跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
感染免疫。1998年11月；66(11): 5089–5098.
数字对象标识：10.1128/iai.66.11.5089-5098.1998
预防性维修识别码：项目经理108634
PMID：9784508

肝细胞CD14的表达：内毒素血症时细胞因子的上调

刘舒冰,1,* Lajwanti S.Khemlani公司,2 理查德·A·夏皮罗,1 马克·约翰逊,1 刘开红,1 大卫·A·盖勒,1 西蒙·沃特金斯,三 桑娜·戈耶特,2和蒂莫西·比利尔1
编辑：J.R.McGee
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

研究旨在检测内毒素血症期间肝细胞CD14的表达。我们的结果表明，体内脂多糖（LPS）治疗导致大鼠肝细胞CD14 mRNA和蛋白水平显著上调。LPS治疗后1.5小时，mRNA显著增加；这些增加在3小时达到20倍的峰值，24小时恢复到基线水平。原位杂交将CD14 mRNA表达定位于体内外肝细胞。肝脏CD14蛋白水平在3 h时可检测到增加，12 h时达到峰值。LPS处理动物的肝细胞表达更多的细胞相关CD14蛋白，LPS处理大鼠的肝细胞在体外释放更多的可溶性CD14。内毒素血症期间肝细胞CD14表达的增加与血浆中CD14水平的增加平行。为了提供肝细胞CD14的分子鉴定，我们克隆了大鼠肝脏CD14 cDNA。最长的克隆由1591bp的插入片段组成，该插入片段包含1116bp的开放阅读框。推导的氨基酸序列长372个氨基酸，分别与小鼠和人类CD14的氨基酸序列同源81.8%和62.8%，与大鼠巨噬细胞CD14相同。从该克隆中表达的CD14蛋白具有功能性，如NF-κB对LPS和稳定转染大鼠CD14的CHO细胞中的异硫氰酸荧光素-LPS结合的反应活化所示。核连续试验表明，LPS处理的动物肝细胞中CD14转录率显著增加，表明LPS处理后大鼠肝细胞中观察到的CD14 mRNA水平上调在一定程度上取决于转录的增加。体外和体内实验表明，白细胞介素-1β和/或肿瘤坏死因子α参与肝细胞CD14 mRNA水平的上调。我们的数据表明，在内毒素血症期间，肝细胞表达CD14，肝细胞CD14 mRNA和蛋白水平迅速增加。我们的观察结果也支持可溶性CD14是一种急性期蛋白的观点，肝细胞可能是可溶性CD14产生的来源。

革兰氏阴性菌感染引起的败血症仍是主要的死亡原因。革兰氏阴性菌释放内毒素（脂多糖[LPS]），引起急性炎症反应（参考文献综述7). LPS通过激活LPS敏感细胞（如单核细胞和内皮细胞）释放各种细胞因子、脂质介质和自由基，对宿主产生深远影响（参考文献综述52). 在过去的十年中，在识别脂多糖识别和信号分子方面取得了很大进展。虽然已经发现了一些LPS结合和推测的信号分子，包括CD11b/CD18(66)，乙酰化低密度脂蛋白受体(23)和80-kDa受体(29)CD14被认为是最重要的LPS识别分子，负责通过LPS的病理生理水平激活细胞。CD14首先被鉴定为在巨噬细胞、中性粒细胞和其他髓系连接细胞表面表达的单核细胞分化标志物(60). 膜结合CD14（mCD14），通过糖基-磷脂酰肌醇锚定附着到细胞表面(24)，通过LPS激活巨噬细胞合成细胞因子(10). 血浆中存在浓度为3至5μg/ml的可溶性CD14（sCD14）(5,22,26). 内皮细胞对LPS诱导的反应需要可溶性CD14(27)，上皮细胞(46)和平滑的肌肉细胞(39). LPS与mCD14或sCD14的相互作用被另一种血浆蛋白LPS结合蛋白大大促进(53)被认为主要来源于肝细胞(56). 实验和临床研究表明，sCD14的血浆水平在感染或创伤期间可增加75%(35–37). 虽然白细胞脱落被认为是全身sCD14水平的主要来源，但可能存在其他来源。此外，感染期间循环中变化超过25%的血浆蛋白符合急性期反应物的定义(65)这表明sCD14的行为与其他急性期蛋白类似。

肝细胞是大多数急性期蛋白质的主要来源(65). 如果事实上sCD14是一种急性期蛋白，那么肝细胞可能会表达CD14，这在内毒素血症期间上调。此外，从内毒素血症动物分离的肝细胞对脂多糖的反应显著增强(45,61)增加了这些细胞表达CD14的可能性。为了确定肝细胞是否表达CD14，实验测量了正常和内毒素血症动物肝细胞中稳态CD14 mRNA和蛋白水平。我们在这里显示，大鼠肝细胞表达CD14 mRNA和蛋白，并且这些水平在内毒素血症期间显著上调。此外，上调受细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的调节，至少部分通过转录机制。我们的数据证明肝细胞表现出CD14的调节表达。

材料和方法

试剂。

液化石油气(大肠杆菌O111:B4）和异硫氰酸荧光素（FITC）-LPS购自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）；威廉的中号E从Gibco（纽约州格兰德岛）购买；重组人IL-6购自Genzyme（马萨诸塞州波士顿）；重组小鼠IL-1β和TNF-α来自美国国家癌症研究所（Craig Reynolds）；胎牛血清购自HyClone实验室（犹他州洛根）。所有组织培养皿和培养瓶均购自康宁（纽约州康宁）；[α-32P] dCTP和[α-32P] UTP购自NEN Life Science（马萨诸塞州波士顿）；核糖核苷酸三磷酸（ATP、GTP和UTP）和聚（A）购自Boehringer Mannheim（印第安纳波利斯）。抗NF-κB P65、P50亚单位和NF-κ）B共识寡核苷酸的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。Regine Landmann（瑞士巴塞尔大学医院研究与内科部）慷慨提供了一种仓鼠抗小鼠CD14单克隆抗体G5A10。

