HSP90与热休克因子1的相互作用和调节爪蟾卵母细胞

摘要

细胞通过上调一系列高度保守的热休克蛋白（HSPs）的表达来应对热和其他形式的应激，HSPs在正常和应激条件下均作为分子伴侣介导蛋白质的折叠、组装、移位和降解（参考文献综述25和34). 在真核生物中，应激诱导的热休克蛋白表达主要由热休克转录因子HSF1调节，HSF1通过热休克蛋白基因启动子中发现的热休克调节元件（HSE）发挥作用(33,73). 在无应力条件下，HSF1作为受抑制的非DNA结合单体存在(16,53,75)，并且后生动物细胞中HSF1的激活-失活途径涉及几个独立调节的步骤（在参考文献中综述40和73). 不同形式的细胞应激触发HSF1从惰性单体快速转化为同源三聚体，这第一步伴随着HSE结合亲和力的增加(4,53,55,66,70). 详细的诱变分析表明，HSF1单体通过几个疏水性七肽重复序列之间的分子内相互作用而稳定，应激期间的活化涉及到这些分子内相互作用力的破坏，导致与其他HSF1单体成分子间卷曲线圈(16,55,66,75). 因此，正常情况下HSE结合活性的抑制至少部分由HSF1内的疏水序列调节，尽管分子的其他区域也参与了这种调节(48). 一旦其三聚化，HSF1会进行额外的修饰以上调转录活性，这些转录活性似乎是独立于三聚化和DNA结合进行调节的(21,59,76). HSF1调节的最后一步是去激活或衰减。消除压力后，HSF1分解为单体并停止激活转录(11,44,52).

很明显，HSF1在正常和应力条件下都受到复杂的调节。首先，HSF1仅受温度调节的简单模型与以下观察结果相矛盾：热休克蛋白基因被多个不相关的应激打开，在异源系统中表达的HSF1分子根据宿主细胞的适当生理温度重新编程(8,11,30,53). 因此，HSF1似乎受到未知细胞因子的负调控。其次，HSF1被几种不同的信号转导分子磷酸化；例如，用佛波酯处理人红白血病细胞可以增强HSF1的热诱导活化，因此HSF1明显被蛋白激酶C靶向(26). HSF1也被ERK1磷酸化，将HSF1连接到Ras信号通路(29). 丝氨酸和苏氨酸残基的组成性磷酸化和应激诱导的过度磷酸化也表明HSF1受细胞激酶和/或磷酸酶的调节(4,30,55). 虽然不同磷酸化状态和特定HSF1活性之间的明确相关性尚未建立(12,31,46,72)最近的证据表明，过度磷酸化既可以增加反式激活潜能，也可以延迟三聚体的分离(74).

除了细胞因子的磷酸化和抑制外，人们还假设热休克蛋白本身，特别是热休克蛋白70，可以作为细胞检测应激和调节HSF1的自动调节机制的一部分发挥作用(39). 这一观点得到了对不同细胞类型的大量实验观察的证实：其他HSPs在HSPs基因突变后的激活表达热休克蛋白70酵母中的基因(9)，继续转录热休克蛋白70翻译抑制剂治疗HSP蓄积阻断的细胞恢复期基因(13)和激活热休克蛋白基因对人工增加变性蛋白质核浓度的反应(2,37). 研究表明，HSP70和HSF1之间的物理相互作用在体外和体内都会发生，但这似乎是不稳定的，因此尚未确定这些复合物的化学计量关系(1,三,5,39,47,53,70). 此外，不同的研究表明，培养细胞中HSP70的直接过表达或降低了诱导期间HSF1的激活水平(5,41)或增加HSF1失活率(41,54)因此，HSP70对HSF1激活-去激活齐聚步骤的精确影响尚未完全阐明。最近，HSP70被证明通过与反式激活域的直接相互作用来抑制HSF1(61); 因此，HSP70的主要自我调节作用似乎是下调HSF1介导的转录。

另一个特征鲜明的热休克蛋白，即HSP90，是几个伴侣异型复合物的核心，这些杂合物包含不同种类的非共价连接蛋白，包括HSP70(18). 许多研究已经证实，某些信号转导分子和转录因子的高阶折叠需要HSP90（参考文献综述7和28)HSP90在广泛的二级结构形成后的蛋白质折叠的后期发挥作用(35,62,63). HSP90被认为不是一般的伴侣，而是与各种特定底物（包括低氧诱导因子α）相互作用并调节其活性(20)，MyoD(58)、类固醇激素受体(50)，第60页^{v（v）-型钢混凝土}激酶(10)，酪蛋白激酶II(15)，和eIF-2α激酶(69).

