Persistent Infection of Epstein-Barr Virus-Positive B Lymphocytes by Human Herpesvirus 8

Stefanie Kliche; Elisabeth Kremmer; Wolfgang Hammerschmidt; Ulrich Koszinowski; Jürgen Haas

doi:10.1128/jvi.72.10.8143-8149.1998

《维罗尔杂志》。1998年10月；72(10): 8143–8149.

数字对象标识：10.1128/jvi.72.10.8143-8149.1998年

预防性维修识别码：项目经理110154

PMID：9733855

人类疱疹病毒8持续感染EB病毒阳性B淋巴细胞

斯蒂芬妮·克里奇,¹ 伊丽莎白·克雷默,² 沃尔夫冈·哈默施密特,^三乌尔里希·科斯齐诺夫斯基,¹和尤尔根·哈斯^1,^*

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在卡波西肉瘤（KS）患者中，人类疱疹病毒8型（HHV-8）总是可以在KS肿瘤组织中检测到，在较低频率下，在前列腺组织和外周血B淋巴细胞中检测到。虽然大多数KS纺锤形细胞潜伏感染HHV-8，但具有溶血感染特征的线性HDV-8基因组主要存在于KS患者的外周血细胞中。在本研究中，我们发现HHV-8在体外可在EB病毒（EBV）存在下稳定感染B淋巴细胞。我们能够产生永生HHV-8⁺/电子商务车辆⁺EBV外周血单个核细胞衍生的淋巴母细胞系⁻和EBV⁺捐赠者。在HHV-8中⁺/电子商务车辆⁺具有活化B淋巴细胞（CD19）表型的LCL⁺，表面免疫球蛋白M，CD23⁺，CD30⁺，CD80⁺)HHV-8在25代以上（培养9个月以上）仍存在。潜伏病毒转录物和蛋白质存在于未刺激的HHV-8中⁺/电子血压计⁺LCL。佛波酯诱导后n个-丁酸，HHV-8⁺/电子商务车辆⁺LCL表达裂解型HHV-8转录物和蛋白质。此外，HHV-8可以从HHV-8⁺/电子商务车辆⁺LCL至新鲜PBMC。

最近在卡波西肉瘤（KS）中检测到人类疱疹病毒8型（HHV-8）(11,18,30)和B细胞淋巴瘤(5,39,45)以及其他恶性肿瘤和健康人。HHV-8是一种2型γ-疱疹病毒（属狂犬病病毒)序列与EBV、HVS、马疱疹病毒2、鼠疱疹病毒68和最近发现的导致猕猴腹膜后纤维瘤病的两种疱疹病毒相似(34,40,41,48). 虽然血清流行率数据表明HHV-8更为广泛且不局限于KS，但HHV-8被怀疑具有与EBV和HVS类似的转化活性，这会在其自然宿主和实验动物中引起肿瘤(2,15,16,19,24,27,44). 在从KS组织建立的大多数细胞系中，HHV-8在连续繁殖过程中丢失。然而，一些来自原发性渗出性淋巴瘤（PEL）和KS的细胞系被潜伏的HHV-8稳定感染，并且可以被诱导进行裂解病毒复制和病毒生成(6,38,42). 到目前为止，HHV-8在原代细胞或培养细胞系上的连续传播还不可能。在体外，HHV-8可以转移到多个细胞系和原代细胞，包括293(13,37)和B淋巴细胞(25); 然而，这并没有导致稳定的病毒感染。在体内，在KS病变的活检标本中检测到HHV-8(11,18,30)但也存在于前列腺组织中(28)，精液(28)，唾液(47)，外周血B淋巴细胞(1,10)和淋巴组织(4)KS患者。人类B淋巴细胞也可以感染EBV，EBV是人类致病性HHV-8的近亲。EBV能够在体外将B细胞转化为永久性淋巴母细胞系（LCL）(20). EBV诱导的B细胞转化导致至少11个潜在EBV基因（EBNAs、LMPs和EBERs）的顺序表达、进入细胞周期和持续细胞增殖、RNA合成和活化表达（例如转铁蛋白受体、主要组织相容性复合体II类、CD21、CD23、CD39、CD40和CD44）和粘附（例如ICAM1、LFA1和LFA3）分子，导致类似于刺激B细胞的表型。迄今为止，还没有实验证据表明感染性HHV-8颗粒能够在体外稳定感染和转化原代细胞或细胞系。在这项研究中，我们提供证据表明，HHV-8持续感染外周血B淋巴细胞，并且可以建立持续感染HHV-8的LCL。

材料和方法

献血者。

按照制造商的规定，通过Ficoll-Hypaque不连续梯度离心法（Lymphoflot；Biotest AG，Dreiech，Germany）从四名EBV阴性和EBV阳性健康人的EDTA处理血液中分离出外周血单个核细胞（PBMC）。献血者并非来自HHV-8风险组。使用以下检测病毒衣壳抗原（VCA）、免疫球蛋白G（IgG）（Fresenius，Bad Homburg，德国）和IgM（Viramed，Martinsried，德国）以及爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原（EBNA）IgG抗体（Biotest，Dreieich，德国）的商业试剂盒进行EBV血清学检测。EBV阳性个体的VCA IgG和EBNA IgG抗体呈阳性，但VCA Ig M抗体呈阴性。EBV阴性个体的VCA IgG、VCA Ig M和EBNA IgG均为阴性。

