分子细胞生物学。2005年7月；25(14): 6225–6234.
Myc刺激核编码线粒体基因和线粒体生物发生†
,1,* ,1 ,1 ,2 ,1,‡ ,三 ,4 ,5 ,2和1,三，4,6,*
冯丽
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
王云月
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
凯伦·泽勒
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
詹姆斯·波特
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院儿科5
黛安·罗·旺西（Diane R.Wonsey）
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
凯瑟琳·奥唐纳
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
金正汉
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
杰森·尤斯坦
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琳达·A·李
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池V.Dang
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
血液科，1胃肠病学，医学部，2细胞生物学系，6人类遗传学和分子生物学研究生课程，三病理生物学，4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科5
‡现住址：马萨诸塞州剑桥市剑桥公园大道200号，邮编02140。
2005年1月12日收到；2005年2月22日修订；2005年4月11日接受。
MYC公司编码转录因子c-Myc（以下称为Myc），在细胞大小、细胞增殖和凋亡的调节中起着核心作用(6,11,28,40,41)通过调节RNA聚合酶I、II和III依赖基因(2,17,18,39). 放松管制的表达MYC公司导致美国每年至少10万人死于癌症，但在发现其原癌基因20年后，其所有调节功能仍不完全清楚(8,34). Myc与Max二聚并结合E盒（5′-CACGTG-3′）激活转录(16). Myc还通过干扰其他转录激活物的功能来抑制转录，如Miz-1、NF-Y或Sp1(23,45). Myc调节几个主要的细胞功能，如细胞增殖、细胞粘附和细胞大小，这解释了在各种代谢途径中发现的Myc靶基因的多样性，包括氨基酸、核苷酸、脂质和葡萄糖代谢(www.myccancergene.org) (48). 虽然Myc通过调节糖酵解与能量代谢有关(26)，其在线粒体生物发生中的作用尚不清楚。值得注意的是，线粒体是许多重要生化途径所必需的，包括血红素合成、脂肪酸氧化、氨基酸和类固醇代谢等。因此，在驱动细胞复制的过程中，Myc也可以直接或间接影响线粒体的生成，从而在细胞穿越细胞周期时保持稳定的呼吸和代谢能力(1).
大鼠或人类系统中的大规模基因表达分析表明，Myc的过度表达可诱导核编码线粒体基因(7,20,31,37,38,46). 与Myc结合的基因果蝇属、大鼠或人类系统包括编码线粒体蛋白质或参与线粒体生物发生的系统(15,31,33,36,38,47). 总之，这些研究表明Myc可能影响线粒体蛋白的表达。在这里，我们试图确定Myc对诱导型Myc依赖的人类B细胞细胞增殖模型中线粒体生物发生的影响，该模型是一个定义明确的Rat1成纤维细胞系统Myc公司通过同源重组为null，以及一个条件模型Myc公司小鼠原代肝细胞敲除(10,30,44). 我们不仅观察到线粒体生物发生依赖于Myc，而且我们还发现，在人类B细胞系统中最高度诱导的Myc靶基因中，有那些参与线粒体生物发生的基因。此外，我们发现Myc直接调节TFAM公司，编码参与线粒体转录和线粒体DNA（mtDNA）复制的关键因子。这些观察支持Myc在调节线粒体生物发生中的关键作用。
材料和方法
细胞培养。
如前所述，细胞生长。P493-6细胞是表达EBNA2-雌激素受体融合蛋白并含有四环素（Tet）可抑制的人类B淋巴细胞MYC公司构造(44). TGR1（myc+/+)，HO15（myc−/−)和HO15-Myc（Myc−/−+Myc；Myc在HO15中重组）为大鼠成纤维细胞(30). 如前所述，培养人原代2091成纤维细胞（美国型培养物收集），使其血清饥饿，并刺激血清(47).