总之，HSP90已知的伴侣功能和底物特异性，与HSF1寡聚相关的构象变化，HSF1明显整合到不同的信号转导级联中，以及之前的一篇报道描述了固定化HSP90和HeLa细胞核提取物中HSF之间的相互作用(42)提示我们将HSP90视为HSF1活性的潜在调节剂。此外，HSF1最近被证明可以在体外组装HSP90和孕酮受体组装途径中常见的其他伴侣(43). 在这里，我们通过使用爪蟾卵母细胞。共免疫沉淀和抗体识别实验的结果提供了HSP90和HSF1在体内物理联系的明确证据。微注射抗体或特异性结合剂格尔德霉素（GA）对HSP90功能的损害导致恢复过程中HSF1三聚体的分解显著延迟，热诱导转录显著减少热休克蛋白70启动子。此外，微量注射HSP90抗体（Abs）可以在没有热休克的情况下激活HSE结合活性，这种作用可以通过随后注射外源性HSP90来逆转。这些观察结果共同支持了一种新的调控模型，在该模型中，HSP90和HSF1之间的杂合物的形成在调节HSF1激活-去激活途径的不同步骤中起着关键作用。

材料和方法

结果

用HSF1检测免疫复合物中的HSP90。

在本研究中，我们使用了爪蟾用卵母细胞模型系统检测HSP90伴侣在调节HSF1活性中的潜在作用。我们之前已经证明内源性HSF1是一种核蛋白爪蟾热休克前后的卵母细胞(36). 因此，我们推断内源性HSP90必须存在于卵母细胞细胞核中，才能在体内发生HSP90-HSF1相互作用。为了验证这一点，人工去核卵母细胞，并通过免疫印迹法测定HSP90的亚细胞分布（图。​（图1A）。1A） ●●●●。在这个实验中，将完整卵母细胞的总蛋白直接与单个大卵母细胞核和同一细胞细胞质中的蛋白进行比较。虽然HSP90的大部分似乎位于细胞质中，但HSP90在未锁卵母细胞和热休克卵母细胞的核室中都能明显检测到。在热休克前后从卵母细胞分离的细胞核中检测到相对等量的HSP90，这表明HSP90的核质分布不受本实验中使用的热应激条件（33℃持续2 h）的显著影响。热休克没有导致HSP90的总细胞水平的可检测的增加。这与之前的观察结果一致，表明热休克在单个细胞中不会显著诱导热休克蛋白的合成爪蟾卵母细胞(27).

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图1

HSP90-HSF1杂合物的鉴定爪蟾卵母细胞核。（A） 免疫印迹显示HSP90的亚细胞分布。卵母细胞在非休克（NS）温度（18°C）或热休克（HS）温度（33°C）下孵育2 h，用SDS-PAGE和纯化牛HSP90作为对照分离单个完整卵母细胞或核质组分的蛋白质。用HSP90 PAb检测HSP90。分子质量标准的位置如左图所示。（B） HSF1和HSP90从卵母细胞核共免疫沉淀。用兔抗鼠HSF1 PAb免疫沉淀HSF1和YY1(55)或YY1 PAb（圣克鲁斯）。从非曲棍球或热休克（33℃，1 h）卵母细胞中分离出核提取物。将免疫沉淀材料进行SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素中，并用HSP90和HSF1抗体进行印迹检测，如图所示。

为了确定体内是否可以检测到HSP90-HSF1相互作用，使用HSF1-PAbs（抗小鼠HSF1抗血清）从未锁存或热休克的卵母细胞核中免疫沉淀HSF1(55)，并通过免疫印迹检查免疫沉淀材料是否存在HSP90（图。​（图1B）。1B） ●●●●。HSP90存在于来自非休克核和热休克核的HSF1免疫沉淀物质中，表明HSP90和HSF1之间存在物理联系。热休克前后检测到相同数量的HSP90，表明HSP90与非活性HSF1单体或应激激活HSF1三聚体的结合同样良好。对照实验表明，这些实验中使用的HSF1 PAbs不会与内源性爪蟾或在免疫印迹上纯化牛HSP90（数据未显示）。此外，如图。​图1B，1B、 在PAbs对抗YY1的对照免疫沉淀中未检测到HSP90(60)，是一种相对丰富的转录因子爪蟾卵母细胞(第36页).