动物。

雄性Sprague-Dawley大鼠是从Harlan Sprague-Dawley（印第安纳州印第安纳波利斯）购买的，它们无致病性，每只重约200克。每天将大鼠暴露在光照和黑暗中12小时。随意提供啮齿动物食物和水。实验方案得到了匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。

肝细胞分离。

通过原位胶原酶（VI型；Sigma）灌注技术从正常和注射LPS的大鼠中分离肝细胞，如前所述进行了改进(54,64). 通过两次差速离心（50×克2分钟），并在30%Percoll梯度上进一步纯化。通过光学显微镜评估，肝细胞纯度超过98%，通过台盼蓝排除试验测定，肝细胞存活率通常大于95%。

细胞培养和治疗。

肝细胞（5×106)将其置于10厘米的涂胶塑料组织培养皿中。初始培养基为含有10%小牛血清（CS）的William’s培养基E，15 mM HEPES，10−6M胰岛素，2 mM我-谷氨酰胺和每毫升100 U青霉素和链霉素。肝细胞在培养皿上过夜，然后在细胞因子治疗前用无血清培养基清洗三次。在无血清培养基中进行细胞因子治疗。所有细胞因子浓度均为500 U/ml。LPS浓度为0.1μg/ml。中国仓鼠卵巢细胞（CHO；美国型培养物收集）在含有10%胎牛血清的火腿F-12培养基中培养。

总RNA分离和Northern印迹分析。

如前所述，通过RNAzol提取总RNA(61). 对于Northern blot分析，在转移到GeneScreen膜（杜邦，NEN Research Products，波士顿，马萨诸塞州）之前，通过在含有2.2 M甲醛的1%琼脂糖凝胶中电泳来解析总RNA（每道20μg）。用UV Stratalinker（加州圣地亚哥Stratagene）将mRNA交联到膜上，然后与32P标记探针。CD14的探针为1043 bp不是小鼠CD14 cDNA的I片段(15). 探针用随机素标记（Boehringer-Mannheim）标记。在含有50%去离子甲酰胺、0.25M磷酸钠（pH 7.2）、0.25M氯化钠、1mM EDTA、7%十二烷基硫酸钠（SDS）和每毫升100μg变性鲑鱼精子DNA的缓冲液中进行杂交16至18小时。在2×SSC（1×SSC是0.015 M氯化钠加0.015 M柠檬酸钠）–0.1%SDS中依次洗涤印迹，25毫摩尔NaHPO4–1 mM EDTA–0.1%十二烷基硫酸钠和25 mM NaHPO4–1 mM EDTA–1%SDS缓冲液。在暴露于X射线胶片进行放射自显影之前，在每个缓冲液中在53°C下清洗印迹15分钟两次。在与另一个探针杂交之前，去除印迹。

定量mRNA水平。

印迹上的mRNA水平用PhosphorImager（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）扫描进行定量。相对mRNA水平归一化为18S RNA。治疗组的mRNA水平表达为对照组的倍数增加。

肝细胞、全肝提取物、培养上清液和血浆中CD14蛋白的Western blot分析。

将平板上培养的肝细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，刮除，然后离心造粒。将细胞颗粒重新悬浮在50μl含有20 mM HEPES（pH 7.9）、25%甘油、0.42 M NaCl、15 mM MgCl的裂解缓冲液中2、0.2 mM EDTA、0.5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.5 mM二硫苏糖醇（DTT）。在三次冻融循环后，以12000×克30min，保存上清液。如上文所述，在冻融溶解之前，用Dounce均质机将肝组织均质化。通过心脏穿刺获取血液样本，并在1000×克在Western blot分析之前，根据制造商的说明，用Centricon-30（Amicon，Beverly，Mass.）浓缩培养肝细胞的上清液5分钟。

对于Western blot分析，样品（每道50μg）在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上。依次在含有5%牛奶的PBS-Tween（0.1%）中封闭膜，然后用每毫升5μg G5A10（仓鼠抗小鼠CD14单克隆抗体）孵育，清洗，并用山羊抗亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白g辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:5000；宾夕法尼亚州西格罗夫市杰克逊免疫研究实验室）。封闭和抗体培养在室温下各持续1小时。经过几次清洗后，用增强型鲁米诺试剂（杜邦，NEN）显影膜，并暴露于柯达X-Omat胶片。

培养肝细胞的原位杂交。

将生长在玻璃盖玻片上的肝细胞固定在PBS中的2%多聚甲醛中10分钟，渗透到含有2%多聚醛–0.01%Triton X-100的缓冲液中10分钟后，在PBS洗涤，然后在含有4%多聚甲醛的PBS中后固定。在杂交之前，用蛋白酶K（10μg/ml）处理载玻片10分钟，用0.25%醋酸酐乙酰化，在2×SSC中洗涤，并通过分级醇脱水。如前所述制备CD14的放射性标记核糖探针(68)以克隆的大鼠肝细胞CD14 cDNA为模板，如下所述。如前所述，用正、反义探针杂交、玻片冲洗和乳剂放射自显影术(49).