原代肝细胞制备和腺病毒感染。
制备原代鼠肝细胞，并在胶原包被的35mm平板上培养，如大鼠肝细胞所述(32). 电镀3×10后一天5每个板上的细胞数，来自漂浮物的肝细胞Myc公司分别用表达Cre重组酶的腺病毒（约翰·霍普金斯大学F.Bunz和B.Vogelstein的礼物）和绿色荧光蛋白（GFP）或单独使用GFP（约翰·霍普金斯大学D.Johns的礼物）治疗小鼠，剂量约为5×108每个板的PFU(10,42).
微阵列基因表达分析。
在1μM雌二醇和0.1μg/ml四环素（内源性MYC公司)或0.1μg/ml四环素（低MYC公司)或在两者都不存在的情况下（高度异位MYC公司)72小时，用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）收集RNA。Affymetrix U133 Plus 2.0芯片上的杂交和数据分析在约翰霍普金斯医学研究所微阵列设施中进行。图像数据用统计程序Robust Multiarray Analysis进行处理，以获得基因表达信号(22)，并使用伽马伽马或对数正态模型，通过经验贝叶斯方法获得基因表达的统计显著变化(35).
PCR。
从四环素处理或未处理的P493-6细胞中分离的RNA首先用TaqMan逆转录试剂逆转录到cDNA（应用生物系统）。使用随机六聚体引物进行逆转录。使用Sybr Green PCR核心试剂（Applied Biosystems）进行实时PCR。补充材料中的表S1列出了目标基因引物对。预先开发的TaqMan分析试剂（Applied Biosystems）18S rRNA控制试剂盒用于实时PCR程序，以检测18S rRNA作为内部模板控制。用已知浓度的RNA转录的cDNA按10倍系列稀释，根据实时PCR获得的阈值周期生成标准曲线。根据标准曲线确定测试基因的cDNA数量，并将其归一化为18S rRNA的数量。
人和小鼠的表达TFAM/TFAM公司和鼠标Myc公司使用TaqMan一步逆转录-PCR主混合试剂（Applied Biosystems）测量总RNA。引物和探针序列如下：TFAM公司，5′-AAGGATTCCAAGAAGCTAAGGTGA（正向），5′-CAGAGTCAGACAGATTTCCAGTTT-3′（反向），和6-羧基荧光素（FAM）-5′-TTCACCGCAGGAGAGAGAGCGTAAAG-3′-6-羧基甲基罗丹明（TAMRA）（探针）；用于鼠标Tfam公司、5′-GATGGCGCTGTCCGG-3′（正向）、5′-TGGATAGCATACTGGA-3′（反向）和FAM-5′-TCCCCTCTCTATCAGTCGTCTGTATTC-3′-TAMRA（探针）；和鼠标Myc公司、5′-AGCCCTAGCTGCTGCATGA-3′（正向）、5′-TCCACAGACACACATATTTC-3′（反向）和FAM-5′-CAGCAGCGACTGAAGAGACGAGAGAGA-3′-TAMRA（探针）。老鼠Tfam公司用Sybr Green核试剂从cDNA中检测，引物为5′-AAAAA-TCTGTCTCATGAAAAGCAG-3′（正向）和3′-CTTCATCTCATAACGAATTCTAT-3′（反向）。
检测floxed的PCR条件Myc公司与缺失等位基因和引物序列相比，如前所述(9,10).
