这个酿酒酵母Set1复合物包括Ash2同源物和甲基化组蛋白3赖氨酸4

摘要

介绍

三胸类（trxG）的成员已通过以下基因筛查进行鉴定：果蝇属对于因多梳群（PcG）作用失调或模拟功能丧失同源突变表型而导致表型抑制的突变。正如从这些复杂的遗传筛选中所预期的那样，trxG似乎包含了基因调控因子的几个亚类(肯尼森，1995). 一个亚类涉及染色质重塑活性。认识到trxG成员梵天（BRM）是酿酒酵母Swi2/Snf2(彼得森和赫斯科维茨，1992年;卡尔森和洛朗，1994年;Elfrin等人，1994年)导致SWI/SNF复合物被定义为染色质重塑机器(Cote等人，1994年;罗吉和彼得森，1997年)以及另一名trxG成员的身份，莫伊拉，作为果蝇属SWI/SNF复合体(Papoulas等人，1998年). 另一个trxG亚类包括DNA结合蛋白、zeste和GAGA因子。虽然这些蛋白质独立起作用，但两者在稳定高阶染色质环中起着相似的作用(Chen和Pirrotta，1993年;Katsani等人，1999年). trxG中的第三个子类（这里称为trxG3）仍然很难理解，包括三胸自身，灰烬1和灰烬2(Shearn，1989年).

对trxG3成员潜在分子作用的深入了解来自对其蛋白质序列中几个结构域的鉴定(Mazo等人，1990年;Stassen等人，1995年;亚当森和谢恩，1996年;Tripoulas等人，1996年). trithorax（Trx）和Ash1都包含一个SET结构域，通过其在染色质因子Su（var）3-9、zeste增强子[E（Z）]和Trx中的出现进行鉴定(Jones和Gelbart，1993年;Tschiersch等人，1994年). 所有三个trxG3成员还包括一个或多个PHD手指(Aasland等人，1995年)Ash2包括一个SPRY域(Ponting等人，1997年). 在这些结构域中，Su（var）3-9同源物中的SET结构域，特别是哺乳动物SUV39H1和葡萄裂殖酵母Clr4最近被鉴定为第一个组蛋白赖氨酸甲基转移酶(Rea等人，2000年)从而表明其他含有SET结构域的蛋白质也可能是组蛋白赖氨酸甲基转移酶。随后，另外两个SET域蛋白，人类G9a(Tachibana等人，2001年)和果蝇属Ash1（C.Beisel、A.Imhof和F.Sauer，正在制备中）已被证明具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性。值得注意的是，这些蛋白质中的每一个都有一个额外的富含半胱氨酸的基序，紧邻其SET结构域的N端，以前称为富含半胱甘氨酸的簇或preSET区域。SUV39H1中存在的preSET区域是甲基转移酶活性所必需的(Rea等人，2000年). Trx同源物包含不同类型的preSET区域，称为ATA2(Prasad等人，1997年). SUV39型preSET结构域的缺失是否是迄今为止Trx和E（Z）在甲基转移酶测定中检测呈阴性的原因(Rea等人，2000年；C.Beisel、A.Imhof和F.Sauer（准备中）尚不清楚。

通过序列比对面包酵母编码六个与SET域（现在称为Set1-6；Pijnappel等人，2001年). 其中，Set1的SET域与Trx-SET域最为相似。Set1似乎不包含preSET Cys-rich区域。事实上，面包酵母似乎没有明确的Su（var）3-9同源。集合1对酵母来说不是必需的，但对其突变表型的彻底分析揭示了多种缺陷，包括在交配型位点和端粒沉默、代谢、端粒长度维持中的作用(Nislow等人，1997年)和DNA修复(Corda等人，1999年;Schramke等人，2001年). 值得注意的是，哺乳动物E（Z）同源物（人类EZH2或小鼠EZ1）在集合1菌株恢复了端粒基因抑制的缺失(Laible等人，1997年). 在中进一步探索Set1函数面包酵母，我们使用序列标记和质谱方法对Set1复合物（Set1C）及其蛋白质组环境进行了表征(Rigaut等人，1999年;舍甫琴科等人，1999年). 我们将Set1C定义为一个由八个成员组成的复合物，其中包括两个分别显示SPRY结构域和PHD指的蛋白质。因此，似乎Set1C通过物理结合两个蛋白质来结合Ash2类似物，每个蛋白质都携带一部分Ash2。在这里，我们表明Set1C具有组蛋白3（H3）的赖氨酸4特异的组蛋白甲基转移酶活性，因此它是面包酵母以及来自SET域的Set1/Trx分支的第一个。总之，这些结果意味着富含Cys的preSET区域在某些情况下对组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性不是必需的，trxG3作用的意外方面也存在于面包酵母.

