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EMBO J。2005年4月20日；24(8): 1546–1556.
2005年3月24日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600592
预防性维修识别码：项目经理1142564
PMID：15791210

内质网BIK在细胞凋亡过程中启动DRP1调节的线粒体嵴重塑

热尔曼,1,* 贾吉·P·马泰,1,* 海蒂·M·麦克布莱德,2,b条和Gordon C海岸1,三，一
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摘要

内质网（ER）可引发促凋亡信号，导致钙的传递2+线粒体，从而刺激分裂酶DRP1向细胞器表面募集。在这里，我们显示只有BH3-的BIK激活了完整细胞内质网的这条通路，导致线粒体断裂，但细胞色素很少释放c（c）到细胞溶质。BIK诱导的线粒体转化本质上是动态的，涉及DRP1依赖性重塑和嵴开放，嵴是细胞色素的主要储存地c（c）居住。DRP1的这种新功能与其在调节线粒体分裂中的公认作用不同。洋地黄素对外膜的选择性渗透证实了BIK刺激导致线粒体内细胞色素的动员c（c）值得注意的是，BIK可以与靶向线粒体的弱BH3-only蛋白（如NOXA）合作，通过独立于DRP1酶活性的机制激活BAX。当BIK和NOXA一起表达时，会导致动员的细胞色素快速释放c（c）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活。

关键词：Bax、钙、胱天蛋白酶、裂变、NOXA

介绍

通过一种称为凋亡的程序化细胞死亡形式，可以消除受损或对生物体构成潜在威胁的细胞，例如癌前细胞。这些细胞中固有的凋亡应激信号通过对BCL-2蛋白家族促凋亡BH3-only亚群成员的影响激活线粒体死亡途径。这些蛋白质诱导细胞色素的释放c（c）来自线粒体，然后与细胞溶质衔接蛋白Apaf-1结合，导致caspase-9的募集和激活(考夫曼和亨加特纳，2001年). 只有BH3-的BCL-2成员有可能直接进入线粒体核心凋亡机制，因为在其活性构象中，它们调节多BH结构域成员BAX和BAK在线粒体外膜中寡聚并释放膜间蛋白（包括细胞色素）的能力c（c），到胞质溶胶(世界环境学会等, 2000,2001). 另一方面，抗凋亡BCL-2蛋白可以与促凋亡分子的活化构象形成二聚体，并阻止线粒体表面事件的进展(乐泰等, 2002；Ruffolo和Shore，2003年).

其他细胞途径可以与这一核心线粒体机制合作，促进细胞凋亡。Youle及其同事描述了一个例子，他们发现在完整细胞线粒体管状网络的离散位点上动力相关蛋白-1（DRP1）的募集和激活有助于细胞色素的排出c（c）细胞溶质和凋亡(弗兰克等, 2001). DRP1是一种GTPase，可导致线粒体外膜断裂，导致线粒体小管分裂为点状碎片（参见博西·威策尔等, 2003；Karbowski和Youle，2003年). 然而，DRP1在线粒体凋亡中的确切作用尚待确定，最近的研究发现线粒体融合-裂变机制的多个成员也参与其中(奥利康等, 2003；李等, 2004；杉冈等, 2004；绍鲍德考伊等, 2004)表明这些监管机构之间存在复杂的相互作用。

钙的释放可以诱导DRP1向线粒体的募集和随后的线粒体分裂2+从内质网（ER）储存并随后被线粒体吸收，在一种情况下，线粒体通过内质网膜的一种完整蛋白BAP31的caspase-8裂解启动(布雷肯里奇等，2003年3月). 这些由BAP31的p20裂解产物启动的钙和DRP1依赖性事件与其他caspase-8启动的途径合作，特别是内源性BID转化为其活性构象tBID，以增强细胞色素的释放c（c）到细胞溶质。钙的潜在机制2+-然而，线粒体对直接促凋亡损伤的DRP1依赖性致敏性尚不清楚。然而，考虑到ER-Ca的可能普遍性2+细胞凋亡过程中的信号传递(法拉利等, 2002；布雷肯里奇等2003年a；奥雷尼乌斯等, 2003)，完整细胞线粒体凋亡的这种双重打击机制可能延伸到其他死亡途径，并涉及ER和线粒体的调节器，与所讨论的死亡刺激相当。

对这个问题的见解来自细胞色素的生化研究c（c）分离线粒体的释放途径。这些线粒体的治疗在体外重组tBID导致嵴开放和细胞色素在嵴内储存的动员c（c）然后通过BAX，BAK依赖机制从细胞器中泄漏出来(斯科拉诺等, 2002). 由于在缺乏死亡刺激的情况下，线粒体通常包含闭合的嵴，因此这些嵴的重塑可以动员线粒体内的细胞色素c（c）因此，这可能是大多数通过线粒体死亡机制运作的途径的标志。