HSP90抗体在体内和体外识别热激活的HSF1。

虽然HSP90和HSF1的共免疫沉淀表明这些蛋白质之间存在物理相互作用，但还需要其他证据来证实HSP90-HSF1异质复合物的存在。在接下来的一系列实验中，我们测试了HSP90抗体识别活化的DNA-结合HSF1三聚体的能力。在用放射性标记的HSE探针进行DNA结合反应之前，将HSP90 Abs与未锁存或热休克的卵母细胞提取物等分混合，并在凝胶迁移率超移分析中分析对HSF1-HSE复合物迁移的影响（图。​（图2）。2). 热诱导的HSF1复合物明显被HSP90单克隆抗体超转移，并被HSP90-PAb破坏，尽管与HSP90-MAb相比，这种作用需要相对大量的抗血清。当HSP90单克隆抗体或多克隆抗体直接混合到DNA结合反应混合物中而无需预孵育时，这些实验的结果对于每个抗体都是相同的（数据未显示）。我们将在这些试验中观察到的热诱导HSE带移的延迟或破坏归因于HSP90的特异性抗体识别与HSF1三聚体直接相关。这种解释与HSP90和HSF1的共免疫沉淀一致（图。​（图1）。1). HSP90 PAbs对HSE结合的破坏虽然与MAb的明显超移有所不同，但与HSF1 PAbs的超移实验结果类似（见图。​图4B）4B）(19). HSP90抗血清中PAb对多个表位的识别可能干扰HSF1依赖于HSP90的DNA结合活性。

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图2

在HSP90抗体凝胶迁移率变化分析中识别HSF1的热休克活化DNA结合形式。将等分的非曲棍球（NS）或热休克（HS）卵母细胞提取物与HSP90 MAb或PAb（抗血清）混合，并在与DNA结合反应之前培养30分钟³²P标记的HSE探针和HSF1-HSE复合物的迁移在凝胶迁移率变化分析中进行了分析。显示提取物未与抗体混合的通道（−），面板上方显示提取物培养中的最终抗体稀释。指出了非特异性结合活性（ns）、热诱导（HSF1）和超移（HSF1+ab）配合物的位置。

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图4

HSP90抗体在无应激条件下激活HSF1的HSE结合活性。（A） 左，未注射卵母细胞（−）和HSP90 Ab注射卵母公司（MAb或PAb）的凝胶迁移率变化分析，这些卵母细胞在非冲击温度（NS）下孵化或热休克1h（HS）。指出了热激活或Ab激活的HSF1-HSE复合物（HSF1）和HSP90 Ab超移位配合物（HSF1+Ab）的位置。右图，凝胶迁移率变化分析显示了共注射牛HSP90对HSF1-HSE复合物形成的影响。在第三条通道（+HSP90）中，在注射HSP90 PAbs后2 h将50 ng纯化牛HSP90注射到卵母细胞中，并在非休克温度下培养1 h ns后制备提取物，非特异性结合。（B） 注射PAbs的卵母细胞对抗YY1的底部凝胶迁移率变化分析（圣克鲁斯；见材料和方法）。顶部，未注射（uninj）和假注射（H）HSF1激活的比较₂O） 或HSF1抗血清注射（HSF1 PAb）(55)卵母细胞。（C） 体内通过微量注射HSP90抗体识别HSF1。用未注射（−）或HSP90MAb注射的卵母细胞进行凝胶迁移率变化测定。在一些通道中，将HSP90单克隆抗体或纯化牛HSP90添加到提取物中，如下图所示。在均质时（左起第五道），将HSP90（1μg）添加到注射Ab的卵母细胞中，并在DNA结合反应之前（左起的第七道和第八道），向未注射的热休克卵母细胞提取物中添加HSP90 MAb或蛋白（1μg/）。

接下来，我们确定是否可以在体内检测到HSP90和HSF1之间由体外超位移实验暗示的物理联系。进行了一系列实验，通过直接将HSP90抗体导入卵母细胞细胞核来靶向HSP90。然而，首先评估抗体注射技术的疗效很重要。最初的实验旨在确定注射的抗体在热休克期间的稳定性，以及抗体注射对内源性HSP90水平的任何定量影响。在核微注射HSP90 MAb后，卵母细胞在18℃下恢复1 h，然后在非休克或热休克条件下进一步孵育（18或33℃孵育2 h）。然后通过免疫印迹法检测细胞匀浆中是否存在抗HSP90单克隆抗体；在这个实验中，注射的抗体被用于检测内源性HSP90的次级抗体识别（图。​（图3A）。三A） ●●●●。结果表明，热休克前后微量注射MAbs的数量和表观分子尺寸相似，HSP90水平不受MAbs的影响。因此，这项技术似乎可以有效地将HSP90靶向或隔离到体内的免疫复合物中，而不会影响HSP90的总浓度。