细胞培养和EBV和/或HHV-8感染。

BCBL-1型(38)，BC-1(35)在补充了20%热灭活胎牛血清（FCS；Life Technologies）、每毫升100 IU青霉素（Life Technols）、每ml 100 mg链霉素（Life-Technologies）和2 mM的RPMI（苏格兰佩斯利生命科技公司）中培养、B95-8（CRL1612）、Raji（CCL 86）和LCL我-谷氨酰胺（生命技术）和0.05 mM 2-巯基乙醇（密苏里州圣路易斯市西格玛）。对于低密度细胞，2-巯基乙醇被20 mM岩藻红二磺酸（Sigma）、50μmα-硫代甘油（Sigma-）和1 mM丙酮酸钠（Life Technologies）取代。为了诱导裂解病毒蛋白的表达，用每毫升20 ng佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（TPA；Sigma）和3 mM钠处理细胞n个-丁酸（Sigma）24小时。

BCBL-1、BC-1、B95-8或Raji细胞的上清液以非常高的密度（5×10⁵每毫升）感染PBMC。上清液通过0.4μm过滤器过滤，并用96个平板中的细胞培养基连续稀释，PBMC添加到10⁴每个孔的细胞数。对于连续病毒传代，以类似方式生成ABEH-1、ABE-1、GMEH-1和GME-1细胞的上清液，并将其添加到10⁴EBV的PBMC⁺捐赠者。

细胞DNA的分离和病毒DNA的PCR检测。

从10⁶细胞(26). 用于扩增HHV-8 DNA的引物位于K12开放阅读框两侧（K12for，5′cggaattcatggatagaggttaacg 3′；K12rev，5′cgctcgagtcagtgcgcccgttgc 3′）。预期扩增产物的长度为196 bp。用于从BALF5开放阅读框中扩增EBV DNA的引物为Epolfor（5′aggtgggcgcagggc 3′）和Epolrev（5′Agcaccagctagccgctg 3′），扩增产物大小为343bp。每个反应混合物包含500 ng细胞DNA、100 ng每个引物和5 U塔克聚合酶（Perkin-Elmer Cetus，Branchburg，N.J.）。将混合物在DNA热循环器2400（Perkin-Elmer）中循环30次扩增循环（96°C 1分钟；60°C 1 min；72°C 1 min.）。在2%琼脂糖-40 mM醋酸三钠-1 mM乙二胺四乙酸二钠上分析1/1的PCR产物，并在溴化乙锭染色后进行可视化。作为PCR阴性和阳性对照，EBV聚合酶和K12的水和质粒DNA克隆到pBluescript KS II⁺分别使用了。

RNA和RT-PCR的制备。

RNA从10⁶带有制造商指定的三试剂（俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心）的细胞。10μl水和1μg寡糖（dT）中总RNA的5μg部分₁₈将底漆加热至70°C 10分钟，然后在冰上冷却至4°C。10μl体积的反应混合物（100 mM Tris-HCl[pH 8.3]，6 mM MgCl₂添加150 mM KCl，1 mM每个脱氧核苷三磷酸（德国曼海姆Boehringer），30 U核糖核酸酶抑制剂[MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛]，200 U Superscript[Life Technologies]），混合物在37°C下培养1.5小时，并加热至67°C 15分钟。在含有10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、1.5 mM MgCl的100μl PCR混合物中，用基因特异性引物扩增2μl体积的反转录反应混合物₂，每种三磷酸脱氧核苷0.2mM，每种引物100ng，和5U塔克聚合酶。混合物在DNA热循环仪2400中循环30次扩增循环（96°C，1分钟；60°C，1分钟；72°C，1分钟）。在1或2%琼脂糖-40 mM醋酸三钠-1 mM乙二胺四乙酸二钠上分析1/1的PCR混合物，并在溴化乙锭染色后进行可视化。

本研究中使用的寡核苷酸引物分别为K12for、K12rev、VP23for（5′cgcgggattagaatcactcgagagagtata 3′）、VP23rev（5′CGcgggaattcttagtggaatacagagga 3′），Actfor（5′Cgcgaatcccccagtgatacacagatgg 3′）和Actrev。作为这些实验的阴性对照，使用1μg总RNA进行逆转录PCR（RT-PCR）。作为阴性和阳性PCR对照，分别使用克隆到pBluescript KS II+中的VP23、肌动蛋白和K12全长cDNA的水和质粒DNA。

流式细胞术。

分析LCL、BC-1和BCBL-1细胞（5×10）的表面表型⁵)在磷酸盐平衡盐（PBS）和FACS缓冲液（含2.5%FCS和0.02%叠氮化钠的PBS）中洗涤，并直接用抗CD3-藻红蛋白（PE）、抗CD14-PE、抗CD16-PE、抗CD19-PE、反CD56-PE（德国汉堡Pharmingen）、抗IgG-异硫氰酸荧光素（FITC）和抗IgM-FITC（Sigma）染色。每个分析中都包括同位素对照。对于间接染色，首先用小鼠抗CD19、抗CD20、抗CD23或抗CD30（德国汉堡Dako Diagnostika）培养细胞，然后用山羊抗小鼠IgG-FITC（德国汉堡Dianova）培养细胞。作为阴性对照，每次检测只使用山羊抗鼠IgG-FITC。细胞被清洗三次，并用Cellquest软件在FACScan上进行分析（加州圣何塞Becton Dickinson）。

免疫荧光和共焦显微镜。

TPA刺激24小时后n个-如上所述，将细胞在聚乳酸上干燥-我-赖氨酸涂层盖玻片（Marienfeld，Bad Mergentheim，德国），用丙酮固定，用PBS中5%的FCS封闭1小时。用稀释在PBS中的5%FCS中的单克隆抗体（MAb）vp4G2（抗HHV-8 VP23）、kap5C4（抗-HHV-8 K12）或817（抗EBV VCA）（Chemicon，Temecula，California）孵育1小时后，将细胞与Cy3-结合的山羊抗鼠IgG或山羊抗小鼠IgG（Sigma）在PBS中5%FCS中稀释1:200培养2h。MAbs vp4G2(第23页)和kap5C4(第21页)如其他地方所述生成。细胞在TNT共聚焦显微镜DMIRB（德国本谢姆莱卡）下清洗和检查。

