不可逆扩散用抗癌药物治疗的肿瘤细胞的阻滞可能是由于细胞死亡或永久性生长停滞。损伤诱导机制细胞死亡是一个积极调查的主题，但鲜为人知关于肿瘤细胞终末生长停滞的决定因素。我们先前已经表明，不同的肿瘤细胞系暴露于各种抗癌药物在体外和体内利用细胞表型特征诱导长期生长停滞衰老，如细胞增大、粘附增加和粒度与衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-加仑）(1). 肿瘤细胞也可以被诱导衰老通过异位表达抑癌基因或抑制癌基因。例如，抑制乳头瘤病毒癌蛋白E6和E7发现宫颈癌细胞株可诱导衰老样细胞几乎100%的细胞生长停滞(2). 激活因此，肿瘤细胞的衰老程序似乎是可行的癌症治疗的生物学方法。
在正常细胞中，端粒可能导致衰老多次细胞分裂后缩短(三)（复制性衰老）或可能由DNA损伤触发(4,5)或RAS突变(6)（加速衰老）。正常衰老细胞的生长停滞是通过激活p53介导，阻止细胞周期主要通过归纳第21页Waf1/Cip1/Sdi1，一种多效性抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）。衰老细胞中p21的诱导瞬态，然后稳定激活另一个CDK抑制剂，p16墨水4A.p16被认为是负责维持衰老细胞的生长停滞p21关闭后(5,7). 然而，p53–p21–p16级联，可能不足以解释肿瘤加速衰老细胞。p53和p16（但不是p21）是最常见的两种人类癌症中的失活基因。然而，p16缺陷型肿瘤细胞系容易发生衰老样生长停滞，以应对DNA损伤(1). p53或p21的抑制或敲除减弱，但不能消除用不同的代理人(8). 这些发现表明p53和p21是积极的调节因素，但不是治疗诱导的唯一决定因素肿瘤细胞衰老。在本研究中，我们确定了与生长停滞和其他方面相关的基因治疗诱导肿瘤细胞衰老并确定p53和p21在衰老相关基因调控中的作用。
材料和方法
细胞分析。
HCT116野生型、p21−/−（克隆80S4）和p53−/–（克隆379.2）细胞系（约翰·霍普金斯大学B.Vogelstein的礼物，巴尔的摩）在含有10%FC2血清的DMEM中生长。对于荧光激活细胞分选仪（FACS）分析细胞分裂，HCT116细胞用PKH2标记并在5×106每15厘米板上的细胞数。24小时后用200 nM阿霉素孵育，细胞在无毒品媒体长达10天。PKH2标记、FACS分析和按说明进行细胞分类(1,8). 的排序分数PKH2型你好和PKH2洛细胞使用丙啶分析DNA含量（纯度90-95%）碘染色和FACS分析(9)，SA-β-gal活性染色如Dimri所述等。(10)，并测试了通过每10-cm平板上2000–10000个分选细胞的平板培养获得克隆形成性。
基因表达分析。
Poly（A）+RNA和蛋白质提取物由PKH2系列洛和PKH2你好细胞种群，并在不同的实验中分离6、9或10天阿霉素释放后。荧光cDNA探针的合成，与人类UniGEM V 2.0 cDNA微阵列杂交，以及IncyteGenomics（圣路易斯）进行了信号分析由制造商网站描述(网址：www.incyte.com). 的>9000个序列验证基因和表达序列标签存在于UniGEM V 2.0微阵列中，82%给出了可测量的杂交信号使用两个探针。基因表达的变化通过半定量逆转录（RT）-PCR，本质上是描述(11)以β-actin为内标。RT-PCR引物序列和PCR条件将在请求。RT-PCR分析使用两对分离的增殖和衰老细胞RNA制剂独立实验，结果相同。对于基因，用相同的一对RNA样本复制分析。