有趣的是，BCL-2同系物除了在线粒体中定位外，还可以在内质网中发现。其中一个例子是BH3-only蛋白BIK，它可以从内质网位置刺激线粒体依赖性凋亡途径(日尔曼等, 2002). 我们在这里证明BIK启动早期Ca2+-介导内膜嵴的重塑和线粒体的断裂。对BIK的反应中嵴的开放与器官内细胞色素的动员相关c（c）商店。此外，BIK可以与一种较弱的线粒体靶向BH3-only蛋白NOXA合作，以构象方式激活BAX。BIK和NOXA联合刺激活化细胞色素的强劲释放c（c）来自细胞器和效应胱天蛋白酶的激活。在显性干扰DRP1（K38E）的存在下，BIK表达引起的线粒体嵴的早期重塑受到抑制，这表明DRP1在细胞色素调节中具有新的功能c（c）线粒体释放和诱导凋亡。

结果

仅BH3的BIK在其C末端包含疏水性跨膜（TM）片段(博伊德等, 1995；汉族等, 1996). 在诱导内源性蛋白或异位载体的表达后，BIK主要被发现是内质网膜的一个完整蛋白，如果有足够的时间，它可以从这个位置诱导caspase依赖的凋亡(日尔曼等, 2002；马泰等, 2002). 用细胞色素b的ER-选择性TM取代BIK-TM片段5（Flag-BIKb5）产生了一种蛋白，随着时间的推移也会诱导凋亡，证实BIK可以在ER膜上发挥作用(日尔曼等, 2002). 然而，值得注意的是，利用腺病毒载体Ad HA-BIK在H1299细胞中异位表达BIK导致了效应半胱天冬酶活性（DEVDase）的诱导，但BIK蛋白的出现滞后了数小时(图1A和B). 利用细胞色素b5-TM选择性靶向内质网的BCL-2抑制BIK诱导的caspase活性，并允许BIK在这些细胞中的增强积累（另请参阅马泰等, 2002). 鉴于早期ER信号在使线粒体对凋亡刺激敏感中的潜在作用(布雷肯里奇等2003年a,2003年3月)因此，我们关注BIK蛋白出现后不久的时间点（Ad HA-BIK感染后10–12小时），以探讨BIK对这些信号的影响。H1299细胞感染Ad BIK后表达的BIK水平与细胞应激刺激（如p53过度表达）后产生的内源性BIK水平相似(马泰等, 2002).

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Ad-HA-BIK诱导半胱天冬酶的时间进程。(A类)将稳定转染载体或表达HA-BCL-2b5的载体的H1299细胞感染Ad HA-BIK指定时间，然后使用荧光底物DEVD-AMC测定caspase活性。显示了三次独立测定±标准偏差的结果。(B类)BIK在Ad HA-BIK感染细胞中的表达。细胞按（A）处理，蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并用抗BIK和肌动蛋白抗体进行检测（作为负荷对照）。

BIK通过Ca诱导线粒体分裂2+信号

由于内质网是细胞内钙的主要储存区2+和BCL-2同源物已被证明影响ER-Ca2+商店，分析了BIK表达对这些商店的早期影响。为了避免下游效应器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的潜在影响，从而可能导致对BIK反应的反馈放大，所有后续实验均在广谱caspase抑制剂zVAD-fmk的存在下进行，该抑制剂完全消除了BIK诱导的caspase-3样（DEVDase）活性（数据未显示；另请参阅日尔曼等, 2002). 在zVAD-fmk存在下用Ad-HA-BIK感染H1299细胞12小时，然后用Ca负载2+-测定胞浆钙的敏感染料Fura-22+水平。ER钙2+储存量被测量为[钙2+]细胞溶质的在添加thapsigargin（TG）之前和之后，TG是SERCA泵的抑制剂，可快速耗尽ER中可释放Ca2+(梅里等, 1996；布雷肯里奇等，2003年3月). 与模拟感染细胞相比，HA-BIK的表达导致ER-Ca的减少2+而禁用的BH3突变体HA-BIK（L61G）的表达水平高于野生型BIK(马塔伊等, 2002)，效果大大降低(图2A).

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BIK诱导依赖钙的线粒体形态改变2+信号。(A类)在zVAD-fmk存在下用Ad-HA-BIK感染H1299细胞12小时，然后用Ca负载2+-敏感染料Fura-2。细胞蛋白酶Ca2+在添加2μM TG前后，利用510 nm发射波长下340/380 nm激发比进行测量。结果表示为添加TG前后510 nm比值的差异。显示了至少五次独立测定±s.d.的结果。(B类)线粒体断裂与细胞色素c（c）在Ad HA-BIK感染细胞中释放。在zVAD-fmk存在下用Ad-HA-BIK处理细胞12小时，用线粒体TOM20（Alexa-Fluo 488（绿色））抗体和细胞色素双重染色c（c）（Alexa-Fluro 495（红色））并通过免疫荧光检测。显示了具有代表性的图像。(C类)线粒体钙2+-摄取抑制剂Ru360可防止BIK诱导的线粒体断裂。在存在zVAD-fmk和不存在或存在20μM Ru360的情况下，用对照腺病毒载体（Ad-rtTA）或Ad-HA-BIK感染H1299细胞12小时。固定细胞，用线粒体标记物TOM20染色，并测定线粒体分裂细胞的百分比。给出了三个独立实验的结果。(D类)线粒体裂变和细胞色素的定量c（c）从免疫荧光中释放，如（B）所示。显示了三次独立测定±标准偏差的结果。