结果

Set1C的生化特性

通过用TAP标记对Set1进行C末端标记，确定与Set1相关的蛋白质复合物(里戈等., 1999)MALDI质谱法鉴定共纯化蛋白(威尔姆等., 1996;舍夫琴科等., 1999). 图中显示了所有考马斯染色带1然而，只描述了随后被确认为特异性的八种（见下文）。图中的所有其他条带1被鉴定为高度丰富的核糖体或热休克蛋白，并在标记无关蛋白的实验中发现（结果列于材料和方法中）。

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图1。Set1复合体的组成。亲和纯化的Set1-TAP复合物在7–25%SDS–PAGE上分离，并用考马斯蓝染色进行可视化。左侧显示的分子量标记单位为千道尔顿。鉴定了该凝胶中存在的所有条带，并随后通过重复和进一步的亲和纯化练习确定了那些对Set1C具有特异性的条带。每个蛋白质都用可识别的蛋白质域和基序来描述，如下面的图例所示。Set1和Spp1中加厚的灰色线表示进一步保护的区域S.pombe公司蛋白质分别为Set1和SPBC13G1.08c，Bre2中加厚的灰色线表明与SPRY结构域两侧的Ash2进一步同源的程度（见图三C） ●●●●。每个多肽（aa）的长度标注在右侧。所示域为：PHD指（Pfam:PF00628）；n-SET（SET1家族中的n端SET关联域；见图三A） ；SET域（Pfam:PF00856）；SET后，C末端SET相关肽（SMART:00508）；WD域（Pfam:PF00400）；RIIa，蛋白激酶A调节亚单位二聚结构域（Pfam:PF02197）；RRM，RNA识别基序（Pfam:PF00076）和SPRY，SPlA激酶和ryanodine受体的结构域（Pfam：PF00622）。Bre2中的SPRY域被三次插入中断（见图三C） ●●●●。显示显著比对分数的WD40域以浅绿色显示，推断比对以白色显示（未显示数据）。

图中七种蛋白质分别与Set1-TAP特异性共纯化1标记并纯化和鉴定复合物（图2). 在七个病例中的五个病例中，在没有任何新的共纯化蛋白的情况下，对Set1C的所有八个成员进行了专门的检索。在第六个案例中，标记Sdc1产生了Set1C的所有成员，但Swd2除外，这可能是由于技术原因，在本实验中未确定。在最后一种情况下，Swd2-TAP只提取了Set1C（Set1，Bre2，Spp1）的一部分，并且意外地共同纯化了酵母裂解多聚腺苷酸化因子（CPF）复合物。B.Dichtl和W.Keller对CPF的独立工作证实了Swd2在CPF中的存在。尽管图中的实验并未确定CPF的所有成员2，我们的Swd2-TAP提取物对卵裂和聚腺苷酸化具有活性（B.Dichtl和W.Keller的个人交流结果）。Swd2被B.Dichtl和W.Keller称为Cpf10。值得注意的是，Swd2/Cpf10是Set1C中唯一对酵母至关重要的成员（SGD数据库；B.Dichtl和W.Keller，个人交流；我们未发表的观察结果），可能是因为它为CPF而非Set1C提供了重要功能。由于Swd2与Set1C共纯化，当其他七个成员中的六个被标记时，我们得出结论，它是一个真正的成员，原因是它与Set1C的关联不太稳定，或者Swd2上的TAP标签干扰Set1C或两者兼而有之。

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图2。Set1C的序贯亲和纯化。对Set1C的其他七个成员中的每一个进行TAP标记，并通过考马斯蓝染色对纯化的复合物进行可视化，如每个面板所示。每种蛋白质的身份通过质谱确定，并用数字表示（见右边的键）。许多未标记的带也被鉴定出来，发现是高度丰富的蛋白质（见材料和方法）。TEV裂解后，标签的存在使标记蛋白的大小增加了约10 kDa。