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图3

HSP90在体内与HSF1相互作用。（A） 未注射或微量注射HSP90 MAb的非曲棍球（NS）和热休克（33°C，2 h）卵母细胞的免疫印迹。用HSP90一级抗体检测HSP90，用二级抗体检测注射的HSP90抗体（如材料和方法所述）。右边显示了提取物中存在的内源性卵母细胞HSP90和注射的HSP90单克隆抗体。左侧显示了分子质量标准的位置。（B） 通过凝胶迁移率变化分析，对未注射或注射HSP90 MAb的卵母细胞进行HSF1-HSE复合物迁移分析，这些卵母细胞在33°C下未受休克（NS）或热休克（HS），时间为指定时间。热激活HSF-HSE（HSF1）和HSP90 Ab-超位移（HSF1+Ab）复合物如右图所示。ns，非特异性结合活性。（C） 用HSP90抗血清（pAb）进行了与面板B类似的实验。

分析热休克前后微量注射HSP90抗体对HSF1 DNA结合活性的影响。HSP90单克隆抗体显著延缓了热休克诱导的HSF1-HSE复合物的迁移率（图。​（图3B）。三B） ●●●●。在未注射和注射HSP90 MAb的卵母细胞中诱导的HSF1的相对数量相似，表明这些抗体不会抑制HSF1的三聚或DNA结合活性。注射HSP90 PAbs后，未观察到热休克诱导的HSF1-HSE复合物的超位移（图。​（图3C），三C） ，但这并不奇怪，因为可以注入卵母细胞细胞核的抗血清的最大体积远小于在体外破坏HSF1-HSE带移所需的量（图。​（图2）。2). 尽管在这些实验中发现HSP90 MAb和PAb的作用存在差异，但抗体注射的总体结果与我们对免疫沉淀和体外凝胶超移实验的解释一致，并进一步证明HSP90与体内HSF1相关。

HSP90 Abs的核注射延迟了HSF1结合活性的减弱。

总之，HSP90作为靶向特定细胞底物的蛋白折叠伴侣的既定作用，与HSF1寡聚相关的已知结构变化，免疫沉淀和抗体识别实验的结果表明，HSP90和HSF1之间的联系以及微量注射HSP90 Abs激活HSF1，表明HSP90可以作为HSF1活性的调节剂。为了进一步验证这一点，我们分析了热休克反应失活阶段微注射HSP90抗体对HSF1 DNA结合特性的影响。由于HSF1-HSE复合物在卵母细胞长期热休克处理过程中无限期持续存在(19)，我们无法在持续应力期间监测HSF1失活。相反，我们比较了未注射和HSP90 Ab注射的卵母细胞在18°C下从33°C热休克中恢复时HSE结合的衰减。如图所示。​图5，5与未注射对照组相比，微量注射HSP90单克隆抗体导致HSE结合活性衰减显著延迟。本实验结果表明，HSP90体内伴侣能力的破坏降低了HSF1三聚体的分解率。因此，除了抑制三聚，HSP90在HSF1三聚反转步骤所需的构象变化中也起作用。

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图5

HSP90 Abs可延迟体内HSF1的失活。将未注射或HSP90 MAb注射的卵母细胞在33°C下热休克1 h（HS），然后在18°C下恢复指定的时间段，并通过凝胶迁移率变化分析HSF1的HSE结合活性。热诱导和超移络合物在左侧均表示为HSF1。ns，非特异性结合活性。