在Fas死亡途径中，caspase-8在内质网处切割BAP31诱导内质网钙2+钙的释放和伴随吸收2+通过线粒体，导致DRP1介导的线粒体分裂(布雷肯里奇等，2003年3月). 感染Ad-HA-BIK后，用针对外膜TOM20或膜间细胞色素的抗体染色的线粒体c（c）同样也经历了从管状网络到碎片模式的转变(图2B). 分裂被线粒体钙抑制剂Ru360阻断2+吸收，吸收(图2C)表明这些形态变化依赖于钙2+传播到细胞器。此外，Ru360抑制了BIK诱导的caspase（DEVDase）的长期激活（数据未显示），表明Ca2+BIK通路的组成部分对于BIK最终触发完整细胞中线粒体凋亡的能力是重要的。值得注意的是，HA-BIK在小鼠细胞中的表达Bap31型(布雷肯里奇等, 2002)导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活（未显示），并且在此处使用的人类H1299细胞条件下（即zVAD-fmk的内含物），未导致BAP31分裂(日尔曼等, 2002)认为BIK刺激的线粒体裂变途径不涉及BAP31。最后，诱导内源性细胞BIK对p53过度表达的反应(马泰等, 2002)导致ER Ca的释放2+和线粒体分裂，这被BIK的siRNA敲除所抑制(补充图1). 因此，异位BIK启动ER通路的能力与内源性BIK共享。

DRP1介导的线粒体动态转化是对BIK反应的早期步骤

定量分析显示，Ad-HA-BIK感染后12小时，约40%的细胞出现线粒体断裂，而不到15%的细胞释放细胞色素c（c）到细胞溶质(图2D). 虽然许多线粒体碎片化的细胞没有细胞色素c（c）释放(图2B)，所有显示细胞色素的细胞c（c）释放到胞浆中的线粒体也破碎了(补充图2). 这表明线粒体对BIK反应的断裂先于细胞色素c（c）释放。

线粒体分裂需要一种称为DRP1的动力相关蛋白的活性，其催化GTPase活性位点的突变被证明可以阻止线粒体分裂和细胞色素的释放c（c）在细胞凋亡期间(弗兰克等, 2001；布雷肯里奇等，2003年3月). 因此，我们使用显性-阴性DRP1突变体（CFP-DRP1（K38E）；布雷肯里奇等，2003年3月)结合活细胞成像，进一步评估Ad HA-BIK感染H1299细胞12小时后DRP1调节线粒体变化的性质。通过表达选择性靶向线粒体基质的pOCT-YFP融合蛋白，实现活细胞线粒体成像。作为对BIK表达的反应，线粒体表现出明显的碎片化(图3A)值得注意的是，这些破碎的线粒体经历了多次拉伸和收缩循环。这些动态在以下面板中很明显图3A，它以30帧/分钟的速度拍摄了125帧照片中的多个片段的图像，可以在补充视频1相反，在CFP-DRP1（K38E）存在下感染Ad-HA-BIK的细胞显示融合线粒体形态(图3B) (斯米尔诺娃等, 1998；尹等, 2001)仅BIK未观察到线粒体的动态拉伸和收缩(图3B，底部面板；另请参见补充视频2).

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BIK诱导依赖DRP1的线粒体分裂。在zVAD-fmk存在和不存在的情况下，用Ad-HA-BIK感染H1299细胞12小时(A类)或存在(B类)CFP-DRP1（K38E）。使用pOCT-YFP观察线粒体。每隔2s从（A）和（B）中呈现的细胞的框状区域获取图像，以可视化线粒体片段的动力学（见视频1（面板A）和视频2（面板B））。底部图像表示从这些电影中拍摄的静态图像，数字表示帧数。显示了具有代表性的图像。

BIK诱导的DRP1向线粒体的募集先于ΔΨ和碎片化

如所示图4和补充视频3，在用Ad-HA-BIK感染COS7细胞后早期，主要的胞质DRP1-YFP被募集到用pOCT-CFP标记的线粒体中。招募后线粒体形态的第一个显著变化是，非碎片细胞器开始表现出形状上的动态变化，在管状结构和球状结构之间交替(图4，上面板；补充视频3). 这些形态学变化相对于Ad HA-BIK感染后后期在片段细胞器中观察到的快速拉伸和收缩更为缓慢（相比之下补充视频1和三). DRP1-YFP仍然非常稳定地被招募到这些结构中。添加电化学敏感性染料MitofluorRed589表明，DRP1-YFP的募集明显先于Ad HA-BIK感染后的电位损失，并且DRP1在ΔΨ损失后仍然与线粒体相关(图4，底部面板），后期出现碎片。

