人类疱疹病毒8型（HHV-8；卡波西肉瘤疱疹病毒）在所有临床形式的卡波西肉瘤中持续存在(2,6)AIDS相关体腔型淋巴瘤或胸腔积液型淋巴瘤(5)和多中心卡斯特曼病(15,42). HHV-8属于家族罗氏菌亚科; 它最近的近亲是最近发现的一种恒河猴鼠疫病毒，它含有大量同源开放阅读框（ORF），具有相似的基因组排列(1). 已发现HHV-8基因组包含一组独特的非结构基因，这些基因可能是病毒模拟的一部分，对病毒体内复制和致病性至关重要(36). HHV-8编码细胞干扰素（IFN）调节因子（IRF）的四种同源物；其中，ORF K9编码的病毒IRF-1（vIRF-1）(三,16,27,47)和ORF k11.1编码vIRF-2(4)，已经被克隆和鉴定，最近已经描述了vIRF-3（ORF k10.5和10.6）的克隆(29). vIRF-1在BCBL-1细胞中的表达很低，但可由十四烷酰基佛波酯（TPA）诱导(31). 几个小组(16,29,33,47)表明vIRF-1可以作为包含IFN敏感反应元件的启动子的阻遏物发挥作用。这种抑制至少部分是由于vIRF-1与细胞IRF的结合以及与转录辅激活子CBP/p300的竞争性结合(三). 过度表达vIRF-1的NIH 3T3细胞能够在软琼脂中生长并在裸鼠体内形成肿瘤(18,27). 我们之前已经克隆并鉴定了第二个HHV-8编码的vIRF，即vIRF-2，它编码163个氨基酸的短蛋白。它是组成转录的，在HHV-8阳性的B淋巴瘤细胞系中可以检测到vIRF-2转录物。我们已经证明，vIRF-2是一种DNA结合蛋白，具有不同于细胞IRF的特异性，因为它与对应于NF-κB位点的寡核苷酸结合(4). 在瞬时转染试验中，vIRF-2抑制病毒介导的IFN I型基因转录诱导以及RelA刺激的人类免疫缺陷病毒长末端重复序列的活性。vIRF-2特异性结合多种转录因子，如IRF-1、IRF-2、ICSBP（干扰素浓缩序列结合蛋白）和RelA/p65，以及转录辅激活子CBP/p300。
干扰素作为天然抗病毒防御机制的主要介质，刺激多种细胞基因的表达。其中一些基因编码可以调节病毒复制的蛋白质，从而在IFN处理的细胞中产生抗病毒状态。其中，干扰素诱导的双链RNA（dsRNA）激活的丝氨酸-三氢嘌呤蛋白激酶（PKR）是干扰素抗病毒和抗增殖作用的关键介体(10,17,32,40). PKR在细胞溶质中以非活性形式存在，用干扰素治疗可以进一步增强其表达。PKR由代理数量激活；然而，dsRNA的激活已经被广泛研究(45). 许多病毒产生高度结构化的病毒转录物，也可以通过类似于dsRNA的机制激活PKR(43). dsRNA与PKR的结合可以诱导构象变化并暴露自磷酸化的催化位点(13). 此外，PKR的二聚化被证明是自磷酸化过程的重要组成部分，这表明自磷酸化是分子间的(22,32). 据报道，活化的PKR靶向许多蛋白质，但真核起始因子2的α亚基（eIF-2α）(37)是唯一详细描述的生理基质。该因子的磷酸化导致蛋白质合成受到抑制，从而促进PKR的抗病毒、抗凋亡和抑瘤功能(45,46). 然而，除了在蛋白质合成中的作用外，PKR还可以在转录水平上调节基因表达。研究表明，PKR通过抑制亚单位IκB的磷酸化调节NF-κB信号传导(23)和PKR介导的组蛋白磷酸化(13)以及一种功能未知的90-kDa蛋白(35)也进行了演示。
许多研究表明，野生型PKR的过度表达会抑制哺乳动物和昆虫细胞以及酵母的细胞生长(9,21,30,44). 尽管真核细胞中生长抑制的机制尚待阐明，但通过抑制eIF-2α途径抑制翻译被认为在毒性表型中起作用。