免疫印迹分析至少进行两次（相同结果），使用以下主要抗体：小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（Sigma），p53和p21（致癌基因研究，圣地亚哥），马斯平（PharMinen）、角蛋白18（NeoMarkers，加利福尼亚州弗里蒙特）、细胞周期蛋白D1（SantaCruz Biotechnology）和兔抗ATF-3多克隆抗体（SantaCruz Biotechnology）、Mad-2（加州里士满Babco）和EPLIN(e（电子）顶日的第页蛋白质我成本我n个n个人浆；加州大学洛杉矶分校D.Chang的礼物洛杉矶）。用辣根过氧化物酶标记法检测条带次级抗体和增强化学发光检测试剂盒（Amersham法玛西亚）。
结果和讨论
增殖与衰老的分离与表征存活于阿霉素的HCT116癌细胞群治疗。
我们分析了化疗诱导的人类加速衰老HCT116结肠癌细胞系，是p53的野生型，但确实存在不表达p16(12). HCT116细胞用200nM阿霉素。这种广泛使用的抗癌药物通过以下方式造成DNA损伤稳定拓扑异构酶II形成的可切割中间复合物在DNA分离过程中。治疗前，对细胞进行标记带有亲脂荧光团PKH2，其稳定地并入质膜在子细胞之间均匀分布，导致PKH2荧光在随后的细胞分裂(13). PKH2荧光的变化由多柔比星治疗后不同天的FACS。死亡的细胞根据药物治疗后用不透膜染料碘化丙啶（PI）染色。几乎所有PI-阴性细胞仍保持生长抑制（PKH2你好)之后的前2-3天阿霉素治疗，但细胞增殖（PKH2洛)从第4天开始出现（图。A类). 很大一部分然而，细胞仍然是PKH2你好但没有荧光减弱，表明这些细胞没有分裂甚至在药物释放后一次。六到十天后阿霉素处理后，存活细胞通过FACS分离成PKH2系列你好和PKH2洛分数。DNA含量分析表明PKH2系列你好细胞留在G中2（图。B)，大多数细胞所处的阶段最初被阿霉素通过其对拓扑异构酶的影响而阻止二、。如图所示。C，峰值2你好细胞大大增大，SA-β-gal染色阳性，表明他们的衰老表型。相反，PKH2洛细胞保持正常大小，SA-β-gal阴性形成殖民地的能力基本上局限于PKH2系列洛分数（图。D类)，表示衰老的PKH2你好细胞已经失去了增殖能力。
增殖组分和生长抑制组分的分离和分析阿霉素处理的HCT116细胞。(A类)FACS配置文件HCT116细胞的PKH2荧光阿霉素释放。PKH2系列洛人口增殖细胞在第4天出现并从PKH2系列你好（增长受阻）第6天的人口。(B)指数DNA含量的FACS分析生长中的HCT116细胞（绿色）和PKH2你好人口药物治疗9天后分离（红色）。(C)PKH2的SA-β-gal染色你好(赖特)和PKH2系列洛(左侧)种群，间隔6天在药物释放后。两者都有左侧和赖特在×200拍摄。(D类)PKH2菌落形成你好和PKH2洛药物治疗后9天分离的人群，10000人接受治疗每10厘米平板上的活细胞（碘化丙啶阴性）。
药物诱导的相关基因表达变化分析衰老：抑制与细胞增殖有关的基因。
从衰老的RNA中制备荧光cDNA探针（峰值2你好)和增殖（PKH2洛)细胞群和用于用UniGEM V 2.0人类cDNA微阵列进行差异杂交，包含9000多个基因。由该基因识别的基因列表杂交作为衰老过程中的下调或上调相对于增殖细胞（具有平衡的差异表达2.0或更高版本），见已发布的表1和表2作为PNAS网站上的支持信息，网址：www.pnas.org.逆转录聚合酶链反应分析（图。A类)被携带找出74个单独的基因并确认基因发生了质的变化表达26/29个下调基因和37/45个上调基因。在大多数情况下，RT-PCR显示的基因表达差异是远高于cDNA微阵列杂交所指示的值。7个基因的表达变化也在免疫印迹法测定蛋白质水平（图。A类).