肝切片原位杂交。

用地高辛标记的而非放射性标记的探针对切片肝脏样品进行原位杂交。线性化大鼠CD14 cDNA模板在地高辛标记的UTP和未标记的CTP、ATP和GTP以及相关RNA聚合酶的存在下在37°C下孵育2小时。标记的RNA在乙醇中沉淀、干燥，并在焦碳酸二乙酯处理过的水中重新悬浮。整个肝脏在2%多聚甲醛中灌注固定，并在30%蔗糖中浸泡过夜进行冷冻保护。然后将整个组织冷冻在液氮冷却的异戊烷中。冷冻切片被切割（5μm），固定在PBS中2%的多聚甲醛中，在PBS内洗涤两次，用蛋白酶K消化（10 mg/ml，5 min），在含有1%甘氨酸的PBS中洗涤并乙酰化。通过分级醇脱水后，将切片在42°C的地高辛标记的CD14特异性核糖探针中杂交过夜（对照组为感测探针或无探针）。然后将切片在50%甲酰胺–2×SSC中在50°C下清洗两次15分钟，并在37°C下用RNase A消化30分钟。在50%甲酰胺-2×SSC和2×SSC中进一步连续洗涤后，将切片在Genius缓冲液I和Genius缓冲器II（Boehringer Mannheim）中洗涤，并与抗地高辛的碱性磷酸盐结合抗体孵育1小时。然后将切片在在硝基四氮唑（Sigma）中培养的Genius缓冲剂III中洗涤过夜，在PBS中洗涤，脱水，并安装在Permount中。

大鼠肝细胞核的制备。

用Boggaram和Mendelson描述的方法分离细胞核(4). 在含有0.25 M蔗糖、10 mM HEPES（pH 8.0）和10 mM MgCl的缓冲液中，用Dounce均质器将新鲜分离的大鼠肝细胞均质化2、0.1%Triton®声波风廓线仪X-100和2 mM DTT。在600×克在4°C下，通过在均化缓冲液中的1.3M蔗糖缓冲液上以10000×克最后，将细胞核重新悬浮在50 mM HEPES（pH 8.0）、40%甘油、5 mM MgCl中2、0.1 mM EDTA和2 mM DTT（108细胞核/ml），然后在液氮中快速冷冻。原子核在使用前储存在−80°C。

核试运行分析。

为了确定CD14转录率，如前所述对新生核RNA进行体外标记(4,8)，进行了一些修改。简言之，原子核（2.1×107)在300μl含有5mM Tris-HCl（pH 8.0）的反应混合物中，在30°C下孵育30分钟；2.5 mM氯化镁2; 150 mM KCl；0.25 mM（每个）GTP、ATP和CTP；25μl[α-32P] UTP（250μCi，比活度3000 Ci/mmol；NEN生命科学）；和1.0μl RNasin（40 U/μl；Promega）。根据制造商的说明，用Trizol（Gibco-BRL）从反应混合物中提取放射性标记的核RNA。在G-50 Sephadex（Pharmacia）柱上纯化标记的核RNA。

含有大鼠CD14 cDNA的线性化质粒通过插槽印迹仪（Schleicher&Schuell Minifold II；Keene，N.H.）应用于GeneScreenPlus膜（NEN Life Science）。线性化载体pBluescript和含有质粒的肌动蛋白cDNA也作为内部对照。在加载之前，用0.3 M NaOH在60°C下变性质粒1小时（每个槽5μg）。紫外线交联后，在43°C下，在含有50%去离子甲酰胺、4×SSC、2×Denhardt溶液、50 mM PIPES（pH 7.0）、2.0 mM EDTA、0.5%SDS、200μg酵母tRNA/ml、200μg/ml鲑鱼精子DNA和100μg poly（A）/ml的缓冲液中预混合至少2 h。在43°C下，在预混合所用的相同缓冲液中进行48小时的杂交，每分钟的等效计数为32每毫升添加到每个膜上的P标记探针。将膜在2×SSC–0.5%SDS中在53°C下清洗两次15 min，然后在2×SCC中短暂冲洗；然后用每毫升10μg RNase a和10 U RNase T1进行0.5小时的消化。最后，用0.1×SSC–0.1%SDS缓冲液在53°C下洗涤两次印迹15分钟。将斑点暴露在X射线胶片上进行放射自显影，并用荧光成像仪（分子动力学）测定信号强度。CD14转录率归一化为β-肌动蛋白的转录率。

IL-1ra和rsTNF-RI的体内实验。

为了测试IL-1和TNF在LPS诱导的体内CD14上调中的作用，大鼠在第0次注射溶媒（生理盐水）、LPS（10 mg/kg，静脉注射）或LPS加IL-1受体拮抗蛋白（IL-1ra；100 mg/kg，皮下注射[s.c.]，然后每6 h注射一次），I型可溶性TNF-α受体聚乙二醇连接二聚体（rsTNF-RI，1.5 mg/kg，静脉注射，时间0），或两者的组合。100 mg/kg的IL-1ra和1.5 mg/kg的rsTNF-RI是在12.5 mg/kg的LPS剂量下促进生存的最大有效剂量(51)并由James L.Vannice（科罗拉多州博尔德市Synergen公司）提供。在治疗后6小时收集肝脏，并在液氮中快速冷冻，以便随后进行RNA分离和Northern blot分析。