HSP90 Abs抑制HSF1介导的转录热休克蛋白70发起人。

HSF1的转录激活结构域是独立于三聚作用而调节的，并且已经假设完全诱导需要额外的构象变化(21,59,76). 我们假设HSP90-HSF1相互作用也可能对热诱导转录产生功能影响。为了研究这种可能性，我们测量了HSP90 Abs对热诱导表达的影响热休克蛋白70-CAT报告员构建。核注射HSP90 Abs导致热诱导CAT活性显著降低（图。​（图6A）。6A） ●●●●。对HSF1介导的CAT表达的负面影响表明，体内抗体与HSP90的结合可能会在热休克条件下破坏HSF1的反式激活。为了排除注射HSP90 Abs对转录和/或CAT具有普遍抑制作用的可能性，对CMV-CAT报告结构进行了平行实验（图。​（图6A）。6A） ●●●●。结果表明，CMV启动子的表达不受HSP90抗体的影响。在额外的对照实验中，我们评估了HSF1抗体对热休克诱导的热休克蛋白70-CAT.类别。结果表明，HSF1抗血清下调了CAT活性（图。​（图6B），6B） 和HSP90单克隆抗体一样，CMV启动子的表达不受HSF1抗血清的影响。因此，HSP90和HSF1抗体的负作用似乎是HSF1特有的。基于这些表达分析，我们认为HSP90 Ab与体内HSF1-HSP90杂合物的相互作用阻碍或抑制了HSF1的物理变化，而HSF1是获得热休克反应的完全转录能力所必需的。我们没有排除注射Abs的抑制作用是通过与不复杂的HSP90分子相互作用发挥的可能性。也有可能HSP90在转录激活前必须与HSF1三聚体分离，因此Abs可能对HSF1激活域的构象变化具有空间抑制作用。

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图6

微量注射HSP90抗体可抑制HSF1的热诱导转录活性。（A） 微量注射的卵母细胞CAT测定热休克蛋白70-CAT（左）或CMV-CAT（右）。在热休克（33℃持续1 h）处理（HS）前1 h向卵母细胞注射HSP90 MAb，并直接将每个启动子的表达与未注射Ab的类似处理卵母细胞的表达进行比较。每个实验用不同批次的卵母细胞重复至少五次，得出类似的结果。非乙酰化（Cm）和乙酰化（Ac）形式的位置[¹⁴C、 ]氯霉素显示在每个面板的左侧。背景：右侧面板显示了非质粒注射卵母细胞的CAT活性（续）。NS，无热休克。（B） 如上所述，用报告物微量注射卵母细胞进行CAT分析。将HSF1 PAbs注射到卵母细胞核中，基本上如上文所述。

GA对HSF1 DNA结合和转录活性的影响。

为了排除微量注射抗体的潜在伪影，我们通过一种涉及GA治疗细胞的替代方法检测了HSP90在调节HSF1活性中的作用。GA是一种已知可阻断HSP90功能的真菌苯醌类安息霉素(65,71). GA在ATP-结合域特异性结合HSP90(22,51,67)并防止HSP90介导的蛋白质复性(24,56,68). 研究表明，GA可以抑制许多蛋白质的HSP90依赖性活性，包括糖皮质激素受体和pp60^{v（v）-型钢混凝土}(71)，Src家族激酶p56^lck公司(23)，Raf激酶(57)，和黄体酮受体(65).

卵母细胞在添加GA（10μg/ml）的培养基中孵育2h，用标记HSE的凝胶位移法分析HSF1的DNA结合活性。如图所示。​图7A，7A、 单独GA处理不能激活HSF1。我们没有观察到GA在非电击温度下诱导HSF1，即使在长时间暴露长达数小时或急性暴露于高达100μg/ml的GA浓度后（数据未显示）。在没有热休克的情况下，GA未能诱导HSE结合，这表明GA在体内对HSP90的抑制不足以导致HSF1三聚体化。然而，在热休克实验中，在30°C的热休克30分钟之前，GA处理（10μg/ml）2小时导致HSF1-HSE复合物诱导水平相对于相同应激对照组显著增加（图。​（图7A）。7A） ●●●●。在热休克5分钟至1小时的诱导期内，在几个不同的时间点观察到HSE结合活性升高。

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图7

（GA）增强HSF1的热诱导HSE结合活性并延迟恢复过程中的失活。（A） 卵母细胞在每毫升10μg GA（g）或DMSO（D）中孵育2小时，或在30°C下进行热休克前未经处理（U），孵育时间为指定时间。然后通过凝胶迁移率变化分析比较HSF1的HSE结合活性。（B） 如上所述用GA或DMSO处理的卵母细胞的凝胶迁移率变化分析，在33°C下热休克1小时，然后在18°C下恢复指定的时间段。激活的HSF1和非特异性（ns）条带的位置显示在每个面板的左侧。