RT-PCR分析衰老相关基因。β-actin被用作标准化标准。(A类)增殖中的基因表达（峰值2洛)和衰老（PKH2你好)人口HCT116细胞，阿霉素治疗9天后分离。(B)未分类群体中的基因表达野生型、p21−/−和p53−/–HCT116细胞前后使用200 nM阿霉素进行24小时治疗，并在指定日期进行在药物释放后。基因被指定为p53或如果在a或在p53−/−或p21−/–线中不太明显与野生型细胞相比。
p53和指示蛋白变化的免疫印迹分析药物诱导表达改变的基因产物衰老。β-actin作为归一化标准。(A类)野生型HCT116细胞的免疫印迹未经治疗、用200 nM阿霉素治疗2天或分类转化为增殖（PKH2洛)和衰老（PKH2你好)阿霉素治疗后9天的细胞群治疗。(B)p21诱导的p53依赖性阿霉素处理的HCT116细胞。免疫印迹分析野生型、p21−/−和p53−/–HCT116细胞系经阿霉素治疗指定天数。
68个基因和表达序列标签的一半以上已知衰老细胞中的下调在细胞中起作用循环进展。在这些基因中，有25个参与了不同的阶段有丝分裂或DNA分离（例如CDC2、Ki-67、MAD2和拓扑异构酶IIα），11个基因在DNA复制和染色质组装（例如核糖核苷酸还原酶M1、胸苷酸激酶和复制蛋白A3），4个基因参与DNA修理（例如。，六角螺母1和芬1). 下调参与细胞增殖的基因与衰老细胞的生长抑制状态，并显示我们系统中基因表达谱的生物学相关性。
多种生长抑制基因的诱导及明显逆转衰老细胞中的肿瘤转化。
衰老的HCT116细胞被发现上调了多个基因记录生长抑制活动，提供充分的解释用于维持阿霉素诱导的细胞周期阻滞p16缺失。上调的基因之一是p21（图。A类). p21和p53蛋白的诱导分析野生型阿霉素，p53−/−(14)和p21−/−(15)HCT116型细胞株表明p21在该系统中诱导作用强烈取决于p53（图。B). p53和p21蛋白都是9天后分离的衰老细胞保持在较高水平药物释放（图。A类). 与p21相比，然而，p53仅在蛋白水平上调。除了持续的p21诱导，衰老细胞强烈过度表达许多其他生长抑制剂，包括几种已知或推测的肿瘤抑制基因。其中一些基因编码细胞内生长抑制蛋白，包括肿瘤抑制因子英国电信1号及其同系物基站2，假定的肿瘤抑制因子埃普林和WIP1磷酸酶。衰老HCT116细胞过度表达几种分泌生长抑制剂，包括MIC-1（pTGF-β）、胰岛素样生长因子结合蛋白-6（IGFBP-6）、，丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin（一种在晚期乳腺癌）和角蛋白（表皮生长抑制几种肿瘤增殖的因子相关因子细胞系同时促进正常上皮细胞的生长）。这些发现表明药物诱导肿瘤细胞生长停滞由一组明显多余的细胞内和旁分泌因子。
衰老和增殖的基因表达差异经药物治疗的HCT116细胞的数量也存在差异在正常上皮细胞和癌上皮细胞之间。除了上述肿瘤抑制因子，衰老HCT116细胞诱导与正常基因相比，其他基因在癌症中表达下调上皮细胞(话筒-1，P-钙粘蛋白，去氨普拉金，结蛋白激酶和神经蛋白）。另一方面，衰老细胞不仅下调参与细胞增殖的多个基因还有一些其他具有致癌活性的基因(RHAMM公司和TLS/FUS系统)或显示肿瘤特异性表达式(蒸汽蒸汽发生器). 另一个推测的迹象衰老细胞的“正常化”是六种角蛋白基因家族的成员。这其中最强烈的感应组中观察到角蛋白8和18，一对角蛋白与抗凋亡活性(16). 衰老HCT116细胞无细胞凋亡的证据，尽管它们上调了2促凋亡基因，APO-1/Fas和NOXA公司.