炸薯条。
如前所述进行染色质免疫沉淀（ChIP）(4). 简单地说，P493-6细胞在4×10的条件下生长5细胞/ml加或不加0.1μg/ml四环素72小时。如上所述，对人2091细胞进行血清饥饿和刺激。使用兔多克隆抗c-Myc sc-764X抗体（圣克鲁斯生物技术公司）进行ChIP。从genome.ucsc.edu下载人类基因组序列，利用OMIGA软件的核酸模体特征从外显子1上游3kb到下游7kb搜索E盒。PCR引物在补充材料的表S2中列出。使用Sybr Green PCR核心试剂（Applied Biosystems）进行实时PCR。如前所述进行绝对定量(47). ChIP产品中的DNA量被归一化为总输入染色质中的DNA数量。
免疫印迹法。
用单克隆抗体9E10检测c-Myc。用α-微管蛋白（Ab-1）单克隆小鼠免疫球蛋白G（癌基因）检测微管蛋白作为负荷对照。
流式细胞术分析。
细胞在37°C下与5%CO孵育2在10 nM（P493-6细胞）或100 nM（Rat1成纤维细胞）壬基吖啶橙（NAO）（分子探针）存在下保持30 min，并立即用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪进行过滤和分析。
共焦和免疫荧光显微镜。
将P493-6细胞与MitoTracker Red CMX Ros（M7512；分子探针）在250 nM或150 nM的条件下，在10%或0.25%胎牛血清中孵育15分钟。然后将细胞重新悬浮在新鲜的温热培养基中，并将细胞纺锤放在载玻片上。幻灯片被固定、冲洗和安装。使用UltraView（Perkin-Elmer）共焦显微镜采集图像，并使用IP实验室软件的信号强度分割功能进行强度测量。如前所述，用MitoTracker Red（100 nM）或NAO（10 mM）对原代肝细胞进行染色(14,19). 使用配备数码相机的倒置蔡司Axiover 200荧光显微镜对活细胞进行荧光显微镜检查。
线粒体DNA拷贝测量。
从全细胞裂解物中收集DNA。实时PCR检测细胞色素c氧化酶亚单位1（COX1）、过氧化物酶体增殖激活受体γ辅活化物相关1（PPRC1）和细胞因子样蛋白C17。有关底漆顺序，请参阅补充材料中的表S3。COX1 DNA绝对拷贝被归一化为核基因PPRC1或C17。
细胞总耗氧量的测量。
如上所述，用或不用四环素处理P493-6细胞，然后在5×105在BD氧生物传感器系统（BD Biosciences）的荧光染料嵌入96 well微孔板中。培养细胞4小时，然后用荧光微孔板阅读器（Wallac Victor三V 1420多标签计数器；Perkin Elmer）。数据根据制造商的两步标准化协议（技术公告第448号；BD Bioscience）进行标准化，并表示为标准化的相对荧光单位。
电子显微镜。
如前所述，在显微镜核心设备中进行电子显微镜检查(47)切片用飞利浦CM 120透射电镜观察。获得了每种细胞类型的10个单个细胞的显微照片。检查显微照片，并测定线粒体形态。
结果
Myc刺激线粒体生物生成。
尽管基因表达和ChIP分析表明Myc调节线粒体生物发生相关的基因，但Myc对线粒体生物发生的影响尚未直接确定。因此，我们试图确定Myc在P493-6人B细胞系中的表达如何影响线粒体质量和功能。Myc在无血清或有血清的四环素反应系统中强烈诱导（图。)，如前所述(43). 使用NAO的流式细胞术（其线粒体心磷脂染色可测量线粒体质量）显示，Myc诱导增加了线粒体质量，尽管在缺乏血清的情况下诱导作用减弱（图。). 此外，使用染色功能线粒体的Mitotracker Red定量荧光显微镜证实了NAO的发现（图。). 这些观察结果表明，在没有细胞增殖的情况下，Myc可以诱导线粒体功能质量的轻微增加。为了进一步证实这些发现，我们分别使用实时定量PCR和细胞耗氧量作为线粒体质量和功能的指标来测量线粒体DNA含量。在P493-6 B细胞中，线粒体DNA和细胞耗氧量都随着Myc的诱导而增加（图。). 这些观察结果支持Myc诱导线粒体生物发生的观点；然而，在P493-6系统中，Myc是否是线粒体生物发生所必需的尚不清楚。