GA处理的卵母细胞中HSF1的激活增强可能归因于热休克与GA联合的协同作用，或者归因于GA抑制HSP90介导的解离导致寡聚平衡向HSF1三聚体形成的转变。为了区分这些可能性，我们研究了GA在热休克反应的失活阶段对HSF1的DNA结合特性的影响。恢复实验的结果一致表明，与未经处理的对照组相比，经GA处理的卵母细胞中HSF1的失活延迟（图。​（图7B）。7B） ●●●●。值得注意的是，即使经过严格的热处理，卵母细胞内源性HSF1的HSE结合在恢复后5至15分钟内恢复到控制水平(19). 因此，GA在体内破坏HSP90的伴侣活性似乎会降低HSF1三聚体的分解率。GA回收实验的结果与HSP90 Ab注射的结果相似，这些数据表明HSP90在控制与HSF1从三聚体转化为单体相关的构象变化方面发挥作用。然而，从这些实验中，我们无法确定GA和HSP90 Abs是通过抑制HSP90分子在HSF1复合物中的功能来直接发挥作用，还是通过抑制未与HSF1稳定复合的HSP90的功能来间接发挥作用。

接下来，我们使用GA检测HSP90-HSF1相互作用对热诱导转录的功能意义。微注射表达热休克蛋白70-比较了未经处理和GA处理的卵母细胞在无休克和热休克条件下构建的CAT报告子（图。​（图8）。8). 结果表明，与未经处理的对照组相比，经GA处理的卵母细胞中热诱导CAT活性显著降低。因此，GA抑制HSF1介导的CAT表达与微注射HSP90 Abs的结果相似。在与微注射CMV-CAT报告基因结构的平行实验中，GA不影响表达（图。​（图8），8)从而排除了GA对卵母细胞中转录和/或CAT活性具有普遍抑制作用的可能性。微注射Abs和GA的表达实验结果强烈表明，HSP90在调节HSF1转录激活域的构象变化中发挥作用。

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图8

GA抑制HSF1的热诱导转录活性。CMV-CAT的CAT活动-或热休克蛋白70-比较未经处理或经GA（10μg/ml，2 h）处理的CAT注射卵母细胞在18°C（NS）或热休克（HS）（33°C，2h）下孵育前的情况。每个实验用不同批次的卵母细胞重复至少五次，产生相似的结果。非乙酰化（Cm）和乙酰化（Ac）形式的位置[¹⁴C] 左边是氯霉素。

讨论

HSF1是研究最深入的真核转录因子之一。许多报告描述了不同生物体HSF1分子的功能域和固有特性，寡聚和磷酸化状态的变化，与HSP70的相互作用，以及不同应激信号对HSF1的激活。尽管对这些事件有所了解，但细胞调节HSF1的确切机制尚待确定。这项研究是理解HSF1调控的重要一步。以前有人根据HSP90-HSF1在体外形成的杂合物推测，HSP90可以调节HSF1的活性(42,43)这是一个在这项工作之前还没有被证实的想法。这项分析的结果，使用了由爪蟾卵母细胞模型系统，明确了HSP90与体内内源性HSF1之间的物理联系，并提供了证据表明HSP90具有调节HSF1寡聚化和诱导转录活性的功能。

HSP90-HSF1杂合物的存在得到了几个独立证据的证实，包括在热休克和对照细胞的HSF1抗体免疫沉淀材料中检测到HSP90，HSP90抗体定向诱导HSE结合活性，HSP90-Ab定向热激活HSF1在体内外的超移，以及用GA或微量注射Abs破坏HSP90后HSF1结合活性的延迟失活。结果表明，HSP90抗体在没有热休克的情况下诱导HSF1，并在体内靶向HSP90后延迟HSF1失活，表明HSP90有助于抑制三聚体形成和HSF1三聚体解体所需的构象变化。此外，微注射HSP90 Abs的独立实验和GA的细胞处理显示了对HSF1热诱导转录活性的特定影响。虽然我们还没有直接证实这些发现的普遍性，但我们假设HSP90-HSF1相互作用和HSP90的明显调节作用并不是唯一的爪蟾卵母细胞；事实上，HSP90-HSF复合物必须存在于其他细胞中的可能性因这些分子的进化保守性以及先前关于HSP90-HSF在人类细胞提取物或网织红细胞裂解物中相互作用的报道而得到加强(42,43). 同样值得注意的是Farkas等人最近的观察结果(16)与细菌表达的HSF1共纯化的94-kDa蛋白；我们的结果提示这可能是HSP90。