结果

PBMC的永生化和EBV和HHV-8的持续性病毒感染。

BCBL-1（HHV-8）上清液⁺PEL细胞系），BC-1（HHV-8⁺电子商务车辆⁺PEL细胞系），B95-8（EBV⁺绒猴细胞系）和Raji（EBV基因组缺失导致无法释放病毒的人类EBV转化细胞系）细胞被用于从四种EBV感染PBMC⁻和四辆EBV⁺个人。用Raji细胞的对照上清液或上清液培养PBMC并没有导致LCL的生长，这与EBV状态无关，表明EBV存在于PBMC中⁺在所使用的条件下，个体不足以转化B细胞（表（表1）。1). 用B95-8上清液孵育导致每个个体PBMC中LCL的生长，同样与EBV状态无关。HHV-8上清液⁺如果PBMC来源于EBV，BCBL-1细胞会导致LCL的生长⁺但不是来自EBV⁻个人。有趣的是，HHV-8的上清液⁺和EBV⁺BC-1细胞导致来自两种EBV的PBMC永生化⁻和EBV⁺个人。自BCBL-1细胞（HHV-8）的上清液⁺电子商务车辆⁻)EBV永生PBMC⁺但不是EBV⁻我们假设HHV-8提供了一种辅助因子，可以促进EBV转化的B细胞永生化，或者如果存在EBV或EBV衍生的辅助因子，则其本身具有转化活性。由于BCBL-1细胞上清液不能促进EBV衍生B淋巴细胞的永生化⁻在我们使用的分析系统中，捐赠者到目前为止还没有关于后者的线索。

表1

HHV-8的建立⁺电子商务车辆⁺EBV PBMC的LCL⁻和EBV⁺ 捐助者

上清液	LCL增长^一PBMC孵育后：
	电子商务车辆⁺捐赠者：				电子商务车辆⁻捐赠者：
	A类	B类	C类	D类	E类	F类	G公司	我
控制介质	—^b条	—	—	—	—	—	—	—
拉吉	—	—	—	—	—	—	—	—
B95-8号	14	17	15	15.7	26	19	22.5	24.6
BCBL-1型	0.3	1.5	0.3	0.75	L（左）^c（c）	L（左）	L（左）	L（左）
BC-1型	1.2	4.3	10	4.8	12	9.6	10.4	13.2

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^一增长率表示为10^三在最高稀释度下，LCL增长速度超过。

^b条-，没有增长。

^c（c）五十、最初的有限增长。

最初，从每个供体的PBMC和上清液中建立了六个细胞系。一位捐赠者的PBMC被使用了两次，结果相似。因此，使用BCBL-1或BC-1上清液建立了总共54个细胞系。HHV-8型⁺电子商务车辆⁺在不同传代后，通过PCR检测LCL是否存在EBV和HHV-8 DNA（图。（图1）。1). EBV和HHV-8均存在于EBV PBMC衍生的所有细胞系中⁺感染HHV-8上清液的供体⁺细胞系BC-1和BCBL-1，以及EBV衍生的细胞系⁻用BC-1细胞上清液感染的供体。在图中的实验中。图1，1在第3、6、9、12、15、18和21代后检测两种LCL，即ABEH-1和GMEH-1，发现EBV和HHV-8均呈阳性，病毒载量没有明显下降。四个不朽HHV-8⁺电子商务车辆⁺细胞系目前连续培养25代以上，持续培养9个月以上。另一个HHV-8⁺电子商务车辆⁺细胞系在液氮中冷冻，因为它们看起来很相似。一旦HHV-8⁺电子商务车辆⁺建立了细胞系，与EBV相比，长期培养的效率没有差异⁺LCL。所有四个细胞系在连续细胞培养中保持9个月以上，发现EBV和HHV-8均呈阳性。此外，没有HHV-8⁺电子商务车辆⁺迄今为止，无论是HHV-8还是EBV，LCL均为阴性。

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图1

HHV-8和EBV持续感染LCL。使用EBV（BALF5，343 bp）或HHV-8（K12，196 bp）特异性引物，通过PCR从第3代到第21代检测LCL ABEH-1和GMEH-1中的病毒DNA。在指定的传代次数后提取细胞DNA，并在30个周期的非标准PCR中使用每种DNA制剂500 ng。将十分之一的PCR混合物应用于2%琼脂糖凝胶上，并在溴化乙锭染色后观察。

EBV的表型分析⁺HHV-8型⁺LCL。

接下来，我们确定了永生化细胞系的表型。所有HHV-8⁺电子商务车辆⁺检测的LCL对CD19（B淋巴细胞抗原）呈阳性，但对CD3（T淋巴细胞标记物）、CD14（单核细胞/巨噬细胞）和CD16（NK细胞）呈阴性（图。（图2），2)表明这些细胞来源于B淋巴细胞。此外，HHV-8⁺电子商务车辆⁺与EBV转化的LCL相似，LCL表达表面IgM以及B细胞活化标记CD23、CD30和CD80（表（表2）。2). 在这些细胞上未发现表面IgG、CD20和CD56。通过一些标记物，该表型与BCBL-1和BC-1细胞株不同；例如，BCBL-1细胞对CD80呈阴性，而BC-1细胞对CD30呈阴性。有趣的是，不同供体LCL的表面表型和生长特性不同。而大多数HHV-8⁺电子血压计⁺LCL在悬浮液中生长成大团状，类似于EBV转化的LCL，即HHV-8的细胞⁺电子商务车辆⁺LCL COEH-1呈半粘附生长，呈纺锤形（数据未显示）。