c-Myc在高（10%；左侧面板）或低（0.25%；右侧面板）血清条件下增加线粒体质量和活性。将P493-6细胞在高或低血清中四环素存在（+tet，低Myc）或不存在（-tet，高Myc）的情况下培养72小时。按照材料和方法中的描述收集细胞。（A） 用免疫印迹法测定c-Myc水平。Tubulin用作加载控制。（B） NAO染色的荧光强度(x个轴）。这个年轴表示单元格编号。（C） MitoTracker红色染色细胞的典型共焦显微照片显示在上部面板中。下面的面板显示了MitoTracker红染色的信号强度分布，作为线粒体活性和含量的测量，使用IP实验室软件的信号分割。还显示了相对信号强度的中位数。共焦显微照片的曝光时间在高Myc和低Myc条件下保持不变，但在高血清和低血清条件下略有不同。
c-Myc诱导增加线粒体DNA拷贝和细胞耗氧量。P493-6细胞按照图的图例所述进行处理。在高血清条件下，然后按照材料和方法中的描述收集细胞。（A） 对线粒体基因COX1进行实时定量PCR，核基因PPRC1和C17作为内部对照。计算相对于四环素处理（+tet，低Myc）细胞中DNA水平的折叠变化。所示为三个独立实验的平均值±平均值的标准误差。（B） 细胞总耗氧量，显示为两个独立实验的平均值±标准偏差。NRFU，归一化相对荧光单位。
为了确定Myc是否是正常线粒体生物发生所必需的，我们随后研究了Myc的缺失是否会影响已呈现的Rat1成纤维细胞的线粒体含量和结构Myc公司同源重组为零。如上所述，流式细胞术研究表明Myc公司空细胞减少了线粒体的质量和功能（图。和). 事实上，两个NAO染色Myc公司观察到无细胞群体，对应于线粒体质量显著降低的较大组和线粒体质量接近正常的较小组。尽管Myc在Myc公司空细胞挽救了它们缓慢的生长（图。)线粒体质量部分恢复。我们用电子显微镜进一步检查了线粒体。与野生型成纤维细胞相比Myc公司含有大量溶酶体样细胞器和极少线粒体切片的空细胞群。一个亚群Myc公司空细胞显示线粒体部分减少。正常的线粒体切片在Myc公司通过异位Myc表达挽救了空的成纤维细胞，尽管存在正常线粒体切片减少的残余亚群（图。). 这些观察结果表明Myc公司是正常线粒体生物生成所必需的，因为Myc公司导致线粒体质量下降。
线粒体质量在Myc公司成纤维细胞无效。（A和B）对数生长myc+/+，我的−/−和myc−/−+Myc细胞用NAO染色。（A） 流式细胞术直方图显示线粒体质量对应的荧光强度+/+细胞在高荧光强度下有一个信号峰，而myc−/−和myc−/−+Myc细胞有两个峰值。（B） 三个小点图显示了为获得更高荧光强度而选择的细胞百分比。（C） myc的增长率+/+，我的−/−和myc−/−+Myc成纤维细胞。
大鼠成纤维细胞线粒体的超微结构分析。左边，成纤维细胞中发现的细胞类型的定量。共有10个单个细胞，每个细胞来自对数生长的myc+/+，我的−/−和myc−/−+Myc细胞被分类并显示为显示N、I或A形态的百分比。右，三大形态类别的电子显微照片：N、丰富、正常线粒体切片；I、 较少的正常线粒体切片；A、 线粒体切片急剧丢失，溶酶体样细胞器增多。下部面板是上部面板的较高放大倍数。
我们试图确定Myc公司富含线粒体的原代肝细胞可能影响线粒体质量Myc公司等位基因(10). 用表达Cre重组酶和GFP或仅表达GFP的腺病毒处理原代肝细胞。腺病毒治疗后2天和3天，用MitoTracker Red或NAO对肝细胞进行生命体表染色，并用荧光显微镜观察。如图所示。，GFP荧光确认腺病毒感染（顶部面板）。与对照组相比，Cre重组酶处理的细胞中的MitoTracker Red和NAO均显示染色减弱（图。). 从未经处理的肝细胞或腺病毒感染后2天从肝细胞采集的基因组DNA样本，分析缺失或未缺失的绒毛Myc公司等位基因（图。). 用只表达GFP的腺病毒治疗的对照组保留了未删除的Myc公司而用Cre重组酶病毒处理的肝细胞有明显的Myc公司只保留了未删除的一小部分Myc公司等位基因。综合我们对P493-6中Myc功能的获得和Myc公司在Rat1细胞和原代肝细胞中强烈支持Myc诱导线粒体生物发生的假说。