无论标记了哪一个成员（Swd2除外），Set1C的化学计量比似乎是一致的。仔细检查每个亲和纯化制剂的考马斯染色强度，得出Set1C化学计量比的类似估计。为了达成这一共识，我们不考虑标记蛋白质的化学计量学，因为如果在纯化过程中复合物部分分解，它们可能会被过度表示。我们估计Set1C为Set1（2）；Bre2（2）；Swd1（1）；Spp1（2）；Swd2（1）；开关3（1）；Sdc1（<1）；Shg1（<1；括号内为相对化学计量比）。与我们在Set3复合体（Set3C；Pijnappel公司等., 2001)，没有一个Set1C成员以游离蛋白的形式出现，也就是说，当以标记形式纯化时，其化学计量过剩明显（>4倍）。

Set1C成员的生物信息学分析

对Set1C的八个成员的蛋白质序列进行数据库匹配分析（图三). 数据库搜索确定了中Set1的候选同源序列S.pombe公司,秀丽隐杆线虫,果蝇属和人类。这五种预测的蛋白质不仅共享非常相似的SET结构域，而且还共享另外两个相似区域，其中一个区域包括与RNA识别基序（RRM，也称为RNP）相似的区域，即典型的RNA结合结构域（图三A） ●●●●。虽然所有五个蛋白质序列都呈现RNP基序，但Set1和S.pombe公司集合1进一步延伸RNP图案的任一侧（图中用粗灰色线表示1). 在SET结构域的N末端，即前SET位置，这五种蛋白质显示了一个新的保守区域，该区域包含约160个残基，称为N-SET。因此，我们得出结论，Set1同源基因存在于四种不同的真核生物中。此外，来自拟南芥基因组在n-SET和SET域中显示Set1同源性（图三A） 然而，从可用的序列数据中没有发现相关的RNP基序。

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图3。Set1C的序列分析。(A类)Set1家族成员的多序列比对显示RRM区域（上部）和n-SET/SET/postSET区域（下部）。对齐是彩色编码的，以便根据吉布森等.（1994年）。每个序列中的氨基酸配位在两个序列块的后面。RRM域（也称为RNP）以橙色条高亮显示。包括来自人类U2AF和RNPA的四个RRM进行比较。二级结构元素（H，螺旋；E，链）的分配基于已知的RRM结构(伯德和德雷福斯，1994年). 下面，n-SET区域由一个浅绿色的条表示，SET域由一个深绿色条表示，postSET基序由一个黄色条表示。SET结构域甲基转移酶催化核心的保守残基特征(雷亚尔等., 2000)用红点表示。终止密码子的位置用“<”表示。(B类)显示选定的预设区域的多重对齐。顶部显示了SUV39和G9a系列中的preSET区域，称为preSET-s。底部显示了E（Z）和ASH1族中的preSET区域preSET-E。(C类)Bre2的SPRY区域与Ash2系列的多重对齐。所示的同源区域比定义的SPRY结构域在N端和C端延伸得更远，在这次比对中，该结构域从残基61开始，到283结束。显示了32、46和42个残基在Bre2中的三个插入。(D类)Sdc1中一个区域与Dpy30和其他序列的多重比对，包括四个人类蛋白激酶a因子作为参考。该区域包含一个与蛋白激酶a调节亚单位的二聚化域（此处称为RIIa）相关的基序。图中显示了RIIa结构（pdb:1r2a）中两个α螺旋的位置。本图和本文其他地方使用的所有蛋白质的数据库来源见表二.

n-SET区域不富含半胱氨酸。然而，之前在SUV39、Ash1和E（Z）系列中观察到的富含Cys区域的性质尚未明确定义。因此，我们检查了这些富含Cys的区域的重要排列，发现它们分为两组，包括SUV39和G9a，此处称为preSET-s，或E（Z）和Ash1，此处称之为preSET-E（图三B） ●●●●。两者均与n-SET无显著相似性。与Trx家族ATA2中的preSET区域一起(普拉萨德等., 1997)，我们得出结论，preSET区域至少可分为四类，即ATA2、n-SET、preSET-s和preSET-e。