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图2

B细胞抗原CD19在HHV-8上的表达⁺电子商务车辆⁺LCL。HHV-8型⁺电子商务车辆⁺LCL（ABEH-1和GMEH-1）、EBV⁺HHV-8型⁻LCL（ABE-1和GME-1）、BC-1和BCBL-1用抗CD3、抗CD14、抗CD16和抗CD19单克隆抗体染色。每个分析中都包括同位素对照。对10000个活细胞进行门控流式细胞术。

表2

HHV-8的表面表型⁺电子商务车辆⁺和EBV⁺ 生命周期清单

细胞系	存在^一:
细胞系	免疫球蛋白G	免疫球蛋白M	CD20型	CD23型	CD30型	CD56型	CD80型
ABEH-1（HHV-8⁺电子商务车辆⁺)	−	+	−	+	+	−	+
ABE-1（HHV-8⁻电子商务车辆⁺)	+	+	−	+	+	−	+
GMEH-1（HHV-8⁺电子商务车辆⁺)	−	+	−	+	+	−	+
GME-1（HHV-8⁻电子商务车辆⁺)	+	+	−	+	+	−	+
BC-1（HHV-8型⁺电子商务车辆⁺)	−	+	−	+	−	−	+
BCBL-1（HHV-8⁺电子商务车辆⁻)	−	+	−	+	+	−	−

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^一CD20，成熟B细胞和前B细胞，而非浆细胞（B1）；CD23，成熟和/或活化的B细胞（低亲和力IgE受体）；CD30、活化B细胞和T细胞（TNF受体超家族）；CD56、白细胞介素2依赖性T细胞克隆、NK细胞（NCAM）；CD80、活化的B细胞和T细胞（B7-1共刺激分子）。表面分子的表达通过FITC缀合的多克隆抗体（IgG和IgM）或PE缀合的单克隆抗体（CD20、CD23、CD30、CD56和CD80）的免疫荧光测定。

HHV-8转化的B细胞株的潜在感染。

我们接下来测试了HHV-8⁺电子商务车辆⁺用于表达潜伏病毒转录物T0.7的LCL，该转录物编码kaposin。在非诱导HHV-8中检测到T0.7⁺电子商务车辆⁺LCL GMEH-1通过RT-PCR传代5、10和15代后，通过佛波酯和n个-丁酸（图。（图3）。三). 所有测试样品的肌动蛋白mRNA扩增产生的信号相似，表明RNA含量具有可比性。RT-PCR结果经Northern blot分析证实，25代以上传代后，未刺激的ABEH-1和GMEH-1细胞中存在T0.7。根据RT-PCR结果，在未诱导的HHV-8中检测到kaposin蛋白⁺电子商务车辆⁺用MAb-kap5C4免疫荧光法检测LCLs GMEH-1和ABEH-1（图。（图4）。4). 在BCBL-1细胞上也检测到卡波素，但在B95-8细胞上未检测到。

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图3

检测非诱导的HHV-8潜在转录物和诱导的HHV-8裂解转录物⁺电子商务车辆⁺LCL。EBV的RT-PCR分析⁺HHV-8型⁺分别在5、10和15代传代后进行LCL GMEH-1，并用TPA和丁酸钠诱导或不诱导。RT反应通过寡核苷酸（dT）启动，然后用基因特异性引物进行PCR，以潜在T0.7转录物（196 bp）、裂解病毒mRNA VP23（917 bp）和肌动蛋白mRNA（245 bp）作为对照。作为PCR阴性和阳性对照，分别使用VP23、肌动蛋白和K12全长cDNA的水和质粒DNA。

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图4

非诱导型、裂解型HHV-8小衣壳蛋白VP23和诱导型HHV-8中EBV裂解VCA中HHV-8-蛋白kaposin的检测⁺电子商务车辆⁺ABEH-1 LCL。电子商务车辆⁺HHV-8型⁺用丙酮固定后，LCL ABEH-1（a至f）、BCBL-1（g至l）和B95-8（m至r）用MAb kap5C4（b、h和n）、MAb Vp234G2（d、j和p）或MAb直接染色到EBV的VCA（f、l和r）。kap5C4染色的细胞未被诱导，而MAb VP234G2或EBV抗VCA染色的细胞被TPA和丁酸钠诱导。用Cy3-偶联的山羊抗鼠IgG或山羊抗小鼠IgG观察结合抗体，并在徕卡TNT共焦显微镜下进行检查。

HHV-8裂解病毒蛋白的诱导⁺电子商务车辆⁺LCL。

接下来，我们研究了潜伏的HHV-8是否可以在HHV-8中重新激活⁺电子血压计⁺低成本信用证。用佛波酯和n个-然后通过RT-PCR检测编码VP23的裂解病毒转录物（图。（图3）。三). 在所有不朽HHV-8中⁺电子商务车辆⁺检测LCL，在佛波酯和n个-丁酸，类似于BC-1和BCBL-1细胞。根据RT-PCR结果，用MAb vp4G2免疫荧光法检测HHV-8细胞中的病毒衣壳蛋白VP23⁺电子商务车辆⁺LCL ABEH-1和BCBL-1细胞。B95-8没有反应性（图。（图4）4)和EBV⁺相同供体的LCL（数据未显示），表明与EBV蛋白没有交叉反应。在B95-1和ABEH-1细胞中检测到对EBV VCA的反应，但在BCBL-1细胞中未检测到。