本研究的目的是分析vIRF-2在蛋白质水平上的表达，并确定vIRF-2在病毒-宿主相互作用中的功能。我们已经发现vIRF-2在HHV-8阳性胸腔积液淋巴瘤系中组成性表达，并且大多数vIRF-2蛋白可以在细胞核中检测到。我们进一步表明，体外过度表达的vIRF-2抵消了IFN诱导的病毒蛋白合成障碍。抗干扰素活性是vIRF-2和PKR直接相互作用的结果，从而抑制PKR活性。因此，通过干扰PKR功能，vIRF-2可以通过下调早期炎症反应促进病毒入侵；作为一种组成性表达蛋白，它还可能有助于建立和维持病毒的持久性。
材料和方法
细胞培养和转染。
HEK293和HeLa细胞生长在含有10%胎牛血清BCBL-1、HBL-6的Dulbecco改良Eagle培养基中，JSC-1细胞生长在添加10%胎牛血浆的RPMI培养基中。次级流入HeLa细胞（4.5×106细胞/90mm直径的平板）用30μg空的或vIRF-2表达的质粒转染。如有指示，将细胞在无血清培养基中以10倍感染率（MOI）模拟感染或感染水泡性口炎病毒（VSV）45分钟，然后在完整培养基中培养5小时。或者，使用Superfect（Qiagen）试剂和poly（I-C）（10μg/ml；Sigma）转染细胞2小时。
质粒。
质粒pcDNA3.1/vIRF-2、pGEXT4/vIRF-2和pGEXT4-IRF-3的克隆和构建如前所述(三,39). FLAG标记的vIRF-2融合蛋白从同一质粒中表达，在vIRF-2cDNA的5′端插入一个FLAG表位编码区。此修改是通过PCR使用Pfu公司聚合酶（Stratagene），带有引物5′-CTTAGCTTGCGCCATGGATTACAAGGATGAGACGAGAGAGGATCACTCGC TACACGGTCGG和3′-GGGATATTACACAACCATCCTCTCTGG。
为了构建绿色荧光蛋白（GFP）/vIRF-2融合蛋白，利用引物5′-GAAGATTCTGCTCTACACGGTCGG和3′-TGGGGATCTACATCAACACTCTACCTCTGG对vIRF-2编码序列进行PCR扩增，并将其亚克隆到pEGFP-C载体（Invitrogen）中。通过直接DNA测序对所有构建物进行可能的突变测试。
RT-PCR分析。
总RNA由Trizol试剂（Life Technologies）分离，并在37°C下用无RNase DNase I（Boehringer Mannheim）处理20分钟。使用SuperScript II逆转录酶（RT；Life Technologies）和寡核苷酸（dT）合成4微克总RNA20底漆。在30个序列特异性引物的PCR扩增周期中，使用两微升cDNA反应混合物作为模板，序列特异引物如下：5-GAAGAATTCATGGCTCTACACGGAGTCGG和3′-TGGGGATCTACATCAACACTCTACCTCTGG用于vIRF-2转录，K11转录本的5′-AGCGGATCCCCACAGTTTTTTTTTGAAGAGC和3′-GCTGATTCCTAGTCTGTGGTGAAAATGGG，vIRF-2和K11.1区域的5′-GAAGATTCATGGCTCTCTACGGAGTCGG和3′-GCTGAATTCTGTGGAAGG。PCR产物（10μl）通过1.5%三硼酸盐-EDTA琼脂糖电泳分离。
重组vIRF-2蛋白和抗体的制备。
谷胱甘肽的制备S公司-转移酶（GST）和His6重组融合蛋白如前所述(三). 从异丙基-β中清除的裂解物-d日-将硫代吡喃半乳糖苷（Sigma）刺激的细菌与谷胱甘肽琼脂糖珠（200μl在磷酸盐缓冲盐水中的1:1浆液）（Pharmacia）在4°C下混合2小时，并用冰冷的超声缓冲液洗涤珠三次(三). 用含有50 mM Tris（pH 8.5）、150 mM NaCl和20 mM还原谷胱甘肽的洗脱缓冲液洗脱结合蛋白。融合蛋白的纯度和数量通过十二烷基硫酸钠（SDS）-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和考马斯蓝染色进行检测。