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DRP1向线粒体的募集先于形态变化和电化学电位的丧失。在感染Ad BIK 8小时之前，用pOCT-CFP和DRP1-YFP共同转染COS-7细胞。在成像之前，总共加入50 nM的电化学电位敏感染料MitofluorRed589，并在37°C下平衡30分钟。对pOCT-CFP（线粒体，叠加显示为红色）、MitofluorRed589（在ΔΨ存在的情况下，叠加显示线粒体为紫色）和DRP1-YFP（叠加显示为绿色）进行了三个通道的视频拍摄。从序列中提取图像，与添加Ad BIK相关的时间戳以小时：分钟显示。线粒体从紫色到红色的转变表明ΔΨ的丢失。箭头表示线粒体肿胀的区域（上面板），并指向线粒体相关DRP1-YFP的点状突起（下面板）。使用Adobe Photoshop反转黑白图像。

BIK诱导DRP1调节的线粒体嵴重塑

尽管DRP1介导的线粒体转化是细胞色素所必需的c（c）在细胞凋亡过程中释放，其原因尚不清楚。然而，众所周知，一些凋亡刺激导致嵴连接断裂，导致嵴开放和膜间间隙扩张(斯科拉诺等, 2002；阿高等, 2003；基姆等, 2004). As嵴是典型的紧密管状结构，捕获大部分细胞色素c（c）膜间间隙褶皱内的分子，嵴的开放从而增加了细胞色素的可及性c（c）到外膜中的通道(斯科拉诺等, 2002).

为了检测Ad-HA-BIK感染12 h后完整细胞中线粒体嵴的状态，我们使用透射电镜并测量我中央嵴c（c）横截面的d日不同实验条件下的距离（ICDs）。在对照COS-7细胞中，嵴通常是线粒体内的致密小管(图5A; 未经处理），模拟感染细胞中大多数（>80%）ICD的测量值在20至75 nm之间(图5C). BIK的表达导致嵴的深度开放（在图4A; 广告BIK）。在这些细胞中，80%以上的ICD在75至250 nm之间(图5C). 用抗YFP-pOCT抗体对这些线粒体进行高分辨率免疫金染色，发现金颗粒仅与电子致密基质室相关(图5A; 基质YFP-gold），证实扩大的电子透明空间并不代表基质膨胀。重要的是，CFP-DRP1（K38E）强烈抑制BIK诱导的嵴结构变化(图5A; Ad BIK/Ad DRP1（K38E）），其中90%以上的ICD在20至50 nm之间(图5C). 值得注意的是，钙的抑制剂2+线粒体摄取Ru360也抑制BIK诱导的嵴开放(图5A; 广告BIK+Ru360）。与对照组一样，ICD主要小于100 nm(图5C)与BIK、Ad BIK（L61G）的BH3失活突变细胞感染后的记录相似(图5A和C). 与研究一致在体外(斯科拉诺等, 2002)，一种内膜通透性转换孔的拮抗剂，环孢霉素A，也具有抑制作用(图5A和C). 因此，BIK诱导的嵴形态变化依赖于BIK的BH3结构域Ca2+传递到线粒体、PTP和功能性DRP1。

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BIK诱导线粒体嵴依赖DRP1的重塑。(A类)用pOCT-CFP转染COS-7细胞，固定并制备用10 nm金标二级抗体修饰的抗CFP抗体进行免疫标记，以从形态学上区分基质室和电子半透明膜间隙（左上角）。其余的面板显示了没有免疫标记的COS-7细胞的代表性图像，这些细胞在存在zVAD-fmk的情况下使用模拟腺病毒、Ad HA-BIK（L61G）或Ad HA-BIK在存在或不存在Ad DRP1（K38E）或20μM Ru360或2μM环孢菌素A（CsA，在感染后2小时添加）治疗12小时。固定细胞并用电子显微镜检查线粒体形态。(B类)用Ad-HA-BIK感染12小时的细胞中线粒体的高放大倍数。箭头指示其中液泡化的膜间间隙可直接进入外膜的部分。(C类)以频率分布表示的晶内横截面距离的量化。使用AMT集成软件获取数据。(D类)BIK促进细胞色素释放c（c）通过洋地黄素。将H1299细胞模拟感染（对照）或在zVAD-fmk存在下用Ad-HA-BIK感染10 h，然后分离线粒体并用60μg/ml洋地黄素在37℃孵育5 min。细胞色素的含量c（c）如材料和方法所述，通过免疫印迹法测定线粒体释放。显示了三次独立测定±标准偏差的平均值。