旁分泌促生长基因的诱导组织重组活动。
除了生长抑制剂外，衰老的HCT116细胞显示增加分泌型促有丝分裂、抗凋亡和血管生成因子，如细胞外基质（ECM）蛋白Cyr61和转化生长因子（TGF）-α。诱导这些基因和相应的旁分泌活动肿瘤细胞生长在体外和体内，已经与复制性衰老相关(三)在正常细胞和p21中肿瘤细胞的诱导(17). 衰老细胞也上调了一些蛋白酶（激肽释放酶-7、钙蛋白酶L2、神经肽和尿激酶型纤溶酶原激活物）可能有助于转移增长。衰老细胞中诱导的其他几个基因参与细胞粘附和细胞-细胞接触（例如P-cadherin、Mac2-binding蛋白质和结蛋白）。其他诱导基因编码ECM受体，包括几种整合素和syndecan-4（ryudocan），参与血管生成。其他一些跨膜蛋白在衰老中的诱导作用细胞是生长调节蛋白CD44和Jagged-1，阿尔茨海默病β-淀粉样前体蛋白（βAPP）和另一种淀粉样前物，BRI与阿尔茨海默病样疾病相关。总之，是秘密的因子、ECM蛋白、ECM受体和其他完整膜蛋白质构成68个已知功能的基因中的33个在衰老的HCT116细胞中（相比之下，64个细胞中只有2个表达下调具有已知功能的基因属于这一类）。
与复制衰老和生物老化并行。
HCT116药物诱导衰老的基因表达模式细胞与正常细胞的衰老有许多相似之处。一些衰老细胞的一般特性（末端除外生长停滞）、抗凋亡、增加细胞与ECM部件过度生产相关的粘附，以及蛋白酶、蛋白酶抑制剂和有丝分裂因子的分泌(三).参与所有这些现象的基因在那些在衰老肿瘤细胞中上调的。与…对比然而，正常细胞衰老的HCT116细胞不会上调p16或肿瘤抑制剂PML公司与RAS诱导的加速衰老(18). 与药物诱导的衰老也与机体衰老相似。一些衰老HCT116结肠中诱导的蛋白质癌细胞，如βAPP和前体皂苷，具有年龄依赖性表达式。值得注意的是，Maspin、CD44和Cyclin D1被报道为衰老动物结肠上皮特异性上调(19). 此外，衰老HCT116细胞中有8个基因下调在活跃生长的成纤维细胞中也表现出表达减少老年人的文化与年轻人的类似文化人，而两个诱导基因(话筒-1和结蛋白）在来自老年人的培养物中上调(20). 看起来，因此，药物诱导肿瘤细胞衰老的过程与复制性衰老和机体衰老有关。
衰老细胞中转录因子表达的改变。
几种已知或推测转录因子和辅因子的基因在衰老的HCT116细胞中显示出改变的调节。其中一个下调转录因子是翼螺旋蛋白HFH-11（Trident），一种DNA复制的积极调节器，特别是在循环细胞中表达(21). 几种上调转录因子与AP-1家族有关，AP-1家族介导细胞对各种有丝分裂信号、干扰素和应力形式(22). 其中包括c-Jun和其他两种碱性亮氨酸拉链蛋白XBP-1（与c-Jun结构相关）和ATF3与c-Jun二聚体。ATF3 mRNA和蛋白持续上调在衰老细胞中是令人惊讶的，因为这种诱导压力反应因子通常是短暂的（超过数小时），因为ATF3抑制自身转录的能力(23). 另一个诱导转录因子是ELF-1，是Ets家族的成员已知在功能上相互作用的螺旋-环-螺旋蛋白，可能是物理上的，AP-1(22).