SDS-PAGE纯化了他的6/根据标准的7周免疫方案，使用vIRF-2蛋白在新西兰白兔体内生成多克隆抗体。vIRF-2抗血清在镍上进一步纯化2+/含有His的螯合亲和柱6/vIRF-2蛋白和抗原特异性抗体用高H溶液（0.1 M三乙胺[pH11.5]）洗脱。使用纯化抗体，我们能够通过连续稀释分析检测到低达50 pg的vIRF-2/GST蛋白，几乎没有与任何其他重组或内源性蛋白发生交叉反应。用小鼠单克隆抗体M2（Stratagene）检测FLAG标记蛋白。
GST下拉分析。
这个35根据制造商的说明书，使用偶联的TNT T7转录/翻译系统（Promega）在体外合成S标记的蛋白质。每个反应混合物包含1μg非线性表达质粒，并在4μl Translabel（DuPont）氨基酸混合物存在下培养（90分钟，30°C）。结合到谷胱甘肽-甘露糖珠的GST融合蛋白（0.5μg）与10μl反应混合物等分液孵育35250μl结合缓冲液中的S标记蛋白质（10 mM Tris[pH7.6]，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA[pH8.0]，1 mM二硫苏糖醇，5 mM MgCl20.05%NP-40，8%甘油，哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物[Sigma]）在4°C下保持90分钟。用结合缓冲液洗涤三次（室温下10分钟）后，结合到珠子上的蛋白质在样品缓冲液中溶解，并用Tricine-SDS-PAGE（8%凝胶）溶解。将凝胶干燥并暴露于薄膜中。如有指示，使用HeLa全细胞裂解物代替兔网织红细胞裂解物检测GST蛋白相互作用。将结合的蛋白质进行电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad）上，并用抗PKR抗血清（由G.N.Barber提供）进行免疫印迹。使用增强化学发光试剂盒（法玛西亚/阿默沙姆）进行检测。
体外激酶反应。
人类野生型PKR从107HeLa细胞如下。高盐（500 mM NaCl）细胞提取物（600μl）与3μl兔多克隆或鼠抗PKR单克隆抗体孵育(25)在蛋白酶和磷酸酶抑制剂（抑制剂鸡尾酒；Sigma）存在下过夜。用高盐裂解缓冲液洗涤两次结合PKR的珠子，用激酶缓冲液洗涤二次（10 mM Tris[pH7.6]，50 mM KCl，2 mM醋酸镁，20%甘油，7 mMβ-巯基乙醇，1 mM MnCl2，1μM ATP，[γ]的5μCi-32P] ATP、蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。如有指示，将免疫复合物与poly（I-C）（100μg/ml；Sigma）、2μg组蛋白2A或400 ng纯化eIF-2α（由J.Jefferson善意提供）和指示量的可溶性GST融合蛋白在冰上预培养10分钟。ATF2/GST蛋白购自新英格兰生物实验室。反应混合物在30°C下培养25分钟，通过在样品缓冲液中煮沸停止反应。标记的蛋白质通过Tricine-SDS-PAGE（8%凝胶）分解、干燥并暴露于薄膜中。
VSV感染细胞的代谢标记。
如上所述，转染空白或表达vIRF-2的pcDNA3.1载体的HEK293细胞在转染24 h后模拟感染或感染VSV（MOI为10）。细胞在感染Pro-mix后5小时被脉冲标记我-35S细胞标记混合物（50μCi/ml；Amersham/Farmacia）在Met-和Cys-耗尽培养基中放置1 h。然后用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞并在细胞裂解缓冲液中溶解。标记的蛋白质通过Tricine-SDS-PAGE（8%凝胶）进行解析、干燥，然后暴露在胶片或荧光成像仪屏幕上进行定量。