对Ad HA-BIK感染的COS-7细胞线粒体的EM横截面进行广泛检查，也得到大量图像，证明在Ad BIK感染的细胞中，嵴和膜间间隙之间原本狭窄的管状连接处ICD增加(图5B). 这些数据表明，液泡化的膜间间隙可以直接接触到外膜。此外，如果这些连接在BIK治疗后确实扩大，则可以预测BIK会导致细胞色素的动员和释放增强c（c）外膜物理破裂后储存。为了评估这种可能性，从对照或BIK刺激的细胞中分离线粒体，并检查其对洋地黄素介导的细胞色素释放的易感性c（c）用固定浓度的线粒体蛋白进行洋地黄素的滴定，以选择一种浓度的洗涤剂，该洗涤剂可渗透外膜（OM），而不会导致OM TOM20的显著释放，这表明OM本身已被去除。在多个独立实验中，来自未刺激细胞的线粒体释放出约12%的细胞色素总量c（c）对洋地黄素的反应(图5D)与估计的大约10-15%的细胞色素一致c（c）线粒体的含量位于膜间隙(Bernardi和Azzone，1981年；斯科拉诺等, 2002). 另一方面，从BIK处理的细胞中分离出的线粒体释放出30%的细胞色素c（c）在相同条件下(图5D)与部分分离的线粒体具有细胞色素相一致c（c）可能从内膜动员和释放（与含有碎片线粒体但没有细胞色素的部分细胞相一致c（c）释放，请参见图2). 此外，这可能低估了可释放的细胞色素c（c），因为在这些实验中没有使用高盐缓冲液。这些结果表明，对BIK表达的早期反应是细胞色素的动员c（c）储存在线粒体内，与BIK对嵴开放的作用一致。

BIK和NOXA合作从线粒体释放细胞色素c

依赖DRP1的线粒体嵴开放和细胞色素动员c（c）这里描述的可以解释凋亡过程中DRP1介导事件的需要。例如，DRP1调节细胞色素的动员c（c）完整细胞对BIK的反应池可能使这些线粒体对BAX更敏感，BAK依赖性释放细胞色素c（c）由细胞器上的第二个促凋亡刺激所诱导。这在直接线粒体刺激是次优的并且本身不会导致嵴快速重塑和BAX、BAK激活的情况下可能特别相关。为此，我们检测了NOXA，这是另一种BH3-only蛋白，与BIK一样，是由p53过度表达诱导的，并且已经证明其定位于线粒体(奥达等, 2000). 与tBID不同，NOXA传递到线粒体在体外不会导致细胞色素的强烈释放c（c）(程等, 2001). 生成了表达wt人NOXA或突变株的腺运动体，其中BH3结构域29位的保守亮氨酸被改变为丙氨酸NOXA（L29A）。Ad-NOXA感染H1299细胞48小时最终导致caspase激活(补充图3A)，但在10–12小时的早期时间点没有观察到这种情况(图6A). 此外，人类NOXA表达12小时不会引起线粒体分裂(补充图3B)并且没有导致ER Ca释放2+商店(补充图3C). 相反，在用Ad-HA-BIK和Ad-NOXA感染H1299细胞10小时后，两种细胞色素都显著增加c（c）释放到胞浆和半胱氨酸天冬氨酸酶（DEVDase）激活(图6A). 另一方面，单独感染两倍于这两种病毒的病毒并没有导致caspase活性的类似增加(图6B). 因此，BIK和NOXA可以协同诱导高效的细胞色素c（c）NOXA的存在并没有进一步增加BIK诱导的ER-Ca2+释放或线粒体裂变(补充图3). BIK和NOXA之间的合作取决于两种蛋白质中是否存在完整的BH3结构域，因为BH3突变体BIK（L61G）或NOXA（L29A）的细胞色素受损c（c）与Wt伙伴共表达时的释放和半胱天冬酶激活(图6A). 相反，当Ad NOXA与Ad tBID共表达10小时时，没有观察到合作，但观察到caspases的强烈激活(图6C). BID是一种仅针对线粒体的BH3有效蛋白质，至少在体外，可以促进细胞色素内部储存的动员c（c）通过激活BAX，BAK从细胞器中释放(世界环境学会等, 2001；斯科拉诺等, 2002).