Bre2之前在一次对brefeldin（破坏高尔基体的毒素）耐药的突变筛查中被发现(Dinter和Berger，1998年). Δ的brefeldin电阻之间的关系布雷2我们发现Bre2完全局限于Set1C尚不清楚；然而，失去Set1会产生过多的细胞缺陷(Nislow等人，1997年;Corda等人，1999年)这可能包括细胞质蛋白移位的扰动。Bre2的序列分析揭示了一个SPRY域（图三C） ，是最初在splA激酶、ryanodine受体和trxG蛋白Ash2中发现的一个结构域(Ponting等人，1997年). 在SPRY结构域中，Bre2与Ash2蛋白家族中的结构域最相似。事实上，Bre2和Ash2之间的同源区域超出了SPRY域。与大多数其他SPRY域相比，Bre2中的SPRY区域被三个较大的插入所中断。这些中断可能表明在蛋白质折叠内的柔性环中插入（图三C） ●●●●。值得注意的是，到目前为止，除Bre2外，Ash2家族的所有成员都携带PHD手指。

Spp1型是面包酵母呈现PHD手指（未发表的观察结果）。Spp1的PHD指与S.pombe公司SPCC594.05c，然后与人类CGBP结合（数据未显示），这是一种优先与非甲基化CpG结合的蛋白质(Shin Voo等人，2000年).

Set1C包括三个推测的七个WD40重复蛋白。虽然Swd3包括七个具有统计意义的WD40重复，但Swd1和Swd2分别只显示五个或四个重复，其他重复是推断出来的（图中未显示为白色1).

Sdc1显示了与Dpy-30的显著匹配（图三D） ，一种在剂量补偿期间染色体凝聚因子的性别特异性关联所需的蛋白质线虫(Hsu等人，1995年). Sdc1、Dpy-30和近亲属包括一个与蛋白激酶a调节亚单位中的二聚化基序相关的短基序。该基序由两个α螺旋组成，在二聚化过程中形成一种特殊类型的四螺旋束(Newlon等人，1999年).

Shg1与数据库中的任何蛋白质序列均无显著相似性。

Set1C解剖

通过删除集合1携带TAP标签的菌株与其他Set1C成员融合（图4). 在没有Set1的情况下，我们观察到（i）Bre2-TAP和Sdc1仍然相关，没有发现其他Set1C成员；（ii）Sdc1-TAP和Bre2保持关联，未发现其他Set1C成员；（iii）Swd1-TAP和Swd3保持关联，未发现其他Set1C成员，（iv）Spp1-TAP及Shg1-TAP被检索为游离蛋白，与任何其他Set1C成员均未关联。因此，Set1是Set1C的核心，它在没有Set1C时几乎完全可以分解。在组装Set1C所需的各种蛋白质-蛋白质相互作用中，只有Swd1和Swd3以及Bre2和Sdc1之间的相互作用以前通过两种杂交方法绘制(Uetz等人，2000年;Ito等人，2001年). 值得注意的是，Bre2-TAP和Sdc1之间的化学计量关系为2:1；然而，Sdc1-TAP和Bre2之间为1:1（图4). 这意味着所有Sdc1都与Bre2相关，但只有一半Bre2与Sdc1相关。该观察结果还概括了Set1C中Bre2和Sdc1的相对化学计量学为2:1，以及观察到的两者的游离蛋白缺乏。因此，我们得出结论，所有细胞Bre2和Sdc1以2:1的比率并入Set1C，Sdc1稳定结合Bre2。

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图4。分析Set1C中的交互。Set1C的结构在集合1通过亲和纯化携带TAP-tagged Set1C成员的菌株，如上文所示。所有蛋白质的特性，包括许多未标记的非特异性条带都是通过质谱建立的。数字与图中相同22，Bre2；3、Swd1；4、Spp1；6、Swd3；7、Sdc1；第8页，第1页。