floxed急性缺失Myc公司在分离的小鼠肝细胞中，可稳定线粒体减少。（A）纯合子小鼠培养的原代肝细胞的荧光和相控显微照片Myc公司在对照（Cont）或Cre重组酶腺病毒感染之前（第0天）和之后2或3天。显示了第2天和第3天腺病毒感染肝细胞的GFP荧光显微照片（顶面板）。用MitoTracker红（显示第2天）或壬基吖啶橙（显示第3天）对相同的细胞进行染色。对于每种不同的荧光色素（GFP、NAO或MitoTracker Red），在相同的曝光时间下获得对照组或Cre重组酶处理细胞的荧光显微照片。（B） 埃塞俄比亚染色的琼脂糖凝胶显示在第0天来自未处理的肝细胞或在第2天来自对照或Cre重组酶处理的肝细胞的PCR扩增（35个循环）的基因组DNA。使用的PCR引物对未删除的（W）或删除的（D）floxed具有特异性Myc公司等位基因。W扩增子大小，500 bp；D放大器大小，700 bp。分子标记显示在最左边的车道上。UTR，未翻译区域。
Myc诱导参与线粒体生物发生的基因。
我们试图确定Myc在P493-6人B淋巴细胞系中的表达如何影响线粒体功能和生物发生相关基因。P493-6细胞具有两个独特的特征：它们包含EBV基因组，带有雌二醇诱导的EBNA2-雌激素受体荷尔蒙结合域（EBNA2-ER）融合蛋白和四环素可抑制人类MYC公司等位基因(43,44). EBNA2是EBV在人类B细胞中永生化所必需的关键EBV转录调控因子。P493-6细胞的表型取决于雌二醇和Tet的存在。在有Tet和无雌二醇的情况下，P493-6细胞的Myc表达和生长速度都很低。然而，当Tet存在时，添加雌二醇会导致P493-6细胞表达内源性MYC公司被EBNA2-ER激活，并增殖，类似EBV永生化人类淋巴母细胞系。异位MYC公司在缺乏雌二醇或四环素的情况下诱导，导致免疫功能低下小鼠（R.Dinavahi和C.V.Dang，未发表的观察结果）的P493-6细胞致瘤，类似于地方性Burkitt淋巴瘤。该模型为研究Myc异位或内源性表达诱导的基因类别提供了独特的机会。
在四个独立的生物学实验中使用寡核苷酸微阵列分析，在P493-6细胞中表达的约10000个基因中，我们发现2679个基因（4314个探针组）对异位Myc有反应。大约一半（1578）的基因被诱导，而另一半（1101）被抑制。在1578个被诱导的基因中，表达分析系统探索者（EAS）基因本体分析显示，在1141个能够被注释的上调基因中，198个与线粒体有关的基因在统计上过度表达（EAS得分，1.21E−45）（见补充材料中的表S4）(21). 在1101个下调基因中，有9个被注释为与线粒体功能相关。基因名称和折叠变化如下：ALDH2型, −2.47;ALDH6A1型, −2.35;十亿立方厘米2, −3.86;BNIP3L型, −2.26;BCL2L1型, −2.65;CPT1B型, −2.00;COX4I2型, −3.12;PSEN1公司, −1.93; 和UCP2号机组, −3.92. 上调基因根据其参与线粒体膜、线粒体基质、线粒体核糖体、羧酸代谢、生物合成、电子转运体活性、氧化磷酸化和线粒体DNA复制而分类。其中，HSP60、细胞色素c（c）(7,20)，铁黄素1，乙酰辅酶A乙酰转移酶1，异柠檬酸脱氢酶(37)、HSP10和禁止(31,37)据报道，这些基因是由c-Myc诱导的。细胞色素c（c）ChIP分析表明，HSP60、PHB、PRDX3和mSHMT与Myc结合(15,31,33,36,47). 为了验证我们的微阵列分析，我们选择了10个上调并参与线粒体DNA复制、氧化磷酸化、电子传递、羧酸代谢或ATP合成的基因，以通过实时PCR确定其表达（见补充材料中的表S5）。微阵列分析检测到的变化与实时PCR结果高度相关。
我们还研究了这些基因对内源性MYC公司通过EBNA2-ER激活，发现线粒体基因也被内源性激活MYC公司因为它们是异位的MYC公司事实上，88%（198个注释基因中的175个）的线粒体相关基因被异位激活MYC公司也由内源性MYC公司在P493-6系统中，线粒体相关基因在对内源性MYC公司根据EASE分析确定（数据未显示）。由于内源性和异位Myc都可以诱导许多线粒体相关基因，这一分析支持Myc在线粒体生物发生中的主要生理作用。虽然线粒体相关基因表达过多，但通过EAS分析，也可以发现由Myc诱导的其他基因组表达过度，包括参与新陈代谢、细胞周期调节和核糖体生物生成的基因(21).