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BIK和NOXA可以协同诱导细胞色素c（c）线粒体释放(A类)细胞色素c（c）BIK和Noxa的释放和半胱天冬酶激活。在存在zVAD-fmk的情况下，用Ad HA-BIK和Ad Noxa或其各自的BH3突变体（每种病毒100 pfu/cell）感染H1299细胞10 h。然后固定细胞并用细胞色素抗体染色c（c）和TOM20。对线粒体断裂的细胞进行细胞色素评分c（c）释放。或者，使用不含zVAD-fmk的细胞中的25μg裂解物，使用荧光底物DEVD-AMC测量caspase-3样活性。显示了至少三个±s.d.独立实验的结果。(B类)H1299细胞感染100或200 pfu/细胞的指定Ad载体，并按照（A）中的方法进行处理，以测量caspase-3样活性。(C类)用Ad-Noxa和Ad-tBID处理细胞，caspase-3样活性如（A）所示。(D类)H1299细胞按照（A）中的方法进行处理和固定，然后用N末端特异性BAX抗体对其进行染色。对活化BAX阳性细胞进行评分。显示了三次独立测定±标准偏差的结果。

BAX刺激导致蛋白质N末端的表位暴露，该表位可以通过使用表位特异性抗体的免疫荧光检测(德萨热等, 1999；王等, 2003). 将单独或联合感染Ad-HA-BIK和Ad-NOXA 10 h的细胞固定，用N-末端特异性抗体染色，并对BAX阳性细胞进行评分。与细胞色素一样c（c）与单独蛋白相比，BIK和NOXA对BAX活化的影响更大(图6D). 因此，BIK本身可以快速启动DRP1调节的嵴重塑和嵴内细胞色素的动员c（c）但除此之外，BIK似乎与NOXA合作，以某种方式增强BAX的激活。综合起来，这为BIK和NOXA刺激动员细胞色素快速排出的能力提供了解释c（c）到细胞质。

DRP1参与BIK和NOXA释放细胞色素c

如所示图7A，显性负性CFP-DRP1（K38E）能够抑制细胞色素c（c）BIK和NOXA联合作用诱导释放到细胞液中，而CFP和CFP-DRP1没有，表明细胞色素c（c）对两种BH3-only蛋白的释放依赖于功能性DRP1酶。相反，与N-末端暴露相关的BAX构象变化不受CFP-DRP1（K38E）的影响(图7B). 这与之前的结果一致(卡博夫斯基等, 2002)与DRP1的RNAi敲低并不能阻止BAX向线粒体的转位这一发现相一致(李等, 2004)，表明BAX活化不受催化活性DRP1的调节。然而，不能排除DRP1在细胞色素中起一定作用c（c）通过外层膜运输。

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DRP1对BIK和Noxa促凋亡活性的影响。(A类)CFP-DRP1（K38E）阻止细胞色素的诱导c（c）由BIK和Noxa发布。用CFP、CFP-DRP1或CFP-DRP2（K38E）转染H1299细胞，并感染Ad HA-BIK和Ad Noxa。感染后10 h固定细胞并进行细胞色素染色c（c）结果表示为CFP阳性细胞与细胞溶质细胞色素的百分比c（c）.显示了三个独立实验±s.d.的结果。(B类)CFP-DRP1（K38E）不阻止BAX激活。细胞按（A）处理，用N-末端特异性BAX抗体染色，并对活化BAX的存在进行评分。显示了三个独立实验±s.d.的结果。有关说明，请参阅文本。

讨论

DRP-1介导的线粒体在凋亡过程中的转化是细胞色素的必要条件c（c）释放到完整细胞的胞浆中(弗兰克等, 2001). 钙2+来自内质网的信号，特别是线粒体对其的摄取，为DRP1早期补充到线粒体表面提供了一个信号(布雷肯里奇等，2003年3月；Karbowski和Youle，2003年). 利用显性负性CFP-DRP1（K38E），我们在这里表明，这些DRP1介导的、由BIK引起的线粒体结构的动态变化实际上包括嵴重塑。这种依赖DRP1的重塑需要Ca的传递2+线粒体和功能性PTP。事实证明，在细胞凋亡过程中，嵴结构的开放是提供细胞色素流动池的必要条件c（c）细胞色素的BAX/BAK依赖性释放c（c）到细胞溶质(斯科拉诺等, 2002)BIK的表达确实与细胞色素线粒体存储的动员有关c（c）有趣的是，响应BIK和NOXA的联合作用而发生的BAX的激活构象变化不受DRP1（K38E）的影响（另见卡博夫斯基等, 2002)这与最近的一份报告相一致，该报告显示RNAi敲低DRP1并不干扰BAX向线粒体的凋亡募集(李等, 2004).

