1域，似乎有助于蛋白质相互作用(9，68). 因此，这些观察结果表明，大多数UBL-UBA蛋白在生理上与泛素连接酶组分以及通过其UBL结构域与蛋白酶体相关，从而在泛素化机制和蛋白酶体之间起桥梁作用(49，63).

STI1结构域已在除KPC2以外的几个UBL-UBA蛋白中鉴定。Dsk2的STI1结构域是与截短的HSP70样蛋白Stch的ATP酶结构域相互作用所必需的(21). hHR23B以依赖于其STI1结构域的方式稳定XPC蛋白（着色性干皮病C组），XPC蛋白有助于识别核苷酸切除修复的DNA损伤(31，42)；事实上，与hHR23B的STI1结构域相对应的小多肽足以刺激XPC在核苷酸切除修复中的活性。再加上我们发现KPC2的STI1结构域对KPC1的稳定必不可少，这些观察结果表明UBL-UBA蛋白的STI结构域可能对其结合伙伴起到伴侣作用。KPC2的STI1结构域可能在维持KPC1的正常结构方面发挥作用。因此，该结构域的缺失可能导致KPC1的构象改变，从而导致p27结合、p27泛素化或两者的损伤。

KPC负责G处p27的降解₀-G公司₁我们现在已经证明UBL-UBA蛋白KPC2在这一过程中起着重要作用。p27基因突变在人类癌症中似乎很罕见。然而，各种癌症中p27丰度降低与预后不良密切相关(4，28，35，46). 此外，小鼠中p27等位基因的丢失增加了这些动物对致癌剂的敏感性(10). 因此，阐明KPC调节p27降解的分子机制可以深入了解这种CKI在肿瘤细胞中的表达改变，以及这种表达改变是细胞转化的原因还是结果。事实上，Skp2在许多人类癌细胞中过度表达，这表明由Skp2介导的p27降解可能与致癌有关(41，67). 因此，癌细胞中p27降解的KPC途径也可能被解除调控。

致谢

参考文献