Myc与TFAM结合。
观察到线粒体相关基因在Myc反应基因中过度表达，我们试图确定Myc是否直接结合和调节线粒体功能和生物发生相关基因。当前Myc靶基因数据库(www.myccancergene.org)约1700个条目，包含23个与线粒体功能有关的基因，这些基因由ChIP确定的Myc结合（表). 通过微阵列基因表达分析观察到，其中10种在P493-6细胞中上调（表). 此外，全球基因组绘图果蝇属发现dMyc与六个基因结合，从而促进线粒体的生物发生、结构和功能(38). 其中TFAM公司和时间10人类同源基因在P493-6系统中也被Myc上调，尽管尚未研究Myc对哺乳动物细胞中同源基因的调控。
表1。
| 基因功能 | 基因决定因素：
| 折叠感应b条 |
|---|
| 炸薯条一 | 微阵列 |
|---|
| 氧化还原酶活性 | NDUFA1型 | | |
| NDUFA2型 | | |
| NDUFB3型 | | |
| NDUFB5型 | | |
| NDUFS1型 | NDUFS1型 | 2.5 |
| NDUFS6系列 | NDUFS6系列 | 2.2 |
| NDUFV1型 | | |
| PRDX3型 | PRDX3型 | 2.1 |
| 离子传输 | UCP1（UCP1） | | |
| UCP3号机组 | | |
| DNA代谢 | 菲律宾比索 | 菲律宾比索 | 5 |
| TFAM公司* | TFAM公司 | 3 |
| 蛋白质代谢 | 热休克蛋白1 | 热休克蛋白1 | 5.3 |
| 热休克蛋白1 | 热休克蛋白1 | 5.3 |
| TIMM17A公司 | TIMM17A公司 | 3 |
| UQCRC2公司 | | |
| 氨基酸代谢 | SHMT2号机组 | SHMT2号机组 | 3.1 |
| 三羧酸循环 | ACBP公司 | | |
| 数据库接口 | | |
| 线粒体内膜 | 中国青年科学院 | 中国青年科学院 | 3.4 |
| FCI-12 | | |
| TIM10公司* | TIM10公司 | 2.7 |
| 其他 | 国家气象局1 | 国家气象局1 | 8.8 |
| MCFP公司 | | |
| HAX1型 | | |
Tfam是一种关键的核编码转录因子，可转位到线粒体并激活线粒体转录和线粒体DNA复制。在两个独立的P493-6细胞实验中，TFAM公司内源性和异位性诱导2.8倍和3.0倍MYC公司分别通过微阵列分析检测到。此外，我们观察到小鼠的双重诱导Tfam公司与通过尾静脉注射LacZ腺病毒治疗的肝脏相比（数据未显示），Myc腺病毒治疗肝脏中的（相对于18S rRNA），这是之前描述的小鼠模型(27). 值得注意的是，rRNAs也由Myc诱导，因此我们的价值观Tfam公司归纳法可能被低估了(2,17,18).