基于本文提供的证据和之前报道的HSF1和HSP90分子的特性，我们提出了一个调控模型，其中HSP90在激活-去激活途径的不同点上作为HSF1特异性伴侣发挥作用：在无应激条件下维持单体构象，反式激活潜能的诱导，以及三聚体在应激后分解为非DNA结合状态（图。​（图9）。9). 该模型预测HSP90在激活-去激活途径的不同点与HSF1相关，并通过与HSF1的相互作用直接发挥其调节作用。该模型还预测，除了协调HSF1寡聚化的动态变化外，HSP90还可能参与转录激活域的揭开。先前的研究表明，羧基末端转录激活子结构域的调控独立于寡聚作用(21,31,46,59,76). 对GA和微量注射HSP90 Abs的HSF1依赖性转录的影响表明，这一步骤至少可以部分由复合HSP90调节。必须强调的是，当前模型并不排除HSP70参与控制HSF1活动。相反，HSP70和HSP90更有可能在这方面发挥协调作用。HSPs对HSF1的协同和/或协调调节的想法与之前在大伴侣复合体中对HSP70和HSP90的鉴定一致(63,64)HSF1能够组装HSP90、HSP70和细胞质分子伴侣机制的几个组成部分，最近证明HSP70与激活域结合并负调控转录(61).

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图9

HSP90调节HSF1的模型。我们的数据表明，HSP90与HSF1的非活性单体和活性三聚体形式相互作用，并可能参与调节这些形式（A和C）之间的相互转化。HSP90 Abs和GA均延迟三聚体分解并抑制HSF1（D）的热诱导转录。这些观察结果表明HSP90在调节转录激活域（B）中发挥作用，或者HSP90与三聚体分离是转录能力所必需的。我们还假设HSP90可以将HSF1连接到细胞信号分子（B）。HSF1结构的细节未显示，尽管从圆形到椭圆的形状变化旨在表明与三聚相关的构象变化。没有给出HSP90和HSF1之间一对一化学计量关系的数据，这只是为了简单起见。虽然HSP70在这里没有表示，但我们并不暗示它不参与任何这些过程。

除了提供一个可以解释HSP90的HSF1调节功能的机制框架外，图。​图99描述了HSF1与不同信号通路联系的假设机制。我们提出假设，HSP90作为细胞应激检测机制的一个组成部分发挥作用，将HSF1连接到细胞信号分子。我们认为，这可能是通过HSP90-HSF1杂合物与其他HSP90相关的细胞激酶或其他调节分子之间的短暂或反复相互作用实现的。或者，HSF1可以与HSP90和其他分子组装成大的异聚物；然而，据我们所知，这些还没有通过生物化学方法在体内检测到。我们提出的HSP90分子与HSF1复合物和细胞信号分子之间同时相互作用的建议提供了一种似是而非的机制，通过这种机制，参与调节细胞应激激活-去激活途径的信号分子可以特异性地呈现给HSF1。HSP90同型二聚体的形成(38)与这个想法是一致的。

HSP90 Abs对HSF1-HSE复合物的特异性识别在体内（Abs注入卵母细胞核）和体外（Abs加入DNA-结合反应混合物）均得到证实。此外，HSF1的活性和非活性形式都与热休克和非休克核提取物中的HSP90免疫共沉淀。这些结果与之前的发现一致，即固定化HSP90和未固定化HeLa细胞核提取物中HSF之间存在相互作用(42)以及在无细胞网织红细胞裂解物组装系统中HSP90和细菌表达的HSF1之间(43)，但它们与其他研究的结果相反，在这些研究中，免疫沉淀没有检测到HSF1-HSP90的相互作用(53)或超位移分析(5); 使用不同的抗体可以解释这种差异。对我们结果的最简单解释是，核HSP90分子的一个子集存在于与非活性HSF1单体的杂合物中，并与三聚体保持关联。在非休克和热休克条件下等量HSP90的共免疫沉淀表明HSP90-HSF1杂合物的形成与HSF1的寡聚状态无关。还有待确定的是HSP90和HSF1单体和三聚体之间的相对亲和力以及这些分子之间的化学计量关系。同样令人感兴趣的是HSP90在整个激活和失活过程中是否仍然与HSF1相关，或者HSP90是否在通路的每一步与HSF1反复和瞬时相互作用。