肝细胞CD14 cDNA克隆。

在Lambda Zap II/CIAP克隆载体中构建的急性期大鼠肝脏cDNA文库购自Stratagene。100万个斑块被印在Nytran膜上（Schleicher&Schuell），并与1043 bp杂交不是小鼠CD14 cDNA的I片段(15). cDNA探针通过随机引物标记（Boehringer Mannheim）进行标记。在上述总RNA分离条件下进行杂交和印迹洗涤。阳性斑块通过随后的两次筛查分离和纯化。载体pBluescript中包含的大鼠CD14 cDNA插入物通过与辅助噬菌体共同感染而被挽救。使用Qiagen-Maxiprep柱（加利福尼亚州查茨沃斯）制备质粒DNA。用ABI自动DNA测序仪（匹兹堡大学医学院的核心设施）和合适的引物进行测序。

细胞因子处理的培养人肝细胞衍生的定制cDNA文库(19)在Lambda ZapII载体中构建并筛选人类CD14克隆。人肝细胞CD14克隆程序与大鼠CD14的克隆程序相同。

大鼠CD14转染的CHO细胞与FITC-LPS的结合。

通过荧光激活细胞分选（FACS；Becton Dickinson，Mountainview，Calif.）评估异硫氰酸荧光素（FITC）-LPS与大鼠CD14转染CHO细胞的结合。用含有2mM EDTA的PBS分离培养瓶中作为单层生长的细胞，并将其重新悬浮在2%CS-PBS中。细胞（2.5×105/孔），在4°C下用每毫升2.5μg FITC-LPS和100μl含0.1%叠氮化钠的10%CS-PBS在V型底部96个平板中培养1小时。仅用10%CS-PBS培养的细胞作为对照。细胞清洗后用FACS进行分析。

电泳迁移率变化分析。

核提取物的制备如前所述(31). 用PBS清洗细胞，将其重新悬浮在五粒体积的缓冲液a中（10 mM HEPES，pH 7.9；10 mM KCl；1.5 mM MgCl2; 0.5毫米DTT；0.2 mM PMSF；0.5%Nonide P-40），然后在冰上孵育15分钟，然后在Dounce均质器中进行10次敲击。用缓冲液B清洗细胞核一次（与缓冲液A相同，但不使用Nonide P-40）。通过在150μl缓冲液C（20 mM HEPES，pH 7.9；10 mM KCl；1.5 mM MgCl）中轻轻重新悬浮细胞核来提取核蛋白2; 10%甘油；0.2 mM乙二胺四乙酸二乙酯；0.5毫米DTT；0.2 mM PMSF）和50μl缓冲液D（与缓冲液C相同，但使用400 mM KCl）。缓冲区D以滴状方式添加。在4°C的缓冲液C和缓冲液D中轻轻摇动细胞核1 h后，通过13000 rpm离心30 min收集上清液。双标NF-κB特异性寡核苷酸用[γ-32P] 使用T4多核苷酸激酶（USB，克利夫兰，俄亥俄州）并在G-50葡聚糖凝胶自旋柱上纯化ATP。核蛋白（每道10μg）用约40000 cpm的32在含有2μg聚（dI-dC）、4.2 mM HEPES（pH 7.4）、2.5%甘油、4.2 mM-KCl、1 mM MgCl的缓冲液中，在室温下将P标记的寡核苷酸放置20分钟2，0.02mM EDTA，2%Ficoll和21mM DTT（最终体积，30μl）。对于超移分析，将2μg抗体添加到反应混合物中，并在室温下将反应再培养30分钟。DNA-蛋白复合物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上在0.5×Tris-borate-EDTA缓冲液中溶解。然后干燥凝胶并进行放射自显影。

统计分析。

数据表示为平均值±标准误差（SE）。使用Statview统计软件（Abacus Concept，Inc.，Berkeley，Calif.）对实验结果进行方差分析，以确定其显著性。在P（P）值<0.05。

结果

肝细胞表达CD14 mRNA，在内毒素血症期间上调。

我们假设肝细胞可以表达CD14，在内毒素血症期间CD14可能上调。向大鼠注射LPS（10 mg/kg，腹腔注射[i.p.]），并在图中所示的时间点从新分离和纯化的肝细胞中提取总RNA。​图1。1Northern blot分析显示，从对照组分离的肝细胞CD14 mRNA水平较低，但可检测到，在长时间暴露后，CD14 mRNA显示为1.6-kb的转录物（数据未显示）。LPS治疗增加了肝细胞稳态CD14 mRNA水平，在LPS治疗后的1.5小时内诱导了9倍的升高。水平随时间增加，在治疗后3小时达到最大诱导（20倍），随后在24小时下降到接近基线水平。我们还检测了内毒素血症期间从整个肝脏分离的RNA中的CD14 mRNA水平（图。​（图2）2)并发现LPS诱导CD14mRNA的模式与分离的肝细胞的模式相似，表明CD14mRNA的上调不可能仅仅是肝细胞分离过程的结果。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为ii1181331001.jpg

内毒素血症期间肝细胞CD14 mRNA诱导的时间进程。向Sprague-Dawley大鼠注射LPS（10 mg/kg，i.p.）。分别在1.5、3、6、12和24小时从LPS治疗组或对照组大鼠中分离肝细胞。提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。用18S rRNA探针对膜进行再杂交。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并呈与对照组相比的倍数增加。每列代表每个时间点三份样品的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331002.jpg

LPS注射后肝组织中稳定状态的CD14 mRNA水平。向Sprague-Dawley大鼠注射LPS（10 mg/kg，i.p.）。LPS注射后1.5、3、6、12和24小时从肝脏中提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。用18S rRNA探针对膜进行再杂交。条形图显示CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并显示为对照组的倍数增加。Northern印迹来自一个有代表性的实验。每列代表三个独立实验的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。