来自HHV-8的HHV-8-串行通道⁺电子商务车辆⁺LCL。

由于溶血性HHV-8基因可以在HHV-8-中诱导⁺电子商务车辆⁺LCL，我们假设HHV-8⁺电子血压计⁺LCL能够产生感染性病毒颗粒并感染新细胞。EBV的PBMC⁺供体与HHV-8上清液孵育⁺电子商务车辆⁺和EBV⁺LCL（表（表3）。三). 如预期，EBV上清液⁺LCLs ABE-1和GME-1使B细胞永生化。有趣的是，用HHV-8上清液培养⁺电子商务车辆⁺LCL也能促进细胞株的生长，而Raji细胞的对照上清液或培养基没有这种作用。每个上清液建立6个第二代细胞系，每种上清液的一个第二代细胞系在两代后通过免疫荧光分析进行检测。来自PBMC的细胞株与ABE-1和GME-1细胞的上清液孵育后，EBV VCA阳性，HHV-8 kaposin阴性。来自PBMC的细胞系与HHV-8细胞上清液培养⁺电子商务车辆⁺LCLs ABEH-1和GMEH-1对HHV-8 kaposin和EBV VCA均呈阳性，表明HHV-8已转移到这些细胞。

表3

HHV-8与HHV-8的串联通道⁺电子血压计⁺EBV对PBMC的LCL⁺ 捐赠者

上清液^一	LCL增长^b条	的表达式^c（c）:
上清液^一	LCL增长^b条	HHV-8卡波辛	EBV VCA公司
控制	−	ND（无损检测）^d日	ND（无损检测）
拉吉	−	ND（无损检测）	ND（无损检测）
ABEH-1型	0.18	+	+
ABE-1型	45	−	+
GMEH-1型	1.4	+	+
通用电气-1	35	−	+

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^一如材料和方法中所述，上清液由第18代的ABEH-1 LCL、第14代的ABE-1 LCL、23代的GMEH-1 LCLs和14代的GME-1 LCLs制备而成。

^b条表示为10²在最高稀释度下，LCL增长速度超过。

^c（c）用单克隆抗体kap5C4和817分别通过免疫荧光法测定HHV-8 kaposin和EBV VCA在外生长细胞上的表达。

^d日ND，未完成。

讨论

在这项研究中，我们能够证明：（i）体外外周血B淋巴细胞可以持续感染HHV-8，（ii）HHV-8支持EBV对B细胞的转化活性，以及（iii）感染导致永久性HHV-8的生长⁺电子商务车辆⁺LCL。体外EBV感染PBMC可导致B细胞永生化和EBV的产生⁺低成本信用证。在体内，EBV感染会导致一种称为单核细胞增多症的原发感染，随后EBV会在B淋巴细胞中潜伏终生。据报道，外周血中EBV感染B细胞的频率在1/10之间⁴和1/10⁶(43). 存在于分离PBMC中的EBV可导致永生化细胞自发生长，而无需添加含EBV的上清液；然而，必须使用最少数量的单元格(22,23). 在这里显示的实验中，使用的细胞数量不足以使EBV自发生长⁺LCL（表（表1）。1). 在接受测试的八名捐赠者中，没有一人的PBMC中，培养基或Raji细胞上清液（Ragi细胞含有EBV基因组，但不能产生传染性EBV）单独导致永生化B细胞系的生长。相反，含有HHV-8的BCBL-1细胞上清诱导所有四种EBV PBMC中LCL的生长⁺捐赠者，但不在EBV PBMC中⁻捐赠者。

LCL持续感染HHV-8和EBV，并具有与EBV相似的活化B细胞表型⁺LCL。HHV-8也可以从EBV转移到PBMC⁻供体，但仅当使用含有HHV-8和EBV的BC-1上清液时。因此，HHV-8感染EBV⁺B细胞，并有利于含有这两种病毒的永生化LCL的生长。有趣的是，BC-1上清液感染PBMC并没有导致EBV的生长⁺但是，反而导致了HHV-8的生长⁺电子商务车辆⁺LCL，这可能表明两种病毒都有感染选择。此外，我们克隆了两株HHV-8⁺电子商务车辆⁺并用PCR检测其中一个克隆的八个克隆是否存在HHV-8和EBV。所有8个克隆均为HHV-8⁺电子商务车辆⁺这表明克隆中没有一个病毒丢失。因此，有几条证据表明，感染这两种病毒的细胞具有生长优势，HHV-8可能具有内在转化潜力。许多BCBL细胞系都感染了这两种病毒，这一事实支持了这一点。从形式上讲，这两种病毒中的任何一种都可能是HHV-8的主要转化剂⁺电子商务车辆⁺LCL，而另一种病毒提供一种必需或非必需（促生长）辅因子。如果HHV-8是B淋巴细胞的转化病毒，它似乎依赖于EBV衍生的辅因子，至少在我们使用的条件下是这样。另一种解释可能是两步转换过程，分为启动步骤和维护步骤。在这种情况下，提供起始步骤的病毒应该至少在某些细胞系中消失，因为没有选择。然而，目前我们没有证据支持这种解释。有趣的是，HHV-8与EBNA、LMP和EBER没有同源性；然而，还有其他几个候选基因用于转化v-IL6等基因(29,33)，cc趋化因子(21)，G蛋白偶联受体(三,12)，v-cyclin(7,8,17)，K1(14)，干扰素调节因子(29,31)，卡波辛(32)，v-FLIP(46)、LANA(36)和v-bcl2(9). 因此，HHV-8支持转化的机制可能与EBV不同。