Set1C特异性甲基化H3的赖氨酸4

从Bre2-TAP或Shg1 TAP菌株纯化的Set1C提取物在与H3尾肽孵育时显示出组蛋白甲基转移酶活性（图5A） ●●●●。出乎意料的是，从Set1-TAP菌株纯化的Set1C提取物没有活性。由于三种制剂中Set1C的组成、化学计量和制备方法相同，我们将此结果归因于通过将蛋白质标签定位在Set1的C末端来抑制Set1C甲基转移酶活性。对于Set1，SET结构域通常位于SET结构蛋白的C末端，终止密码子的位置可以被视为一个保守特征（Ash1是一个显著的例外）。在Set1的C末端存在蛋白质标签可能会干扰结构域的适当折叠、抑制酶活性的动态方面或底物的进入。这些结果还表明，完全甲基转移酶活性对Set1C的形成是不必要的。作为Set1C甲基转移酶活性的对照，按照相同方案纯化的TAP-Clr4提取物显示出预期的酶活性和Δ集合1菌株没有活性（图5A） ●●●●。为了确定Set1C的特异性，将游离组蛋白与Set1C提取物和通过凝胶电泳和荧光成像显示的甲基化产物孵育（图5B） ●●●●。同样，TAP-Clr4对H3表现出预期的特异性，只有Bre2-TAP和Shg1-TAP提取物表现出活性。在每种情况下，只有H3被甲基化，其他组蛋白没有活性迹象。为了确定H3上的哪个位点被甲基化，我们用赖氨酸4或赖氨酸9特异性突变的H3肽培养Set1C提取物。虽然突变的赖氨酸9肽被甲基化，但突变的赖胺酸4肽没有甲基化。正如预期的那样，将这些肽与TAP-Clr4孵育得到相反的结果，突变赖氨酸9肽没有可检测的甲基化，而突变赖氨酸4肽（未显示）有强烈的甲基化。因此，我们得出结论，Set1C是组蛋白H3的赖氨酸4特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶。值得注意的是，到目前为止，我们还无法从Set1的重组表达部分获得任何甲基转移酶活性（未显示）。然而，我们的失败可能仅仅反映了一个技术问题，与上面的Set1-TAP结果一起，可能表明酶活性对复合物中适当环境的敏感性。

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图5。Set1C特异性甲基化H3的赖氨酸4。组蛋白甲基转移酶活性通过H3尾肽（A）或游离组蛋白（B）与亲和纯化提取物的培养进行检测，该提取物由携带TAP标签的酵母菌株制备，并与Clr4或Set1C组分融合，如上文所示。提取物由野生型或集合1菌株如图所示。TAP-Clr4提取物由携带TAP-Clr4-CEN质粒的野生型菌株制备。(A类)提取物与H3 N末端肽在S公司-腺苷-L（左）-[甲基-^三H] 蛋氨酸和通过过滤器结合测定的结合放射性。缓冲液，培养所有试剂，不添加任何提取物。(B类)提取物与游离组蛋白在S公司-腺苷-L（左）-[甲基-^三H] 蛋氨酸，然后进行凝胶电泳和考马斯蓝染色（左）和荧光照相（右）。(C类)从包括Bre2-TAP在内的野生型菌株中分离出的Set1C与携带赖氨酸4到亮氨酸（K4L）或赖氨酸9到亮氨酸突变（K9L）的H3 N-末端肽孵育。

端粒长度维持中的Set1C活性

在多种表型效应中集合1,Nislow等人（1997年）注意到端粒长度缩短了。因此，我们检测了携带Set1C突变菌株的端粒长度。同意Nislow等人（1997年），删除集合1端粒长度显著缩短约100 bp（图6，车道1和2）。在Set1 TAP菌株（泳道3）中，端粒也缩短，尽管没有那么显著。这与我们的证明一致，即使用Set1-TAP分离的Set1C缺乏甲基转移酶活性在体外（图5)并表明Set1C的组蛋白甲基转移酶活性有助于维持端粒长度。作为对照，含有N末端TAP-tagged Set1的菌株（TAP-Set1；第4通道）没有显示出端粒长度的任何减少，从而进一步加强了我们的结论，即TAP标签在Set1上的C末端定位选择性地干扰组蛋白甲基转移酶活性。含有Set1C成分缺失的菌株，布雷2,swd1型和开关电源3（5-7道）也显示端粒长度减少。鉴于任何一方的损失swd1型或开关电源3导致的缩短程度与集合1，损失布雷2产生了较温和的效果。结合Set1C的生化特征，这些结果表明，Set1在维持端粒长度方面的作用是由Set1C介导的，并涉及其甲基转移酶活性。在Set1-TAP和布雷2菌株还表明，Set1C对端粒的维持不仅依赖于其甲基转移酶活性，而且Set1C的另一方面也起到了作用。