结果
BCBL-1细胞中vIRF-2和K11 ORF的不同转录调控。
我们之前通过Northern印迹和RT-PCR分析表明，vIRF-2 ORF（命名为K11.1）在HHV-8阳性的BCBL-1细胞中组成性表达(4). 为了更详细地分析vIRF-2的表达，并检查vIRF-1（K11.1）与近端K11 ORF一起转录的可能性（图。A） 作为一个转录物，我们使用vIRF-2和K11的特异性引物，以及对应于5′vIRF-2和3′K11区域的一组引物，通过RT-PCR在BCBL-1细胞中扩增vIRF-1转录物。这些引物应扩增推测的常见K11和K11.1转录本。如图所示。B、 用vIRF-2或K11特异引物对poly（dT）引物cDNA进行RT-PCR扩增，只扩增出一个片段，其大小与K11 ORF和vIRF-2相对应，与基因组DNA扩增的片段大小相同。然而，vIRF-2和K11组合引物不能扩增出特定的产物，而这两个引物能够从BCBL-1细胞的基因组DNA中扩增出2.2kb的片段。此外，虽然RT-PCR仅在TPA刺激的细胞样本中检测到K11特异性产物，但从TPA刺激和未刺激的细胞中扩增出vIRF-2特异性片段。这些数据表明，vIRF-2和K11 ORF在BCBL-1细胞中均表达为不同的全长聚腺苷化转录物，在诱导或未诱导的细胞中，我们都无法检测到2.2-kb的转录物，这表明转录从vIRF-2~K11进行。此外，这些数据表明vIRF-2和K11 ORF在病毒复制周期的不同阶段表达。
vIRF-2和K11 ORF在BCBL-1细胞中的表达。（A） HHV-8基因组89至95kbp区域的方案，显示细胞IRF的vIRF-2（K11.1）、K11和vIRF-3（K10.5和K10.6）同源物簇。（B） 对照组和TPA（50 ng/ml）诱导的BCBL-1细胞24小时的RT-PCR分析。vIRF-2（V2）的组成性表达与K11的诱导性表达形成对比。使用5′vIRF-2和3′K11引物（V2+K11）的组合检测，没有检测到特定产物，这是一种理论上常见的转录物。显示了从BCBL-1基因组文库扩增的对照PCR产物。RT-PCR扩增全球生产总值mRNA显示为对照。
vIRF-2蛋白在HHV-8阳性胸腔积液淋巴瘤细胞系的细胞核中组成性表达和定位。
为了检测vIRF-2在HHV-8阳性B细胞淋巴瘤细胞系中的表达，我们制备了抗重组全长His的兔多克隆抗血清6/vIRF-2融合蛋白。按照材料和方法以及参考文献中的描述，通过免疫亲和层析纯化抗血清27.图通过Western blot杂交分析，A显示纯化的vIRF-2抗血清的特异性。虽然抗血清很容易检测到5 ng vIRF-2/GST蛋白，但没有观察到高达500 ng的vIRF-1/GST蛋白发生交叉反应。抗血清还检测到瞬时转染的HEK293细胞体外表达的vIRF-2蛋白（图。B） ●●●●。我们还从用vIRF-2抗血清免疫印迹的HHV-8-阳性BCBL-1细胞的细胞裂解液中检测到一种表观分子量为20 kDa的特异蛋白（图。C） ●●●●。HHV-8阴性Louckes细胞裂解液中未检测到信号。经SDS-PAGE测定，vIRF-2的迁移率约为20kDa，与预测的分子量18.5kDa相当。迁移率的微小差异可能是由于vIRF-2的翻译后修饰或其高整体基本性质（pI9.8）。BCBL-1细胞的分离表明，vIRF-2主要定位于细胞核部分；细胞质部分只显示出低水平的蛋白质。这些数据表明，vIRF-2是一种主要的核蛋白。与vIRF-2 mRNA分析一致，未刺激和TPA刺激的BCBL-1细胞中检测到的vIRF-2蛋白的相对水平相同。因此，vIRF-2与HHV-8编码的潜伏相关核抗原（LANA）和v-cyclin一样，是一种组成性表达的核蛋白(38).