众所周知，KS患者和健康人的外周血B淋巴细胞可在体内感染HHV-8(1,10,25). 目前，没有证据表明这些细胞在体内被HHV-8和EBV双重感染(4). 相反，几乎所有PEL肿瘤都对EBV和HHV-8呈阳性，这意味着双重感染可能在该实体中起到因果作用。在KS中，只有少数肿瘤EBV阳性。因此，这两种病毒不太可能在KS的肿瘤发生中发挥协同作用。HHV-8感染的主要靶细胞尚不清楚。这项研究提供了一些证据，证明B细胞可能是HHV-8感染者中携带和不携带KS的主要宿主和潜伏期。它提供了一个体外感染HHV-8的模型系统，并可能为B细胞感染在HHV-8发病机制中的作用提供一些线索。

致谢

我们感谢C.Atzler提供的专家技术援助。细胞株BC-1和BCBL-1分别由Patrick Moore和Don Ganem提供。

S.K.的部分资助来自德国联邦科学院Graduiertenkolleg“Infektion und Immunityät”的奖学金。

参考文献

1Ambroziak J A、Blackbourn D J、Herndier B G、Glogau R G、Gullett J H、McDonald A R、Lennette E T、Levy J A。HIV感染和未感染Kaposi肉瘤患者中的疱疹样序列。科学。1995;268:582–583.（信件）[公共医学][谷歌学者]

2Andre S、Schatz O、Bogner J R、Zeichhardt H、Stoffler M M、Jahn H U、Ullrich R、Sonntag A K、Kehm R、Haas J。AIDS相关卡波西肉瘤中人类疱疹病毒8病毒衣壳蛋白抗体的检测。分子医学杂志。1997;75：145–152。[公共医学][谷歌学者]

3Arvanitakis L、Geras R E、Varma A、Gershengorn M C、Cesarman E。人类疱疹病毒KSHV编码与细胞增殖相关的组成活性G蛋白偶联受体。自然。1997;385:347–350.[公共医学][谷歌学者]

4Bigoni B、Dolcetti R、de Lellis L、Carbone A、Boiocchi M、Cassai E、di Luca D。人类疱疹病毒8存在于健康人的淋巴系统中，并可在艾滋病过程中重新激活。传染病杂志。1996;173:542–549.[公共医学][谷歌学者]

5Cesarman E，Chang Y，Moore P S，Said J W，Knowles D M.Kaposi在AIDS相关体细胞淋巴瘤中的肉瘤相关疱疹病毒样DNA序列。N英格兰医学杂志。1995;332:1186–1191.[公共医学][谷歌学者]

6Cesarman E，Moore P S，Rao P H，Inghirami G，Knowles D M，Chang Y.两个包含卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）DNA序列的获得性免疫缺陷综合征相关淋巴瘤细胞系（BC-1和BC-2）的体外建立和表征。鲜血。1995;86:2708–2714.[公共医学][谷歌学者]

7Cesarman E、Nador R G、Bai F、Bohenzky R A、Russo J J、Moore P S、Chang Y、Knowles D M。卡波西肉瘤相关疱疹病毒包含G蛋白偶联受体和细胞周期蛋白D同源物，在卡波西氏肉瘤和恶性淋巴瘤中表达。《维罗尔杂志》。1996;70:8218–8223. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

8Chang Y、Moore P S、Talbot S J、Boshoff C H、Zarkowska T、Godden K、Paterson H、Weiss R A、Mittnacht S Cyclin由KS疱疹病毒编码。自然。1996;382:410.（信件）[公共医学][谷歌学者]

9Cheng E H，Nicholas J，Bellows D S，Hayward G S，Guo H G，Reitz M S，Hardwick J M.由卡波西肉瘤相关病毒人类疱疹病毒8编码的Bcl-2同源物抑制细胞凋亡，但不与Bax或Bak异二聚体。美国国家科学院程序。1997;94:690–694. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

10Decker L L、Shankar P、Khan G、Freeman R B、Dezube B J、Lieberman J、Thorley L D。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）作为完整的潜伏基因组存在于KS组织中，但在KS患者的外周血单核细胞中复制。《实验医学杂志》。1996;184:283–288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

11Dupin N、Grandaam M、Calvez V、Gorin I、Aubin J T、Havard S、Lamy F、Leibowitch M、Huraux J M、Escande J P等。地中海卡波西肉瘤患者的疱疹病毒样DNA序列。柳叶刀。1995;345:761–762.[公共医学][谷歌学者]

12Eliopoulos A G、Dawson C W、Mosialos G、Floettmann J E、Rowe M、Armitage R J、Dawsson J、Zapata J M、Kerr D J、Wakelam M J、Reed J C、Kieff E、Young L S。Epstein-Barr病毒编码的LMP1模拟了CD40诱导的上皮细胞生长抑制：TRAF3作为一种常见介质的参与。致癌物。1996;13:2243–2254.[公共医学][谷歌学者]

13Foreman K E、Friborg J、Kong W P、Woffendin C、Polverini P J、Nickoloff B J、Nabel G J。艾滋病相关卡波西肉瘤中人类疱疹病毒的传播。N英格兰医学杂志。1997;336:163–171.[公共医学][谷歌学者]

14Ganem D.KSHV和卡波西肉瘤：开始的结局？单元格。1997;91:157–160.[公共医学][谷歌学者]

15Gao S J、Kingsley L、Hoover D R、Spira T J、Rinaldo C R、Saah A、Phair J、Detels R、Parry P、Chang Y、Moore P S.在卡波西肉瘤发生前血清转化为针对卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒相关潜在核抗原的抗体。N英格兰医学杂志。1996;335:233–241.[公共医学][谷歌学者]