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图6。维持端粒长度需要Set1C活性。使用端粒特异性探针通过Southern印迹策略观察端粒。从以下菌株中分离出基因组DNA：集合1（车道1）；野生型（车道2）；Set1-TAP（车道3）；TAP-Set1（车道4）；布雷2（车道5）；swd1型（6号车道）；开关电源3（第7车道）。

讨论

在高等生物的发育过程中，通过有丝分裂（通常称为表观遗传调控）稳定地维持基因表达模式似乎很重要。表观遗传机制为多细胞生物根据不同的细胞谱系以多种重叠模式利用基因组信息提供了一种途径(弗朗西斯和金斯顿，2001年). 研究表观遗传机制与高等真核生物发育之间的关系一直是由果蝇属确定了两组对立的候选人，PcG和trxG。PcG成员需要维持基因抑制模式，而trxG成员似乎需要维持基因活动模式(肯尼森，1995;Mahmoudi和Verrijzer，2001年). 对这些现象的更深入的分析尚未对发育中的PcG和trxG表观遗传机制提供简单的解释，最近的证据表明与信号、细胞周期和基础转录装置有复杂的联系(古尔德，1997;Jacobs等人，1999年;Voncken等人，1999年;Breiling等人，2001年;Saurin等人，2001年).

染色质状态维持的研究，如与着丝粒相关的酵母染色质状态，对表观遗传机制有了更清晰的见解(Karpen和Allshire，1997年)，端粒(Gottschling等人，1990年)配对式消声(格伦斯坦，1998年)或合成基因表达状态果蝇属(卡瓦利和帕罗1998,1999;和本，1998年). 这些研究支持了组蛋白尾部是表观遗传密码的模板这一命题，表观遗传代码是在翻译后修饰中写成的，包括磷酸化、乙酰化和甲基化(特纳，2000;Jenuwein和Allis，2001年). 在这些修饰中，组蛋白尾部上磷酰和乙酰加合物的高周转使可遗传染色质状态的简单模型复杂化。相比之下，组蛋白尾部的甲基似乎更稳定（有关讨论，请参阅范霍尔德，1988). 因此，组蛋白尾部甲基化模式可能是表观遗传状态的主要遗传归属，随后限制和/或指导其他修饰(Rea等人，2000年； Bannister等人，2001年;Lachner等人，2001年;Nakayama等人，2001年).

为了评估这一建议的优点，组蛋白甲基转移酶的特异性以及随后对组蛋白尾部修饰的模式和层次的影响需要被揭示。为此，我们确定Set1C为第一个H3赖氨酸4甲基转移酶活性增加了几个方面。

SUV39/Clr4对H3赖氨酸9的特异性(Rea等人，2000年)H3赖氨酸9和27的Ash1/G9a(Tachibana等人，2001年; C.Beisel、A.Imhof和F.Sauer，在制备中），我们添加了对H3赖氨酸4的特异性。H3赖氨酸4的甲基化似乎在真核生物中广泛存在(Strahl等人，1999年). 因此，我们预计相应的甲基转移酶可能广泛保守，因此我们筛选了数据库中的Set1同源性。我们在S.pombe公司,线虫经过详细筛选果蝇属基因组（图三A） ●●●●。这些预测的Set1蛋白具有类似的结构。它们包含三个明显同源的区域（图三A） ；（i） 与被称为RRM基序的RNA结合区域同源的中心区域（这可能表明RNA结合的作用，但RRM基模也介导蛋白质-蛋白质相互作用）；（ii）一个与SET结构域直接相连的N末端区域，该区域是独特的，称为N-SET区域；（iii）一个非常相似的SET结构区，其后是最常见的SET域肽加合物、后SET和终止密码子。因此，我们推测Set1同源序列在真核生物中广泛分布，并将在其各自的复合物中成为H3赖氨酸4甲基转移酶。

Set1C将Set1与Bre2关联。对于大多数Set1C蛋白，在营养生长单倍体酵母中，所有细胞Set1和Bre2似乎都结合在Set1C中。Bre2与Ash2的序列同源性超出了它们共享的SPRY域（图三C） ●●●●。然而，Bre2不包括PHD指，这是Ash2同源物的保守特征。有趣的是，Set1C包含PHD指蛋白Spp1。根据这些观察结果，我们预测高等真核生物中的Ash2复合物将包括一个Set1同源物并介导H3赖氨酸4甲基转移酶活性。