为了进一步验证Myc在线粒体生物发生调控中的作用，我们试图确定是否TFAM公司是P493-6系统中Myc的直接靶点。通过扫描染色质免疫沉淀分析和P493-6细胞，我们发现Myc与TFAM公司在扩增子C和D区域转录起始位点上游约900 bp处（图。). Amplicon C包含一个5′-CACGTT-3′序列，该序列可能与Myc结合(三). Amplicon D具有回文序列5′-CGCGC-3′，其中包含Myc/Max 5′-GCG-3′半位点(三)和与dMyc相关的富含GC的区域果蝇属单元格(38). 两个扩增子都不包含在启动子和内含子1区域发现的系统发育保守的E盒（图。). 我们的基因表达和ChIP实验都支持直接调控TFAM公司作者：Myc。
c-Myc结合TFAM公司现场。（A） 人类基因组序列始于外显子1上游3kb到下游7kb。外显子由黑箱表示。E框用竖线表示，放大器C中的E框如图所示。标记为A到G的水平条表示为扫描ChIP分析而放大的区域。如材料和方法中所述，在没有（−Tet）或存在（+Tet）四环素的情况下对P493-6细胞进行电镀，然后使用抗c-Myc抗体（Myc−Tet或Myc+Tet，）进行ChIP。同时进行非抗体对照实验（NAb−Tet或NAb+Tet）Tet对应于高Myc状态，而+Tet代表低Myc状态。进行定量PCR。所示为三倍的平均值。（B） 时间相关的顶部表达式TFAM公司对2091人原代成纤维细胞进行血清刺激。TFAM公司表达是相对于18S rRNA的标准化表达。显示了三份实时PCR的平均值（标准偏差小于平均值的5%）。底部染色质免疫沉淀分析显示Myc与TFAM公司在血清刺激人2091原代成纤维细胞后。与放大子B、C和D的结合（定义见面板A）显示为总输入DNA的百分比。
确定内源性Myc能否结合TFAM公司，如前所述，我们使用了原代人2091成纤维细胞(47). 众所周知MYC公司在血清刺激后1至2小时内诱导最大表达(47). 这里我们发现TFAM公司血清刺激后4至8小时相对于18S rRNA的表达（图。，顶部）。血清刺激后的ChIP实验显示，Myc与扩增子C和D的结合增加，在血清刺激后2和6小时达到峰值（图。，底部）。未发现与对照扩增子B的结合增加。这些实验进一步证实Myc结合TFAM公司。我们的基因表达和ChIP实验都支持直接上调TFAM公司作者：Myc。这些观察结果进一步支持了Myc通过转录调控影响线粒体生物发生的观点。
我们还试图确定Tfam公司内源性表达Myc公司，通过测量Tfam公司大鼠成纤维细胞Myc公司同源重组和急性剥夺原代小鼠肝细胞中的nullMyc公司通过条件floxed等位基因。慢性剥夺Myc公司在大鼠细胞中导致Tfam公司表达：myc的1.0倍+/+，myc的0.7倍−/−和0.93倍的myc−/−+Myc公司。相反，急性剥夺Myc公司肝细胞中Myc公司表达与Tfam公司Cre重组酶腺病毒感染2天后表达。虽然Tfam公司mRNA半衰期未知，我们的结果表明Tfam公司原代肝细胞中的表达可能依赖于与Myc共显性的其他因素。
讨论