衰老相关的基因表达变化与p53和p21的影响。
在衰老的HCT116中表现出表达改变的许多基因p53过度表达后，细胞表现出类似的变化（9下调和11个上调基因）或p21（46个下调和7个上调基因）（见表1和表2）。p53起直接作用许多基因（包括p21）的转录激活物和间接调节一组在其基因中没有p53结合位点的基因发起人(24,25). 一类重要的p53诱导基因编码分泌生长抑制因子，提供旁分泌抗增殖活性(24). 与p53相反，p21不是转录调控因子本身，但它与转录因子、辅因子和介体的广泛网络信号转导(26). 纤维肉瘤细胞中p21的过度表达导致多个细胞增殖基因下调许多ECM成分的上调和分泌的促有丝分裂和抗凋亡因子，提供相应的活性p21诱导细胞的条件培养基(17). 已知的机制p21的转录激活基于其刺激p300/CBP转录辅因子(27). 然而，HCT116细胞表达p300的一种显性突变形式(28)，这可以解释为什么衰老的HCT116细胞上调相对较少数量的p21诱导基因。
p53和p21基因敲除对药物引起的细胞内变化的影响衰老相关基因的表达。
阐明p53和p21在观察到的基因变化中的作用表达，我们分析了衰老相关的表达野生型、p21−/−和阿霉素治疗后的基因p53−/−HCT116细胞。添加前分离RNA样本阿霉素治疗1天后立即服用药物取出后连续3天。33的表达衰老中上调的基因和下调的11个基因通过RT-PCR分析细胞（图。B). 这个分析表明所有测试的基因都在未经处理的野生型细胞的水平与增殖中的细胞相似阿霉素处理细胞的分数。衰老相关变化大多数这些基因的表达在总的阿霉素治疗1天后野生型HCT116细胞的数量或药物释放后1天。这种早期的反应可能评估p21和p53敲除对总蛋白的影响阿霉素处理的细胞群体，而无需纯化p21−/−和p53−/–细胞系的小衰老部分。
大约三分之一的基因在衰老细胞在野生型、p21−/−和p53−/–细胞系，表明这些基因的诱导并不涉及p53或p21（图。B). 这些基因包括肿瘤抑制基因英国电信1号和分泌生长抑制剂IGFBP-6。令人惊讶的是，其中一个不依赖p53的基因是NOXA公司,尽管已知p53可以诱导。剩下的三分之二中的上调基因在p53−/−细胞。后一种基因中约有一半不受p21淘汰赛。这一组包括AP-1的转录因子家族、CYR61和几个细胞内（BTG2和WIP1）生长抑制剂（Maspin、MIC-1和两性调节蛋白）。这些都不是然而，基因的诱导完全依赖于p53它们中的一种在p53−/−细胞中被诱导，2天后从毒品。几乎所有与衰老相关的生长抑制剂（除了p21和EPLIN）最终在p53−/−细胞中诱导至一定水平与野生型细胞系相比（图。B).这些结果为减少但仍然存在的p53−/−中衰老样生长停滞的实质性诱导阿霉素治疗后的细胞(8).
最后一组诱导基因在p21−/−比野生型细胞（图。B)，表明这些基因的调控是通过p21介导的。因为阿霉素处理的HCT116细胞中p21的诱导是p53依赖性，这些基因在p53−/−中的诱导作用也减弱细胞。测试基因中p21依赖性最强的是细胞周期蛋白D1。p21依赖基因均不产生分泌性生长抑制剂，但其中两个编码分泌促有丝分裂/抗凋亡蛋白（原aposin和TGF-α）。在衰老的HCT116细胞中下调的大多数基因是已知被p21抑制(17). 根据这一观察结果，这些基因仅在阿霉素治疗后表达下降在野生型中，但在p21−/−或p53−/–细胞系中没有（图。B). 与显示p21依赖性的基因一起诱导，受p53敲除影响的31个测试基因中的20个（不包括p21）也受到相同或更大程度的第21页被淘汰。因此，p21直到最近才为人所知在基因表达调控中起作用，似乎是p53相应效应的介体。