检测HHV-8阳性淋巴瘤细胞裂解液中的vIRF-2蛋白。（A） His的特异性6/通过检测5和500 ng vIRF-2/GST融合蛋白（通道1和3）证明vIRF-2免疫纯化抗体。未观察到与等量vIRF-1/GST蛋白的交叉反应（通道2和4）。（B） NIH 3T3细胞体外表达vIRF-2的检测。用4μg空的或表达vIRF-2的pcDNA载体转染细胞。48小时后制备全细胞裂解物（20μg），并用vIRF-2抗体进行免疫印迹。（C） 检测BCBL-1细胞核质组分中的vIRF-2。用TPA（50 ng/ml）处理BCBL-1和对照HHV-8阴性Louckes细胞24 h。通过差速离心和免疫印迹vIRF-2抗体，从对照细胞或TPA刺激细胞制备细胞质和核组分（20μg）。唯一的免疫反应蛋白具有明显的20 kDa的迁移率。（D） 使用免疫纯化抗vIRF-2抗体对不同细胞系的核提取物（20μg）进行免疫印迹分析。图中显示了约20kDa的区域。
为了进一步测试vIRF-2抗体的特异性，我们分析了几种细胞系的核部分是否存在20kDa免疫反应蛋白。在另外两个HHV-8阳性的胸腔积液淋巴瘤细胞系HBL-6和JSC-1中也检测到20-kDa蛋白（图。D） 而在HEK293、Jurkat、Namalwa和NIH 3T3细胞中未检测到信号（数据未显示）。
为了证实vIRF-2的核定位，用表达增强型GFP（EGFP）/vIRF-2融合蛋白的质粒瞬时转染HeLa细胞。图A显示了GFP特定过滤器捕获的图像，图。B显示了一个由计算机生成的叠加图，它将GFP和Hoechst染色特定过滤器捕捉的图像结合在一起。EGFP/vIRF-2蛋白与Hoechst核染色显示出明显的共定位，如亮蓝色所示。在用空EGFP载体转染的细胞中，GFP特异性信号分布在整个细胞中，没有任何模式（数据未显示）。我们还对确定vIRF-2的亚细胞定位是否受到细胞外信号的调节感兴趣。然而，TPA和病毒感染均未对vIRF-2的核定位产生任何影响（数据未显示）。这些数据表明，vIRF-2独立于病毒感染或导致蛋白激酶C活化的细胞外信号而被转运到细胞核。
EGFP/vIRF-2融合蛋白的核定位。用4μg EGFP/vIRF-2表达载体转染HeLa细胞。36 h后固定细胞并用DNA染色（Hoechst）进行复染。（A） 使用GFP特定过滤器可视化EGFP/vIRF-2。（B） 使用特定于GPF和Hoechst的过滤器，由计算机生成同一场连续捕获图像的叠加。深蓝色显示细胞核；亮蓝色表示核信号和EGFP信号的共定位。
vIRF-2抑制IFN-α的抗病毒作用：从IFN-诱导的阻断中拯救VSV mRNA翻译。
我们之前已经证明，在瞬时转染试验中，vIRF-2蛋白是IFN-α和IFN-β启动子的有效抑制剂。抑制机制包括（i）vIRF-2与转录因子IRF-1和RelA以及转录辅激活因子CBP/p300的结合，以及（ii）抑制其反式激活电位(4). 为了评估vIRF-2是否能直接抑制干扰素的抗病毒作用，我们测试了vIRF-2对干扰素介导的VSV蛋白合成抑制的作用。我们选择VSV是因为它对干扰素的抗病毒作用非常敏感。它的复制周期也很短，允许我们使用转染vIRF-2的细胞(14). 如图所示。A、 转染空载体的HEK293细胞对IFN的抗病毒作用有反应，并且IFN-α显著减少了VSV早期蛋白的合成2在高于360U/ml的浓度下。然而，在用vIRF-2-表达载体转染的细胞中，即使当高浓度（1000U/ml）的IFN-α2使用了（图。A） ●●●●。