CD14原位杂交。

肝脏中含有大量巨噬细胞，这些巨噬细胞可以提供CD14 mRNA的来源。为了确保CD14 mRNA确实在肝细胞中表达，对LPS治疗大鼠的分离肝细胞和全肝切片进行原位杂交。与Northern杂交结果一致，在培养的单个肝细胞中很容易检测到CD14 mRNA（图。​（图3A三A和B）和完整肝脏切片（图。​（图3C三C和D）。从LPS处理的动物中分离出的大鼠肝细胞显示出强烈的细胞质标记（图。​（图3A）。三A） ●●●●。在LPS治疗大鼠的肝切片上进行原位杂交（图。​（图3C）三C） 在肝细胞中也显示出强烈的标记。在对照肝脏中，只看到少数标记细胞（图。​（图3D）。三D） ●●●●。值得注意的是，在靠近血管系统的细胞中标记最强烈（无论是门静脉还是肝三联体）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331003.jpg

CD14 mRNA在大鼠原代肝细胞和肝切片中的定位。将在盖玻片或肝组织切片上生长的肝细胞与CD14的反义和正义核糖探针进行原位杂交。（A） 单个大鼠原代肝细胞的差异干涉对比图像（尺寸条表示20μm）。（B） 原位信号的暗场视图(35S） ●●●●。从LPS治疗的大鼠（10 mg/kg，静脉注射，24小时治疗）分离出的原代肝细胞显示出强烈的细胞质标记。在下面的面板中，显示了在LPS治疗（C）和正常（D）大鼠的切片肝脏上进行的原位杂交。地高辛标记的核糖探针和比色技术检测到的信号显示血管周围单个肝细胞中有标记，在本例中为门静脉三联体。（原始载玻片上的阳性细胞为蓝色，如图所示为黑色。）阳性细胞的数量随着与血管系统的距离而减少。在对照肝脏（D组）中，很少或没有阳性标记的细胞。感测探针几乎没有标记（未显示数据）。

CD14蛋白表达与肝脏CD14mRNA表达上调相关。

为了确定CD14表达的上调是否也能在蛋白质水平上得到评价，对对照组或LPS治疗组动物的全肝和血浆样品进行了Western blot分析。亲代CHO细胞和新转染CHO细胞的全细胞提取物作为阴性对照，大鼠CD14-转染的CHO细胞作为阳性对照。如图所示。​图4，4大鼠CD14转染CHO细胞的全细胞提取物与抗小鼠CD14单克隆抗体表现出较强的交叉反应性，而亲代CHO细胞或新转染的CHO细胞则没有。两种肝匀浆（图。​（图4A）4A） 和等离子体（图。​（图4B）4B） 显示了分子量约为50kDa的CD14样条带，与阳性对照组对齐。CD14的多种亚型的出现与CD14是一种高度糖基化蛋白的事实一致(19). 在全生命提取物中，在LPS处理后3 h，CD14蛋白表达增加，在12 h达到峰值，随后下降（图。​（图4A）。4A） ●●●●。在血浆中观察到sCD14的类似瞬时增加（图。​（图4B）。4B） ●●●●。为了确定LPS处理后肝细胞表达并释放更多CD14，对分离的肝细胞进行Western blot分析。LPS治疗后12小时，LPS治疗大鼠新鲜分离肝细胞的裂解液中含有的CD14多于对照细胞（图。​（图5A，5A、 第1和第2车道与第3和第4车道）。LPS治疗大鼠的细胞继续表现出较高的CD14水平（图。​（图5A，5A、 与对照肝细胞相比（图。​（图5B，5B、 车道1和2与车道3和4）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331004.jpg

内毒素血症期间全肝提取物（A）和血浆（B）中CD14蛋白水平的Western blot分析。制备LPS治疗大鼠1.5、3、6、12和24 h（10 mg/kg，i.p.）或对照大鼠的全肝和血浆样品。亲本CHO细胞和新转染的CHO细胞的全细胞提取物用作阴性对照，大鼠CD14转染的CHO细胞用作阳性对照。蛋白质（50μg全肝匀浆或血浆，每道1μg重组蛋白）在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上。为了检测CD14蛋白，将仓鼠抗小鼠CD14单克隆抗体（G5A10）与膜在5μg/ml的浓度下孵育1小时。按照制造商的说明，使用增强鲁米诺试剂（杜邦，NEN）检测免疫复合物。这些斑点是至少三个独立实验的代表。缩写：CHO/rCD14，稳定转染大鼠CD14 CHO细胞；CHO/neo，稳定的新转染CHO细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为ii1181331005.jpg

（A） 新鲜分离和培养肝细胞中CD14蛋白水平。Western blot程序和缩写如图所示。​图4。4。每组包含来自单个动物的重复样品。通道1和通道2，新鲜分离的对照肝细胞；第3和第4通道，LPS治疗大鼠新鲜分离的肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12小时治疗）；第5、6道，对照组肝细胞放置24h；通道7和8，LPS处理大鼠培养肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12 h处理），24 h后进行电镀。（B）肝细胞培养上清液中的CD14蛋白水平。每组包含来自个体动物的重复样本。通道1和通道2，对照肝细胞电镀24小时；第3道和第4道，LPS治疗大鼠培养肝细胞（10 mg/kg，腹腔注射，12 h治疗）放置24 h。这些数据是三个独立实验的代表。