然而，作用于线粒体表面的DRP1如何影响嵴的重塑尚不清楚。据报道，其他动力蛋白，包括动力蛋白1和2，也表现出独立于其在膜断裂中的作用的活性。这些包括影响脂质曲率的蛋白质的补充(施密特等, 1999；法沙等, 2001；彼得等, 2004)，调节膜上的肌动蛋白动力学(Lee和De Camilli，2002年；奥尔思等, 2002；Orth和McNiven，2003年)，并启动细胞内信号级联(鱼等, 2000；施伦克等, 2004). 就膜重塑活性而言，最近发现，与dynamin-1相互作用的脂质修饰蛋白内亲素同源的内亲素B影响线粒体形态，RNAi降低蛋白质水平导致线粒体外膜延长小管，管内显然没有任何基质材料(卡博夫斯基等, 2004). 与DRP1一样，在用staurosporine或放线菌素D处理细胞后，刺激了大量胞内嗜内素B向线粒体的移位(卡博夫斯基等, 2004). 内白细胞素B或其他调节因子是否与DRP1一起发挥作用，并在外膜上引起动态变化，从而影响嵴的重塑，尚待确定。此外，线粒体细胞质表面的DRP1与膜间GTPase、Opa1之间可能存在间接联系，Opa1是另一种与线粒体形态调控有关的动力蛋白相关蛋白(关等, 1993；德莱特等, 2000；米萨卡等, 2002；奥利康等, 2002；佐藤等, 2003). 干扰OPA1表达导致线粒体结构改变，如肿胀和拉伸(格里帕里克等, 2004)以及嵴重组(奥利康等, 2003；格里帕里克等, 2004)，这与在细胞凋亡过程中观察到的情况类似。同样，对OPA1的干扰确实可以增强凋亡细胞色素c（c）从细胞器中释放(奥利康等, 2003；李等, 2004).

发现BIK是因为它与抗凋亡BCL-2蛋白的细胞和病毒同源物相互作用(博伊德等, 1995；汉族等, 1996)与其他促凋亡结合伙伴一样，其活性严格依赖于BIK和BCL-2的比率(马泰等, 2002). 虽然BCL-2家族蛋白对线粒体完整性的调节受到了广泛关注，但现在很明显，这种调节也延伸到了内质网(法拉利等, 2002；Demaurex和Distelhorst，2003年；Germain和Shore，2003年；奥雷尼乌斯等, 2003)与ER在支持线粒体死亡程序中的作用一致。这至少部分是通过BCL-2家族蛋白对ER-Ca的影响实现的2+商店。除了在线粒体中的位置外，BAX和BAK也位于内质网。在线粒体中，促凋亡BAX和BAK的激活与具有通道性质的低聚物结构的形成有关(世界环境学会等, 2000)是细胞色素所必需的c（c）释放到胞浆(程等, 2001；世界环境学会等, 2001). 相反，最近的证据表明，内质网膜上的BAX和BAK有助于调节内质网钙(斯科拉诺等, 2003). 此外，当过量的ER-限制性BAK（BAKb5）在缺乏过量BCL-2的情况下被输送到BAX/BAK双重缺陷细胞中时，它会形成低聚物并导致Ca的释放2+来自细胞器(宗等, 2003). 因此，BIK在ER膜上激活BAX/BAK是解释ER-Ca的一种可能性2+BIK引起的释放。

总之，我们的结果表明BIK刺激Ca的模型2+从ER和DRP1募集释放到线粒体，进而以依赖钙传递的方式诱导嵴重塑2+由此产生的依赖DRP1的嵴开放可动员细胞色素c（c）储存细胞器碎片后的细胞色素c（c）这些碎片可能会经历动态拉伸-收缩循环，从而有助于释放。第二个事件独立于DRP1催化活性，是由BIK和另一种靶向线粒体的BH3-唯一蛋白质（如NOXA）的结合引起的，导致BAX的构象变化和细胞色素的途径c（c）出口。嵴重塑、细胞器分裂和BAX活化的结合导致细胞色素的强劲释放c（c）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活。ER BIK（可能是一种ER途径）对BAX激活的作用机制目前尚不清楚，但有趣的是，BAX向线粒体的补充受到另一个位于外膜的线粒体分裂调节因子hFis1的影响(李等, 2004). 此外，最近在酵母中的发现表明，Fis1p具有意料之外的前生存功能，可以被BCL-2蛋白取代(范江等, 2004). 因此，分裂-融合机制可能参与线粒体凋亡的多个步骤。在本研究中，我们揭示了DRP1在调节嵴重塑中的新作用，并描述了Ca2+-通过该途径介导的ER信号增强细胞色素c（c）线粒体释放。

材料和方法

细胞培养和腺病毒载体感染

H1299肺癌细胞在添加10%热灭活胎牛血清和100μg/ml链霉素和青霉素的α-最小必需培养基中培养。为了产生HA-BCL-2b5细胞系，用编码HA标记的BCL-2突变体的pcDNA 3载体转染H1299细胞，其中TM结构域（氨基酸215–239）被兔细胞色素b的TM结构域取代5（氨基酸107–134）。筛选G418-耐药菌落是否存在HA-BCL-2b5。如前所述，用腺病毒载体感染细胞(日尔曼等, 2002)使用100个噬菌体形成单位（pfu）/病毒细胞。所有感染均在50μM zVAD-fmk存在下进行，caspase活性测量除外。表达人Noxa的腺病毒载体(奥达等, 2000)和突变人Noxa，其中BH3结构域中29位的保守亮氨酸突变为丙氨酸(马泰等, 2002). 使用Lipofectamine plus gent™（Gibco-BRL）和之前描述的CFP、DRP1和DRP1（K38E）构建物进行转染(布雷肯里奇等，2003年3月). 如前所述，进行Caspase-3活性论文(布雷肯里奇等，2003年3月).