在存在和不存在vIRF-2的IFN处理细胞中检测到的VSV基质蛋白相对水平的定量如图所示。B.VSV基质蛋白的相对水平不受干扰素治疗的影响，即使在高干扰素-α2vIRF-2表达细胞中的浓度（1000 U/ml）。在干扰素浓度为120 U/ml时，标记的基质蛋白的数量略有增加，这可能是由于细胞样本的差异所致。相反，在用增加浓度的IFN-α处理的亲代细胞中，基质蛋白的相对水平成比例地降低2转染细胞中外源性表达的FLAG标记的vIRF-2蛋白水平如图所示。C.这些数据提供了证据，证明vIRF-2可以介导病毒对干扰素的耐药性，并挽救干扰素诱导的病毒mRNA翻译障碍。
vIRF-2的表达挽救了IFN诱导的病毒蛋白合成阻断。（A） 用空载体（pcDNA3.1）或表达FLAG/vIRF-2的载体（vIRF-2F/pcDNA A3.1）转染代谢标记细胞的放射自显影分析。细胞被模拟感染（−）或感染VSV（+），5小时后脉冲标记为35材料和方法中所述的S标记氨基酸混合物。早期VSV蛋白的位置标记在右侧。（B） pcDNA或vIRF-2F/pcDNA转染细胞中29-kDa VSV基质蛋白（M）的相对水平及其对IFN浓度增加的依赖性。使用磷光成像密度计和数据分析软件，从放射自显影图中量化用增加浓度的干扰素预处理的细胞中的病毒蛋白数量。误差条表示来自三个独立实验的标准误差。（C） 使用抗FLAG抗体在pcDNA或vIRF-2F/pcDNA转染细胞的代表性样本中免疫印迹检测FLAG标记的vIRF-2。
vIRF-2在体外与PKR发生物理相互作用。
研究表明，干扰素介导的VSV复制抑制发生在病毒蛋白合成水平，PKR在这种抑制中起主要作用(14,26,41). 因此，我们研究了先前实验中观察到的vIRF-2介导的干扰素作用抑制可能与PKR活性调节有关的可能性。由于PKR是蛋白质合成的一个众所周知的关键调节因子，它经常被病毒因子靶向，因此我们检测了vIRF-2是否与PKR直接相互作用。含有vIRF-2/GST的珠子与体外翻译的放射性标记PKR孵育后保留了大量（50%的输入）输入PKR（图。A、 而没有PKR与含有GST的珠子相关（车道2）。这种高水平的结合表明vIRF-2和PKR之间的相互作用非常强。这种相互作用对vIRF-2是特异性的，因为PKR与相同数量的vIRF-1/GST融合蛋白（通道4）无关。此外，在体外翻译的IRF-3和荧光素酶中没有与vIRF-2/GST结合（图。B、 车道3和4）。
vIRF-2在体外与PKR结合。（A） 在vitro-translated中，35S标记的PKR与GST标记的vIRF-2或vIRF-1偶联到谷胱甘肽-甘露糖珠培养，如材料和方法中所述。通道1代表用于结合反应的体外翻译PKR（p68）输入量的10%。（B） 未结合经体外翻译的，35S-标记荧光素酶（Lucif）或IRF-3到GST/vIRF-2珠。（C） 将干扰素（500 U/ml，16 h）处理或未处理的HeLa细胞的全细胞裂解物与GST标记的vIRF-2或vIRF-1偶联到谷胱甘肽-糖珠培养。通过SDS-PAGE分离结合蛋白，并用抗PKR抗血清进行免疫印迹分析。通道1和通道2显示用于结合反应的细胞裂解液输入体积的10%中存在p68。
为了测试vIRF-2结合内源性表达的PKR的能力，将来自对照细胞和用IFN-α预处理16 h的细胞的全细胞裂解物与含有vIRF-2/GST的珠培养（图。B） ●●●●。与之前的数据一致，大量PKR与含有vIRF-2/GST的珠子结合（图。B、 通道3），干扰素处理的细胞裂解液与干扰素的结合约为未处理细胞的三倍（通道4）。未检测到PKR与仅含GST或vIRF-1/GST融合蛋白的珠子的结合（通道5至8）。