大鼠肝细胞CD14 cDNA的克隆和序列分析。

费雷罗及其同事报道了人类和啮齿动物CD14 cDNA核苷酸序列(14,15)和其他(42). 这些克隆是从单核细胞或巨噬细胞建立的文库中分离出来的。报道了从星形胶质细胞文库中分离出的部分大鼠CD14 cDNA克隆(17)，从大鼠巨噬细胞中克隆了全长CD14 cDNA(57). 为了确定大鼠肝细胞CD14的分子特性，我们用1043 bp的小鼠CD14 cDNA高度筛选了急性期大鼠肝cDNA文库不是我的碎片。共10个屏幕6斑块产生多个重叠的cDNA克隆。最长的克隆包含1591 bp的插入片段。该片段包含一个65-bp 5′非翻译区（5′-UTR）、一个1116-bp的蛋白编码区完整部分和一个410-bp 3′-UTR。我们的大鼠肝细胞CD14序列（核苷酸1至1508）与已发表的大鼠巨噬细胞CD14 cDNA序列（核苷酸40至1547）完全匹配(57); 因此，这里不显示序列。翻译起始位点被指定为核苷酸66到68的第一个ATG三联体，因为起始密码子的两侧有一个序列（CGACCATGC），该序列与Kozak定义的功能起始密码子[C（C）a/GCCATGG]的一致序列只有一个核苷酸不匹配(34). TAA终止密码子位于1181位。因此，这个开放阅读框可以编码372-氨基酸初级翻译蛋白。AUUUA序列的一个拷贝，这是在许多炎症相关基因中发现的一个常见的mRNA不稳定序列(6)位于3′-UTR内。在1393到1398和1491到1496位置分别发现了两个推测的聚腺苷酸化信号（AAUAAA），后者被聚腺苷酸尾部下游7 bp处跟踪。

推导出的氨基酸序列包含五个假定N个-符合标准Asn-X-Ser序列的糖基化位点和在潜在切割位点之前的疏水区（数据未显示）。大鼠CD14 cDNA编码一种与小鼠CD14类似的多肽（GenBank访问号M34510型)氨基酸序列同源性为81.8%。大鼠和人CD14氨基酸序列的比对（GenBank访问号X06882型)同源性为62.8%。我们还筛选了一个来源于细胞因子刺激的纯化人肝细胞的cDNA文库(19). 对11个阳性克隆中的2个进行了测序。序列比对（数据未显示）显示与已发表的人类单核细胞CD14几乎一致（96%）(14). 综上所述，这些数据强烈表明肝细胞表达与巨噬细胞相同的CD14。

克隆大鼠CD14 cDNA的功能分析。

对表达的大鼠CD14蛋白进行功能分析。将1591bp全长大鼠CD14 cDNA插入pcDNA3载体（Invitrogen，San Diego，CA）中巨细胞病毒启动子的下游，并通过Northern印迹分析用于转染缺乏CD14表达的CHO细胞（数据未显示）。通过G418筛选和限制稀释建立稳定转染细胞系。选择一个克隆（CHO/rCD14），Northern blot分析显示CD14 mRNA表达丰富（数据未显示）。流式细胞术分析显示，CHO/rCD14细胞也与仓鼠抗小鼠CD14单克隆抗体G5A10有很强的结合(35年). FITC-LPS结合试验显示LPS与CD14转染细胞的结合显著增强，血清是FITC-LBS结合的限制因素（图。​（图6）。6). 过量的非标记LPS可以抑制结合（图。​（图7）。7). 这些观察结果与膜结合CD14的LPS结合特性一致(32,59).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331006.jpg

FITC-LPS与CHO/rCD14细胞的血清依赖性结合。按照材料和方法中的描述对细胞进行染色，并进行流式细胞术分析。显示了结合缓冲液中的血清浓度和FITC-阳性细胞的百分比。开放直方图表示FITC-LPS染色。x轴，对数荧光强度；年轴，单元格编号。在CHO-K1和CHO/neo细胞中未发现FITC-LPS染色（数据未显示）。这些数据代表了至少三个独立实验。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331007.jpg

过量天然形态LPS与CHO/rCD14细胞结合的FITC-LPS竞争。结合缓冲液是含有10%CS和0.1%叠氮化钠的PBS。显示了在结合缓冲液中添加的天然形态LPS的折叠过剩和FITC-阳性细胞的各自百分比。开放直方图表示FITC-LPS染色。x轴，对数荧光强度；年轴，单元格编号。这些数据代表了三个独立的实验。

以前的研究表明，将人或小鼠CD14 cDNA转染到CHO细胞中，可使细胞对LPS对NF-κB核转位产生反应(9,21,67). 如图所示。​图8，8，CHO/rCD14细胞对低浓度LPS有血清时为1 ng/ml，无血清时为30μg/ml。因此，大鼠CD14以与人类和小鼠CD14相似的方式调节LPS的血清依赖性反应(8,21,48). 反应最早可在30分钟检测到，并在60分钟达到峰值（数据未显示）。NF-κB移位带的特异性通过低温和突变寡核苷酸竞争得到证实。特异性NF-κB亚基抗体的超位移分析表明，这种DNA-蛋白质结合复合物至少含有p50 NF-κB亚基。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331008.jpg

在血清和无血清条件下，LPS在CHO/rCD14细胞中激活NF-κB。实验按照材料和方法中的描述进行。在提取核蛋白之前，用不同剂量的LPS处理细胞。除CHO/neo细胞（0.1μg/ml）外，显示了治疗用LPS的剂量。缩写：CHO/neo，稳定新转染的CHO细胞；p65抗体，抗NF-κB p65亚单位抗体；p50抗体，抗NF-κB p65亚单位抗体。这些数据代表了两个独立的实验。