16Gao S J、Kingsley L、Li M、Zheng W、Parravicini C、Ziegler J、Newton R、Rinaldo C R、Saah A、Phair J、Detels R、Chang Y、Moore P S.在患有或不患有卡波西肉瘤的美国人、意大利人和乌干达人中检测KSHV抗体。自然医学。1996;2:925–928.[公共医学][谷歌学者]

17Godden-Kent D、Talbot S J、Boshoff C、Chang Y、Moore P、Weiss R A、Mittnacht S。卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码的细胞周期蛋白刺激cdk6磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白和组蛋白H1。《维罗尔杂志》。1997;71:4193–4198. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

18Huang Y Q，Li J J，Kaplan M H，Poiesz B，Katabira E，Zhang W C，Feiner D，Friedman K A.各种形式的卡波西肉瘤中的人类疱疹病毒样核酸。柳叶刀。1995;345：759–761。[公共医学][谷歌学者]

19Kedes D H，Operskalski E，Busch M，Kohn R，Flood J，Ganem D。人类疱疹病毒8型（卡波西肉瘤相关疱疹病毒）的血清流行病学：KS风险组的感染分布和性传播证据。自然医学。1996;2:918–924.（勘误表，2:1041.) [公共医学][谷歌学者]

20Kieff E.Epstein Barr病毒及其复制。编辑：Fields B N、Knipe D M、Howley P M、Chanock R M、Melnick J L、Monath T P、Roizman B、Straus S E。病毒学。第三版，费城，宾夕法尼亚州：Lippincott-Raven；1998年，第2343–2396页。[谷歌学者]

21Kledal T N、Rosenkilde M M、Coulin F、Simmons G、Johnsen A H、Alouani S、Power C A、Luttichau H R、Gerstoft J、Clapham P R、Clark L I、Wells T C、Schwartz T W。一种由卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码的广谱趋化因子拮抗剂。科学。1997;277:1656–1659.[公共医学][谷歌学者]

21年a。Kliche，S.等人。未发布的数据。

22Kohler G，Milstein C.分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养。自然。1975;256:495–497.[公共医学][谷歌学者]

23Kremmer E，Ohst K，Kiefer J，Brewis N，Walter G.用针对调节性A亚单位的单克隆抗体分离PP2A核心酶和全酶：两种形式在细胞中的大量表达。分子细胞生物学。1997;17:1692–1701. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

第23页a。Kremmer，E.等人。未发布的数据。

24Lennette E T，Blackbourn D J，Levy J A.普通人群和卡波西肉瘤患者中的人类疱疹病毒8型抗体。柳叶刀。1996;348:858–861.[公共医学][谷歌学者]

25Mesri E A、Cesarman E、Arvanitakis L、Rafii S、Moore M A、Posnett D N、Knowles D M、Asch A S。人类疱疹病毒-8/卡波西肉瘤相关疱疹病毒是一种感染B细胞的新型可传播病毒。《实验医学杂志》。1996;183:2385–2390. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

26Miller G、Heston L、Grogan E、Gradoville L、Rigsby M、Sun R、Shedd D、Kushnaryov V M、Grossberg S、Chang Y。卡波西肉瘤疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒在双重感染的体腔淋巴瘤细胞中潜伏和溶解复制之间的选择性切换。《维罗尔杂志》。1997;71：314–324。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

27Miller G、Rigsby M O、Heston L、Grogan E、Sun R、Metroka C、Levy J A、Gao S J、Chang Y、Moore P。HIV-1感染患者卡波西肉瘤相关疱疹病毒的丁酸诱导抗原抗体。N英格兰医学杂志。1996;334:1292–1297.[公共医学][谷歌学者]

28Monini P、de Lellis L L、Fabris M、Rigolin F、Cassai E.Kaposi前列腺组织和人类精液中与肉瘤相关的疱疹病毒DNA序列。N英格兰医学杂志。1996;334:1168–1172.[公共医学][谷歌学者]

29Moore P S，Boshoff C，Weiss R A，Chang Y.KSHV对人类细胞因子和细胞因子反应途径基因的分子模拟。科学。1996;274:1739–1744.[公共医学][谷歌学者]

30Moore P S，Chang Y.检测感染和未感染HIV的患者Kaposi肉瘤中疱疹病毒样DNA序列。N英格兰医学杂志。1995;332:1181–1185.[公共医学][谷歌学者]

31Moorthy R K，Thorley L D.爱泼斯坦-巴尔病毒编码的致癌潜伏膜蛋白LMP-1磷酸化位点的生化、遗传和功能分析。《维罗尔杂志》。1993;67:2637–2645. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

32Muralidhar S、Pumpery A M、Hassani M、Sadaie M R、Azumi N、Kishishita M、Brady J N、Doniger J、Medveczky P、Rosenthal L J。卡波素（开放阅读框K12）作为人类疱疹病毒8（卡波西肉瘤相关疱疹病毒）转化基因的鉴定。《维罗尔杂志》。1998;72:4980–4988. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

33Neipel F、Albrecht J C、Ensser A、Huang Y Q、Li J J、Friedman K A、Fleckenstein B。人类疱疹病毒8编码白介素-6的同源物。《维罗尔杂志》。1997;71:839–842. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

34Neipel F，Albrecht J C，Fleckenstein B.卡波西肉瘤相关鼠李病毒人类疱疹病毒8中的细胞同源基因：其致病性的决定因素？《维罗尔杂志》。1997;71:4187–4192. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