vIRF-2抑制组蛋白2A的PKR自磷酸化和磷酸化。
接下来，我们测试了vIRF-2–PKR相互作用是否对PKR的内在激酶活性有任何影响。为此，我们从感染了VSV或受到dsRNA刺激的HeLa细胞中免疫沉淀PKR，并通过免疫复合物激酶分析测定其活性。在没有组蛋白2A的情况下，未刺激细胞中PKR的自磷酸化水平如图所示。A、 车道1。对照ATF2/GST融合蛋白（2μg）没有调节PKR活性的自磷酸化（通道2），但添加vIRF-2/GST蛋白显著抑制PKR磷酸化（路径3）。如图所示。B、 PKR在对照细胞和VSV感染细胞中均被自动磷酸化，并特异性磷酸化纯化的组蛋白2A蛋白（通道1和2）。然而，当vIRF-2/GST包含在激酶反应中时，我们观察到PKR自磷酸化和组蛋白2A磷酸化中的vIRF-2/GST浓度依赖性降低（3到6道）。因此，250 ng纯化的vIRF-2/GST蛋白可有效抑制PKR的自磷酸化，并完全抑制组蛋白2A的磷酸化（通道3-4），而1μg vIRF-2/GST蛋白可完全抑制PKR自磷酸化和底物磷酸化（区域5-6）。
vIRF-2在体外抑制PKR自身磷酸化和组蛋白2A（H2A）和eIF-2α的磷酸化。（A） 在不存在H2A底物（第1道）和存在H2A和ATF2/GST（2μg）或vIRF-2/GST（400 ng）的情况下，用兔多克隆抗体从对照HeLa细胞免疫沉淀PKR（p68）的蛋白激酶分析。（B） 模拟感染（−）或VSV感染（+）细胞中PKR免疫沉淀的H2A磷酸化。如图所示，向每个反应中添加更多纯化的vIRF-2/GST蛋白。（C） 用来自对照和聚（I-C）（pIC）刺激的HeLa细胞的单克隆抗体免疫沉淀的PKR使eIF-2α磷酸化。在顶部显示的每种重组蛋白中，有或没有500 ng的重组蛋白时进行反应。磷酸化PKR和eIF-2α的水平进行了量化，并绘制在相应的面板中。显示了至少三个独立实验的代表性样本。
我们还检测了vIRF-2对PKR磷酸化PKR特异性底物eIF-2α能力的影响。将HeLa细胞或dsRNA-转染的HeLa（2 h）细胞在高盐缓冲液中溶解，并用单克隆抗体免疫沉淀PKR。在存在和不存在vIRF-2的情况下分析eIF-2α底物的磷酸化（图。C） ●●●●。在dsRNA刺激的细胞中，未刺激细胞中PKR对eIF-2α的磷酸化显著增强（图。而PKR的自磷酸化在多聚（I-C）刺激后仅略有增加（通道1和2）。当在存在GST/vIRF-2蛋白的情况下进行磷酸化时，在多聚（I-C）处理和未处理的细胞（通道4）中，PKR自磷酸化和eIF-2α磷酸化均受到极大抑制。相反，添加相同数量的IRF-3/GST或ATF2/GST没有影响（车道5至8）。以H2A为底物，观察到vIRF-2/GST具有相同程度的抑制作用（数据未显示）。
研究表明，PKR必须同质二聚才能进行自磷酸化和催化活性(24). vIRF-2是否能阻止PKR的同二聚体化，从而阻止PKR自身磷酸化，或者它是否与催化结构域结合并起到假底物的作用，尚待确定。
讨论