Myc致癌转录因子影响超过10%的人类基因的表达，并成为将代谢与细胞生长和增殖耦合的主开关。由于估计Myc会影响大约3500个人类基因的表达，因此主要的挑战是了解Myc调节功能的生物学背景。Myc功能的级联效应可以通过其对其他转录因子及其辅因子的调节来实现，这些转录因子反过来调节参与特定细胞过程的基因。Myc调控的基因谱包括与线粒体功能有关的基因；然而，Myc是否直接影响线粒体的生物发生尚未明确。之前的三项研究，一项是PRDX3(47)（一种线粒体过氧化物酶原），一种带有丝氨酸羟甲基转移酶(36)（一个碳单位的主要来源），一个含有细胞色素c（c）(33)，表明Myc可能直接影响线粒体稳态、细胞代谢和凋亡，尽管没有人直接讨论Myc是否会影响哺乳动物细胞中线粒体的产生。在本报告中，我们通过Myc的体外和体内异位表达以及研究提供了证据Myc公司成纤维细胞的缺失与小鼠的急性缺失Myc公司在原代肝细胞中，Myc可能通过直接调节参与线粒体生物发生的基因而影响线粒体生物发生。
P493-6系统的使用使我们能够识别一组与线粒体生物发生有关的Myc应答基因。事实上，在Myc-responsive基因中，被注释为与线粒体结构和功能相关的这组基因在EAS分析中所占比例最高。特别有趣的是，Tfam是一种关键的线粒体转录调节器和mtDNA复制因子，对Myc具有响应性，正如我们在本报告中所证明的，它是Myc在P493-6和人类原代成纤维细胞系统中的直接靶点。Tfam过度表达似乎足以诱导线粒体转录，但体外不能诱导线粒体DNA复制(29). 然而，在转基因小鼠中，人类TFAM公司足以增加mtDNA拷贝数(12). 另一方面，通过HeLa细胞中的RNA干扰或小鼠中的基因缺失减少TFAM可减少mtDNA拷贝数，表明TFAM对mtDNA复制和线粒体生物发生是必要的(12,24). 值得注意的是，我们在鉴定与Myc合作的转录因子的电子工作中发现，核呼吸因子NRF1是六个预测Myc合作者之一顺式-管理模块(13). NRF1是线粒体生物发生的主要转录调节因子，最近被认为与E2F协同作用，尽管TFAM公司发现受NRF1约束，但不受E2F约束(5,25). 相反，我们的研究表明Myc能够直接结合TFAM公司表明Myc在诱导线粒体相关基因方面与E2F具有明显的非重叠功能。虽然Myc绑定了TFAM公司启动子区域，该区域缺乏典型E盒，类似于糖酵解TPI和GAPD基因的Myc结合区域，缺乏典型Myc结合位点(26). 值得注意的是，虽然Myc公司在大鼠成纤维细胞中Tfam公司表达，急性缺失Myc公司原代小鼠肝细胞的减少与Tfam公司表达式。需要注意的是Tfam公司mRNA未知，这些观察表明Tfam公司内源性Myc的表达可能依赖于组织类型或内源性Myc可能有助于Tfam公司表达式，但不是必需的。急性肝切除术后肝细胞线粒体质量下降Myc公司因此可能依赖于参与线粒体生物发生的其他Myc靶基因。尽管围绕Myc在监管方面的充分性和必要性存在不确定性Tfam公司再加上先前发现的与线粒体功能或生物发生有关的直接Myc靶基因，我们目前的研究结果坚定地支持Myc在线粒体生物发生中的作用。
我们的功能研究证实，在Myc诱导后，P493-6细胞增加了其耗氧量、线粒体质量和功能以及线粒体DNA含量。移除Myc公司相反，来自Rat1成纤维细胞的细胞，其正常线粒体切片数量减少，线粒体变形，可能组装不完全。尽管我们不了解线粒体的双峰分布Myc公司根据壬基嘧啶橙染色，我们推测，与大多数静止细胞相比，这些细胞的增殖室可能获得更高的线粒体质量，而不依赖于Myc。Myc在Myc公司然而，空细胞不仅部分地挽救了这些敲除细胞中的线粒体质量，而且增加了电子显微镜检测到的形态正常的线粒体切片数量。这些观察结果表明，Myc增加了这些细胞生成功能性线粒体的倾向Myc公司Cre重组酶导致原代肝细胞线粒体质量降低。总之，我们的研究结果证明了Myc在调节参与线粒体结构和功能以及线粒体生物发生的基因中的作用，并进一步证实了Myc是将细胞代谢需求与细胞生长和增殖耦合的主开关。