35Orenstein J M，Alkan S，Blauvelt A，Jeang K T，Weinstein M D，Ganem D，Herndier B。通过光和透射电子显微镜观察卡波西肉瘤中的人类疱疹病毒8型。艾滋病。1997;11：F35–F45。[公共医学][谷歌学者]

36Rainbow L、Platt G M、Simpson G R、Sarid R、Gao S J、Stoiber H、Herrington C S、Moore P S、Schulz T F。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（人类疱疹病毒8）的222至234千道尔顿潜伏核蛋白（LNA）由orf73编码，是潜在相关核抗原的组成部分。《维罗尔杂志》。1997;71:5915–5921. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

37Renne R、Blackbourn D、Whitby D、Levy J、Ganem D。培养细胞中卡波西肉瘤相关疱疹病毒的有限传播。《维罗尔杂志》。1998;72:5182–5188. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

38Renne R，Zhong W，Herndier B，McGrath M，Abbey N，Kedes D，Ganem D。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（人类疱疹病毒8）在培养中的溶血生长。自然医学。1996;2:342–346.[公共医学][谷歌学者]

39Rettig M B、Ma H J、Vescio R A、Pold M、Schiller G、Belson D、Savage A、Nishikubo C、Wu C、Fraser J、Said J W、Berenson J R.Kaposi的多发性骨髓瘤患者骨髓树突状细胞肉瘤相关疱疹病毒感染。科学。1997;276:1851–1854.[公共医学][谷歌学者]

40Rose T M、Strand K B、Schultz E R、Schaefer G、Rankin G W、Jr、Thouless M E、Tsai C C、Bosch M L。不同猕猴腹膜后纤维瘤病中卡波西肉瘤相关疱疹病毒（人类疱疹病毒8）两种同源物的鉴定。《维罗尔杂志》。1997;71:4138–4144. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

41Russo J J、Bohenzky R A、Chien M C、Chen J、Yan M、Maddalena D、Parry J P、Peruzzi D、Edelman I S、Chang Y、Moore P S。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（HHV8）的核苷酸序列美国国家科学院程序。1996;93:14862–14867. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

42原发性渗出性淋巴瘤中的Said J W、Chien K、Takeuchi S、Tasaka T、Asou H、Cho S K、de Vos S、Cesarman E、Knowles D M、Koefler H P.Kaposi的肉瘤相关疱疹病毒（KSHV或HHV-8）：淋巴瘤细胞中疱疹病毒的超微结构显示。鲜血。1996;87:4937–4943.[公共医学][谷歌学者]

43Sarid R，Flore O，Bohenzky R A，Chang Y，Moore P S.卡波西肉瘤相关疱疹病毒（人类疱疹病毒8）基因组在体腔型淋巴瘤细胞系（BC-1）中的转录图谱《维罗尔杂志》。1998;72:1005–1012. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

44Simpson G R、Schulz T F、Whitby D、Cook P M、Boshoff C、Rainbow L、Howard M R、Gao S J、Bohenzky R A、Simmonds P、Lee C、de Ruiter A、Hatzakis A、Tedder R S、Weller I V、Weiss R A、Moore P S。通过重组衣壳蛋白抗体和潜在免疫荧光抗原测定卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的流行率。柳叶刀。1996;348:1133–1138.[公共医学][谷歌学者]

45Soulier J、Grollet L、Oksenhendler E、Cacoub P、Cazals H D、Babinet P、D'Agay M F、Clauvel J P、Raphael M、Degos L等。多中心卡斯特曼病中卡波西肉瘤相关疱疹病毒样DNA序列。鲜血。1995;86：1276–1280。[公共医学][谷歌学者]

46Thome M、Schneider P、Hofmann K、Fickenscher H、Meinl E、Neipel F、Mattmann C、Burns K、Bodmer J L、Schroter M、Scaffidi C、Krammer P H、Peter M E、Tschopp J。病毒FLICE抑制蛋白（FLIPs）可防止死亡受体诱导的细胞凋亡。自然。1997;386:517–521.[公共医学][谷歌学者]

47Vieira J，Huang M L，Koelle D M，Corey L。有卡波西肉瘤病史的男性唾液中的传染性卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（人类疱疹病毒8）。《维罗尔杂志》。1997;71:7083–7087. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

48Virgin H W、Latreille P、Wamsley P、Hallsworth K、Weck K E、Dal C A、Speck S H。小鼠γ-疱疹病毒68的完整序列和基因组分析。《维罗尔杂志》。1997;71:5894–5904. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）

人类疱疹病毒8持续感染EB病毒阳性B淋巴细胞

斯蒂芬妮·克里奇

伊丽莎白·克雷默

沃尔夫冈·哈默施密特

乌尔里希·科斯齐诺夫斯基

尤尔根·哈斯

摘要

材料和方法

献血者。

细胞培养和EBV和/或HHV-8感染。

细胞DNA的分离和病毒DNA的PCR检测。

RNA和RT-PCR的制备。

流式细胞术。

免疫荧光和共焦显微镜。

结果

PBMC的永生化和EBV和HHV-8的持续性病毒感染。

表1

EBV的表型分析+HHV-8型+LCL。

表2

HHV-8转化的B细胞株的潜在感染。

HHV-8裂解病毒蛋白的诱导+电子商务车辆+LCL。

来自HHV-8的HHV-8-串行通道+电子商务车辆+LCL。

表3

讨论

致谢

参考文献

EBV的表型分析⁺HHV-8型⁺LCL。

HHV-8裂解病毒蛋白的诱导⁺电子商务车辆⁺LCL。

来自HHV-8的HHV-8-串行通道⁺电子商务车辆⁺LCL。