抗体、免疫印迹和共焦免疫荧光

使用了以下抗体：山羊抗BIK（Santa-Cruz，CA）、仓鼠抗BCL-2（Biomol）、兔抗BAX N末端表位（Upstate）、小鼠抗细胞色素c（c）（催乳素）、小鼠抗凝集素（ICN）和兔抗TOM20(日尔曼等, 2002). 对于免疫印迹分析，将指定数量的蛋白质进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维素膜上，并用特定抗体进行印迹。印迹与辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育，并通过增强化学发光观察（Perkin-Elmer生命科学）。对于免疫荧光，细胞生长在盖玻片上，并按照图示进行处理。然后使用AlexaFluor 488和594二级抗体固定细胞并通过双标记免疫荧光分析，并使用蔡司510共焦显微镜进行可视化。图像被捕获并用附带的软件覆盖。

洋地黄治疗

在50μM zVAD-fmk存在下用Ad-HA-BIK处理H1299细胞10小时。如前所述分离线粒体(日尔曼等, 2002)并重新悬浮在HIM缓冲液中（200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、10 mM HEPES、pH 7.4、1 mM EGTA）。将25μl HIM中的线粒体（12.5μg蛋白质）与60μg/ml洋地黄素在37°C下孵育5分钟，然后重新分离线粒体并分析其是否存在细胞色素c（c）Western blot检测TOM20。

电子显微镜

用表达DRP1（K38E）CFP的腺病毒感染一个10 cm2培养皿中的Cos7细胞为100 pfu/细胞。为了检查感染效率，将盖玻片放入培养皿中，24小时后，通过在434 nm处激发CFP确认DRP1（K38E）CFP的表达，并在与50 nm MitofluorRed589（分子探针）孵育后观察相互连接的线粒体的范围（数据未显示）。已确定～95%的细胞成功感染了Ad DRP1（K38E）CFP病毒。然后，我们在zVAD-fmk存在的情况下用Ad HA-BIK（如上所述）重新感染这些细胞，以比较直接感染Ad HA-BIK、Ad HA/BIK+Ru360、Ad:BikL61G或Ad rtTA（对照）的细胞，所有这些细胞都存在zVAD-fmk。12小时后，对细胞进行胰蛋白酶化，在PBS中清洗，在1.6%戊二醛中固定，并在3000℃下离心克将细胞颗粒嵌入SPURR树脂（魁北克省Marivac）中15分钟，用Leica Ultracut E超微切片机切割薄片，并用柠檬酸铅和醋酸铀酰复染。使用JEOL 1230 TEM在60 kV电压下拍摄数字图像，采用2×2 K底装CCD数字相机（日本滨松）和AMT软件。使用AMT集成软件收集ICD的随机测量值，并将其记录在excel电子表格中。采取的晶间总横截面测量为：模拟病毒，n个=119; 广告BIK，n个=423; 广告BIK+Ru360，n个=381；Ad BIK+Ad DRP（K38E），n个=161; Ad BIK（L61G），n个=496。数据被分类为25nm的间隔范围，并绘制为分布曲线。

钙2+测量

ER Ca的测量2+按照前面的描述进行存储(梅里等, 1996；布雷肯里奇等，2003年3月). 简而言之，2×106细胞在200μl Ca中重新悬浮2+-自由缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，143 mM NaCl，6 mM KCl，1 mM MgSO4，0.1%葡萄糖，0.1%BSA，250μM硫吡唑酮），并在37°C下，在0.04%普鲁尼酸存在下加载3μM Fura-2（分子探针）30分钟。然后将细胞清洗一次并重新悬浮在Ca中2+-释放缓冲区。[加利福尼亚州2+]使用LS50B珀金-埃尔默发光分光光度计在510 nm发射波长下以340/380 nm激发比测定。ER钙2+确定为[Ca的差值2+]在没有和存在2μM thapsigargin的情况下。

在线补充材料

对于补充视频中的实时成像，将盖玻片安装在20 mM HEPES缓冲介质（pH 7.4）的铝室中，并使用Olympus IX70倒置显微镜、Polychrome IV单色仪和TillPhotonics（GmBH）的IMAGO CCD相机拍摄实时图像。细胞保持在37°C，每2秒（视频1和2）或4秒（视频3）拍摄100或200帧图像。CFP和YFP结构的暴露时间在200到400 ms之间。

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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视频1

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视频2

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视频3

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补充图和视频标题

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致谢

我们感谢Peter Ripstein和Rodolfo Zunino提供的出色技术帮助，以及Ruth Slack提供的广告DRP1（K38E）。MG和JPM是加拿大卫生研究院学生奖学金的获得者。这项工作得到了加拿大卫生研究院（GCS和HMM）和加拿大国家癌症研究所（GCS）的运营资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团