体内LPS对肝细胞CD14 mRNA水平的增加在转录水平上进行调节。

为了确定转录是否在LPS体内大幅度增加肝细胞CD14表达中起作用，从对照组和LPS处理组大鼠的肝细胞中分离细胞核，进行核连续试验。将细长的新生RNA与含有固定在膜上的CD14 cDNA的质粒杂交。包含β-肌动蛋白cDNA的质粒和载体pBluescript作为内部对照。CD14的转录速率归一化为β-肌动蛋白的转录速率。如图所示。​图9，9，在对照肝细胞的细胞核中观察到CD14的基础转录。然而，在LPS治疗大鼠分离的肝细胞核中，CD14的转录率在1.5和3.0小时分别增加了3.2倍和2.6倍(P（P）< 0.05). LPS处理6小时后，CD14的转录水平下降，24小时时几乎恢复到基本水平（数据未显示）。因此，内毒素血症期间CD14 mRNA水平的上调涉及转录的增加。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331009.jpg

LPS处理大鼠肝细胞核的核连接性分析。对照组或注射LPS的大鼠的细胞核与[α-32P] UTP延长新生RNA。将延长的新生RNA与含有CD14 cDNA的质粒杂交，该质粒固定在GeneScreen plus膜（Dupont，NEN）上，使用插槽印迹仪（5μg/每个插槽）。每分钟的等效计数32将每毫升P标记的核RNA探针添加到每个膜中。包含β-肌动蛋白cDNA的质粒和空载体pBluescript作为内部对照。CD14转录率用荧光成像仪定量，并归一化为β-肌动蛋白的转录率。每列代表重复样品的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。

IL-1β和TNF-α在体外上调肝细胞CD14的表达。

众所周知，脂多糖诱导细胞因子的合成，如IL-1、TNF和IL-6，以及其他已知的调节肝脏急性期反应的炎症介质(33,44). 为了确定CD14的表达是否受体外细胞因子的调节，将培养的肝细胞暴露于各种细胞因子。通过Northern blot分析在12 h检测CD14 mRNA水平（初始结果显示最大诱导时间为12 h；数据未显示）。如图所示。​图10，10，培养的大鼠肝细胞表达1.6-kb CD14 mRNA转录物的基本水平。与对照组相比，IL-1β导致CD14 mRNA水平增加3.3倍。IL-1β联合TNF-α导致CD14 mRNA累积量增加（4.7倍），而IL-1β单独使用时增加幅度更大，尽管TNF-β单独使用并未显著增加CD14 mRNA水平。当IFN-γ与IL-1β或IL-1β–TNF-α联合使用时，CD14mRNA水平降低。据报道，IL-6是许多急性期反应物的强诱导剂(44); 然而，无论是单独使用还是与其他细胞因子联合使用，IL-6都不会影响培养肝细胞中CD14 mRNA的积累（数据未显示），而IFN-γ或LPS单独使用在体外的影响可以忽略不计。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331010.jpg

细胞因子对培养大鼠肝细胞稳态CD14 mRNA水平的影响。按照材料和方法进行肝细胞分离和Northern印迹分析。将大鼠原代肝细胞与单个或联合细胞因子（500 U/ml）孵育12 h。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并表示为对照组的倍数增加。每列代表三个独立实验的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05）。

IL-1β和TNF-α有助于提高体内肝脏CD14的表达。

为了确定IL-1β和/或TNF-α参与内毒素血症时体内肝脏CD14的上调，分别用IL-1ra或rsTNF-RI进行了阻断IL-1β或TNF--α的实验。事实证明，IL-1ra和rsTNF-RI的剂量和给药方法对预防内毒素血症大鼠的死亡率是最有效的(51). Northern blot分析用于测量LPS加IL-1ra、rsTNF-RI或两者在体内治疗的大鼠肝脏CD14 mRNA水平。如图所示。​图11，11，用LPS和IL-1ra或LPS和rsTNF-RI治疗的动物表现出20%的下降(P（P）与6小时前单独给予LPS的大鼠相比，肝脏CD14 mRNA水平显著下降。LPS加上IL-1ra和rsTNF-RI均进一步降低（50%，P（P）<0.05），表明IL-1和TNF在内毒素血症期间上调肝脏CD14 mRNA。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为ii1181331011.jpg

IL-1β和TNF-α拮抗剂的体内实验。给大鼠注射生理盐水（溶媒）、LPS（10 mg/kg，静脉注射）、LPS+IL-1ra（IL-1ra 100 mg/kg，皮下注射，0时，然后每隔6小时注射一次）、LPS-+rsTNF-RI（rsTNF-RI，1.5 mg/kg，i.v.，0时）或LPS+IL 1ra+sTNF-RI.6小时后从肝脏提取总RNA，并对CD14 mRNA进行Northern blot分析。CD14 mRNA水平归一化为18S rRNA，并呈现为对照组的倍数增加。每列代表每组四只动物的平均值±SE（*，P（P）与对照组相比<0.05；#，P（P）与LPS组相比<0.05）。

讨论

CD14作为一种关键的LPS信号分子，在许多细胞系统中已在体外得到很好的证明(1,38,59,63). 体内实验数据开始积累，确定了CD14在宿主对LPS反应中的关键作用。在骨髓源性细胞上过度表达人CD14的转基因小鼠对脂多糖高度敏感(16)，提供了体内证据表明内源性CD14过度表达可以增强LPS诱导的激活。相反，CD14基因敲除小鼠在致死率、TNF和IL-6生成方面对LPS的敏感性至少低10倍(25). 内毒素血症期间肝细胞CD14mRNA上调20倍，CD14蛋白表达和释放显著增加，这表明肝脏CD14表达是全身感染反应的一部分。