因此，新出现的间接证据表明，组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性是trxG3（Trx，Ash1，Ash2）作用的常见机制特征。Trx缺乏甲基转移酶活性在体外使用重组表达蛋白和缺乏富含半胱氨酸的preSET区域，人们对其作为甲基转移酶的能力产生了怀疑(Rea等人，2000年; C.Beisel、A.Imhof和F.Sauer，编制中）。然而，我们发现缺乏富含Cys的preSET区域的Set1在其天然复合物的背景下发挥组蛋白赖氨酸甲基转移酶的功能。由于Set1的SET域与Trx的SET结构域非常相似，并且Trx SET域包括目前已知对酶活性很重要的所有残基，包括必需谷氨酰胺/组氨酸核心旁边的精氨酸(Rea等人，2000年; 图三A） ，我们认为Trx可能在其天然络合物的背景下充当甲基转移酶。最近研究表明，重组表达的Ash1是H3赖氨酸9和27的一种甲基转移酶（C.Beisel、a.Imhof和F.Sauer正在制备中），这里我们将Ash2与Set1C H3赖胺酸4甲基转移酶活性联系起来。因此trxG3成员之间先前的遗传连锁(谢恩，1989年)可能反映了基于其蛋白质复合物的组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的共同机制联系。

除了通过点突变证明SUV39 SET结构域的保守核心是H3赖氨酸9甲基转移酶活性的关键之外，雷亚尔等. (2000)也表明富Cys-preSET区域也是必需的。在这里，我们通过将SUV39和G9a系列的富含Cys区域与E（Z）和Ash1系列的富Cys区域分离，来细化preSET区域的分类，以定义preSET-s（SUV3-9类）和preSET-E[E（Z）类]区域（图三B） 并在Set1同源物中观察到一个新的preSET区域，称为n-SET（图三A） ●●●●。与之前在Trx家族中观察到的ATA2 preSET区域一起(普拉萨德等., 1997)现在很明显，SET域的N端两侧至少有四个preSET域。

许多SET结构域在其C末端也与两个短的SET后肽延伸之一相关。最常见的是，这种C末端延伸包括三个半胱氨酸，紧接着是一个终止密码子，Ash1亚类除外。E（Z）同源物中的SET结构域不包括这三种半胱氨酸，但确实包括其他保守残基和一个终止密码子（postSET-Z）。因此，SET结构域蛋白可以根据（i）preSET区的类型（到目前为止，四种类型中的一种；preSET-s、preSET-e、n-SET、ATA2），（ii）后SET或后SET-z C末端延伸的存在，以及（iii）紧接在后SET延伸之后的终止密码子的存在或不存在，通过组合规则进行分类。

有趣的是，根据这个组合规则对SET域进行分类，产生的分组与根据SET域本身的同源性进行分类相同。图7显示了仅基于SET域（不包括侧翼区域）序列比对的SET域树。该分析表明，SET域分为四个主要分支；SUV39、Ash1、Set1/Trx和E（Z）组。在图的右侧7，描述了每个分支的N端和C端相关区域和终止密码子的分布。两种分类SET域的方法之间存在明显的对应关系。图中装箱的SET蛋白7描述目前显示与组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性相关的那些。可以看出，在三个不同的分支中发现了酶活性。此外，虽然还没有发现E（Z）成员与组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性相关，但E（Z集合1酵母端粒沉默缺陷（Laible等., 1998). 这些分析表明，具有酶活性的组蛋白赖氨酸甲基转移酶可能在SET结构域蛋白质中广泛存在，可能包括图中列出的所有蛋白质7当以适当的方式进行测试时，将具有活动性。对于一些人来说，这可能需要使用天然复合物进行活性测试。

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图7。用两种不同的标准对SET域进行分类会产生相同的分组。在左侧，显示了基于SET域多序列比对的SET域的非根树，其中不包含preSET和postSET区域。有四大类明显[SUV39、ASH1、SET1/TRX、E（Z）]。右侧描述了侧翼层序元素的分布。已知的甲基转移酶存在于四个主要分支中的三个分支中，是盒装的。

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