我们在本研究中表明，vIRF-2是一种约20kDa的潜伏相关核抗原，可在所有HHV-8阳性B细胞淋巴瘤细胞系中检测到。相反，在未刺激的BCBL-1细胞中只能检测到低水平的vIRF-1表达，TPA治疗可以进一步刺激其表达(29,31). 由于在所有测试的胸腔积液淋巴瘤中都观察到vIRF-2的表达，因此vIRF-2作为HHV-8感染标志物的潜在用途值得考虑。在BCBL-1细胞中组成性表达的另外两个HHV-8编码基因是编码v-cyclin和LANA的基因(11,20,28,34). 这些基因被鉴定为I类潜伏基因，可能与HHV-8诱导的恶性肿瘤有关(38). 这两种编码蛋白都能使肿瘤抑制蛋白失活。最近研究表明，LANA可以结合p53，抑制其转录活性，并保护细胞免受细胞死亡(12)发现v-cyclin与视网膜母细胞瘤蛋白结合(7). 我们在本研究中观察到vIRF-2与PKR相互作用并抑制其抗病毒活性。由于PKR在干扰素介导的抗病毒和抗细胞反应中起着关键作用，这些数据表明，通过编码vIRF-2，HHV-8创建了一种机制，通过该机制可以直接靶向抗病毒反应PKR的关键效应器。
我们之前已经证明，vIRF-1、vIRF-2和vIRF-3可以通过抑制细胞IRF（即IRF-1，IRF-3和IRF-7）的反式激活活性来抑制病毒介导的IFN-α和IFN-β启动子的激活(三,29; 未发表的结果），从而作为细胞IRF的显性阴性突变体发挥作用。所有这些vIRF还抑制了IFN介导的对IFN诱导基因（ISG）启动子的刺激。这种抑制可能是通过干扰转录复合物ISGF3的组装或功能而发生的，该转录复合物含有IRF-9加上活化的STAT-1和STAT-2，并与ISG启动子中存在的IFN敏感反应元件结合(三,4,16,47). 结合PKR并调节其活性的能力可能是vIRF-2的一个独特特性，因为没有检测到vIRF-1和PKR之间的相互作用，也不知道vIRF-3是否能结合PKR。其他几种DNA病毒已经开发出不同的机制来规避PKR作用（参考文献中综述19). 腺病毒和EB病毒编码结合并抑制PKR功能的小RNA；呼肠孤病毒和痘苗病毒编码隔离dsRNA的蛋白质。单纯疱疹病毒1型、痘苗病毒和丙型肝炎病毒（HCV）也编码与PKR结合并阻止其激活的蛋白质。研究表明，HCV编码的非结构蛋白NS5A直接与PKR的催化结构域结合，并且过度表达NS5A的细胞对凋亡具有抵抗力。有人认为，NS5A介导的凋亡破坏可能赋予HCV致癌潜能(14). 因此，PKR活性的破坏不仅可能抑制其抗病毒作用，还可能抑制其生理功能，并有助于病毒诱导的致病性。因此，vIRF-2对PKR的影响以及LANA和v-cyclin的影响可能在持续病毒感染期间维持恶性肿瘤的发生中发挥作用。
然而，vIRF-2似乎并不具有vIRF-1的致癌潜能(18,27). NIH 3T3细胞中vIRF-1的过度表达使其在软琼脂中生长，这些细胞移植后在裸鼠体内形成肿瘤。肿瘤的形成与vIRF-1介导的c-myc公司细胞凋亡的表达与抑制(三,18). 相反，表达vIRF-2的NIH 3T3细胞既没有在软琼脂中形成集落，也没有在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤（L.Buríšek和P.M.Pitha，未发表的结果）。这些结果表明，仅vIRF-2不能诱导转化表型。
抑制或延迟宿主细胞的凋亡可能是持续感染HHV-8的一个重要要求，因为该病毒使用多种替代机制来防止感染细胞死亡。它编码Bcl-2的细胞同源物(8)，一种凋亡抑制剂，并使用vIRF-1抑制IRF-1介导的凋亡(4,47). 这两个基因都在溶血感染期间表达，它们的表达可能使病毒完成完整的复制周期并延迟宿主细胞死亡。此外，编码LANA和vIRF-2的两个潜在表达基因分别靶向促凋亡蛋白p53和PKR的功能，这可能对维持慢性感染很重要。因此，抑制细胞凋亡以及其他HHV-8编码癌基因的作用可能对卡波西肉瘤的致瘤性也很重要。