HSP90 Abs核注射后在非休克条件下诱导HSF1的HSE结合活性，尽管不是GA处理后，导致我们假设HSP90作为分子伴侣参与HSF1单体的折叠，要么建立非活性HSF1单体分子内疏水相互作用的形成，要么保持单体构象。有趣的是，未锁卵母细胞中HSP90抗体诱导的HSE-结合活性似乎没有发生超转移，这表明这种热休克诱导的依赖性激活可能是抗体与未折叠HSP90相互作用的结果。为什么HSP90 Abs而GA在非应激细胞中诱导HSF1？据推测，抗体与某些表位的结合足以通过直接与HSF1-HSP90杂合物中的分子相互作用或间接与未与HSF1络合的HSP90相互作用来抑制HSF1的明显HSP90介导的抑制。GA处理未能激活HSF1的事实并不一定与HSP90在HSF1单体折叠或抑制中的潜在作用相矛盾。GA结合HSP90的ATP结合域，并被假设抑制底物释放或导致底物降解(22,24,51,56,67,68)，不会必然导致三聚体化的影响。

虽然HSP90与非活性单体之间相互作用的功能含义尚不清楚，但恢复实验表明HSP90和HSF1三聚体的分解之间存在明确的关系。GA治疗和核注射HSP90 Abs均显著延迟热休克恢复过程中HSF1的失活。HSP90可能通过一些潜在机制调节HSF1齐聚的逆转。一是HSP90起到稳定HSF1三聚构象的作用，必须在转化为单体形式和HSE结合失活之前释放。或者，HSP90可以在整个拆卸过程中与HSF1保持络合，并调节与同源三聚体转化为单体相关的构象和折叠变化。在这两种情况下，GA延迟HSF1失活可能是由于抑制HSP90的ATP酶活性，但HSP90 Abs抑制体内HSP90功能的机制尚不清楚。有趣的是，在凝胶迁移率变化试验中检测到的HSP90 Ab诱导的HSF1-HSE复合物没有发生超转移。因此，我们没有排除GA或HSP90Abs可能通过影响与HSF1不复合的HSP90分子的伴侣活性而间接发挥其作用的可能性。

本研究的另一个关键发现是体内靶向HSP90后抑制热诱导转录。HSF1的这种转录抑制不太可能是人为的，因为它是通过两种独立的方法复制的，即微量注射HSP90 Abs和用GA处理细胞。结果表明，HSP90通过注射Abs进行物理结合，或通过GA破坏其ATP酶结构域，在某种程度上阻断了HSF1反式激活结构域的构象变化。因此，我们认为HSP90的伴随功能可能直接参与激活途径的这一步骤，但尚未证实。该功能与已知的HSP90与其他细胞蛋白和转录因子（如MyoD）的伴侣作用完全一致(58). 与HSP90抗体或GA延迟失活的情况类似，我们尚未确定这些药物是通过干扰与HSF1复合的HSP90分子的功能来直接抑制转录，还是通过与非复合HSP90池的相互作用来间接抑制转录。此外，HSP70等其他因素(61)或者各种信号转导分子可能参与调节转录激活域。

表达实验的结果存在两个明显的矛盾：（i）在热休克条件下，GA处理增强了HSF1的HSE结合活性，同时降低了转录活性；（ii）在非休克条件下，HSP90抗体注射诱导HSP70启动子HSF1介导的转录水平相应增加，但未诱导HSE结合。可以说，这些结果反映了（i）三聚和DNA结合以及（ii）反式激活的独立调节(21,59,76). 事实上，HSF1的DNA结合和转录活性在爪蟾卵母细胞(6).

GA和HSP90 Abs对HSF1转录活性的抑制观察表明，HSP90与三聚体的分离是转录激活的必要前提，而不是HSP90在调节HSF1转录能力中的直接作用。在这种情况下，HSP90 Abs或GA引起的转录活性降低可能是抑制HSP90释放和空间位阻转录激活域修饰的结果。在我们对卵母细胞的实验中，这些试剂可能起到了稳定激活途径中转录无能中间体的作用。然而，不管这些实验的解释如何，很明显HSP90参与了HSF1的转录激活。这一作用的确切细节可能需要更多关于这两种蛋白质在整个激活-去激活途径中的化学计量关系的知识。

总之，本文提供的数据为HSP90在HSF1调节中的作用提供了第一个明确的证据。这项研究提出了一些关键问题。例如，HSP90-HSF1相互作用的分子基础是什么，HSP90-HSF1相互作用在整个应激反应中的动力学是什么？ATP水解和HSF1过度磷酸化是否影响这些分子之间的物理联系，或者HSP90是否通过与其他因素的相互作用来协调HSF1磷酸化？HSP70和HSP90是否协同调节HSF1活性，是否与其他分子有关？研究HSP90在协调应激诱导HSF1相关的物理变化中的确切作用，并确定HSP90是否在用于感受应激和协调细胞活动适当变化的信号通路中发挥作用，将是一件有趣的事情。

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参考文献