癌症治疗的意义。
衰老样生长停滞的诱导被证明是对不同抗癌药物的反应在体外和中动物模型，但尚未有研究调查肿瘤加速衰老。尽管如此，还是有临床证据表明，在某些情况下，细胞停滞时间延长可能是肿瘤对放射治疗的主要反应模式。特别地，据报道，前列腺癌完全消退所需时间超过部分患者1年(29)硬纤维瘤消退至2年(30)辐射处理后。这种缓慢的肿瘤过程消失似乎与辐射引起的衰老最为一致。
检测临床癌症的衰老反应需要衰老细胞的诊断标志物。最常见的衰老标记SA-β-gal有两个明显的缺点：它表示仅在冷冻样品中保存的酶活性时间有限，与生长停滞无机械关系衰老细胞。我们现在已经确定了一些上调功能上与生长停滞相关的基因，如p21，EPLIN公司,英国电信1号,基站2,WIP1,马斯平，话筒-1IGFBP-6和两性调节蛋白。的产品这些基因在衰老肿瘤细胞中的表达水平要高得多水平高于未经处理的细胞或药物处理的增殖细胞（图。A类和A类)这些蛋白质可能因此提供敏感的诊断标记。这些的归纳衰老相关生长抑制剂不限于本研究分析了阿霉素处理的HCT116细胞。对于例如，EPLIN，一种生长抑制蛋白，在21个癌细胞系中的20个与正常上皮组织相关(31)通过治疗在MCF-7乳腺癌细胞中强烈诱导在产生类似衰老的条件下，使用维甲酸生长停滞(32). 维甲酸治疗也能诱导分泌生长抑制剂IGFBP-6(33). 大多数其他基因都有被证明是由其他多种DNA损伤引起的肿瘤衍生细胞系。这些包括英国电信1号(34)，基站2(35)，WIP1（在制品1）(36)、Maspin(37)、和微计算机-1(24). 进一步分析应表明衰老相关生长抑制剂作为治疗标志物人类癌症的反应。
解释与治疗诱导的相关分子变化衰老也有潜在的治疗意义。永久地加速诱导抑制肿瘤细胞生长衰老似乎是一种有吸引力的治疗方法，因为即使在以下条件下，也可以引发对药物治疗的反应最小细胞毒性(1). 我们发现药物诱导的衰老与多种抗增殖基因的协同诱导相关（其中一些还抑制邻近细胞的生长）表明激活这些基因的共同调控途径的存在。重要的是，大多数生长抑制基因也由阿霉素治疗p53缺陷细胞。可以是用于刺激衰老相关的诱导因此，生长抑制基因可能对有或无功能性p53的肿瘤。
然而，药物诱导衰老的正面是诱导与病理状况（如阿尔茨海默病）相关的基因疾病），以及蛋白酶和有丝分裂、抗凋亡，和血管生成分泌因子。通过衰老表达这些基因细胞在短期内可能有潜在的不利影响（生长刺激非基因肿瘤细胞）和长期（增加了从头开始致癌和与年龄相关的疾病）。细胞衰老与致癌作用体内最近的一项研究表明帕拉迪斯等。(38)发现SA-β-gal的表达在正常人中，肝脏与肝细胞癌。我们已经证明p21诱导上调许多疾病相关基因并诱导旁分泌抗凋亡和有丝分裂活性(17). 目前研究发现，p21基因敲除可减少或延迟prosaposin、TGF-α和Alzheimer'sβAPP等基因。这些观察表明p21刺激的调节途径可能是主要负责疾病相关基因的表达衰老细胞。
然而，致病基因的诱导并不是一成不变的衰老表型。特别是，cDNA微阵列分析MCF-7细胞经全反式视黄酸（RA）衰老诱导条件揭示了几种生长抑制基因，但不是已知有丝分裂基因，抗凋亡或致病功能(32). 值得注意的是，RA处理的MCF-7细胞（与DNA损伤处理的细胞相比agents）未显示p21表达增加。这些发现表明有可能诱导衰老相关的生长抑制剂没有同时诱导促肿瘤和疾病相关因素。在目前的研究中，我们已经确定了特定的基因与药物诱导的有益和有害方面相关肿瘤细胞的衰老，并获得了进一步证据证明p21在衰老的消极方面。这些发现表明开发促进终端的代理的潜在策略肿瘤细胞生长停滞或衰老相关侧减少癌症治疗的效果。