在本文报道的研究中，我们检测了大鼠肝细胞CD14在体内和体外的表达和调节。我们还克隆了大鼠肝脏CD14全长cDNA。我们的发现证明了以下几点。（i） 分离的大鼠肝细胞表达CD14 mRNA的基础水平，并且在内毒素血症期间该表达显著上调。（ii）用大鼠CD14的核糖探针原位杂交，在培养的肝细胞和肝实质细胞的全肝切片中鉴定出CD14 mRNA。（iii）整个肝脏和血浆都显示CD14蛋白水平的LPS依赖性增加，这与肝细胞CD14表达的增加相关。（iv）与对照肝细胞相比，LPS处理动物的肝细胞含有更多CD14，在培养中释放更多sCD14。（v） CD14 mRNA上调包括转录增加。（vi）克隆的全长大鼠肝细胞CD14 cDNA的序列与大鼠巨噬细胞CD14的序列相同，并编码功能性细胞表面LPS识别分子。（vii）体外和体内数据均表明，IL-1β和/或TNF-α调节肝细胞中CD14 mRNA的表达。CD14和LBP是两个关键的LPS识别和信号分子，我们都很好地描述了原代肝细胞产生LBP的特征(18,56,61)和其他人(47). 我们的数据表明，肝细胞也表达CD14，这增加了肝细胞在内毒素血症期间是CD14蛋白来源的可能性。

虽然肝脏是内毒素血症期间血浆中sCD14升高的潜在重要来源，但关于肝脏中CD14表达的报道有限。Matsuura等人(41)报道了LPS给药后小鼠肝脏CD14 mRNA的时间和剂量依赖性诱导。Fearns等人(11)证明CD14的髓外表达发生在包括肝脏在内的选定器官中，并且在内毒素血症期间血浆CD14水平升高。我们通过使用分离纯化的肝细胞证明内毒素血症期间肝细胞CD14 mRNA和蛋白表达增加来验证上述发现。常驻库普弗细胞(三,30,41)以及多形核单核细胞(28,62)在内毒素血症期间积聚在肝脏中的CD14是整个肝脏中CD14的潜在来源。我们纯化的肝细胞制剂含有不到2%的污染细胞。因此，这些少量的细胞不太可能产生显著水平的mRNA或蛋白质。此外，我们使用原位杂交在体内外明确定位CD14 mRNA到肝细胞（图。​（图3三).

已发现可溶性CD14能以高亲和力结合LPS并在许多CD14阴性细胞中介导活化(20,27,39,46). sCD14参与脓毒症的间接证据来自研究表明，在革兰氏阴性脓毒症期间，血浆CD14水平显著升高(25,37)，革兰氏阳性脓毒症(5)创伤或烧伤(35). 血浆中sCD14水平，范围为3至5μg/ml(5,22)与正常对照组和非消化性患者相比，败血症期间的增加了45%至75%。因此，sCD14符合急性相反应物的标准。许多急性期蛋白的一个重要特征是其基因通常受细胞因子和其他介质的调节。最具特征的细胞因子和其他介质是IL-1、TNF、IL-6、白血病抑制因子和IL-11，IL-1和TNF通常会引起类似的变化(2,7). 我们的体外和体内数据均表明，IL-1β和/或TNF-α可有效上调肝细胞CD14 mRNA（图。​（图1010和​和11），11)这与急性期蛋白的许多其他基因一致。体内结果不能证明IL-1β和TNF-α直接作用于肝细胞，而只能证明这些细胞因子直接或间接参与CD14的上调。在选定的剂量和时间点（12 h），IL-1β和/或TNF-α确实直接增加了体外肝细胞CD14 mRNA水平。体外稳态mRNA的变化与体内LPS治疗的变化幅度不同。这是否是由于体外条件不理想所致尚不清楚。Fearns及其同事的研究也证实了IL-1和TNF在肝脏和肾脏CD14mRNA上调中的作用(12,13)和Takakuwa等人(58).

虽然我们没有提供直接证据证明血浆中sCD14来源于内毒素血症期间肝细胞上的mCD14，但我们的数据（图。​（图4）4)清楚地证明了CD14在肝脏和血浆中以时间依赖性的方式表达相关，增加了肝脏是内毒素血症期间血浆CD14水平升高的重要来源的可能性。恐惧与失落(12)观察到，在小鼠内毒素模型中，当上皮细胞CD14表达最大时，血浆CD14水平升高。他们的数据支持这样一种观点，即肝细胞和肾小管上皮细胞可能有助于LPS刺激后血浆中sCD14的蓄积。我们的数据（图。​（图5A）5A） 表明LPS处理动物的肝细胞表达更高量的mCD14，最重要的是，释放更多的sCD14（图。​（图55B） ●●●●。

在20到30分钟内，高达80%的注射LPS浓缩在肝脏中(50)在数小时内胆汁中可以发现脂多糖(40). 最近的研究表明，在门静脉注射内毒素5分钟后，肝细胞中就可以发现LPS(43). 虽然一些LPS明显与Kupffer细胞和内皮细胞相互作用(41)也有强有力的证据表明肝细胞可以直接对LPS产生反应(45,61). 肝细胞CD14是否参与了这种相互作用尚不清楚。然而，有趣的是，通过原位杂交，靠近门静脉三联体的肝细胞显示出更高的CD14 mRNA表达。这些细胞首先暴露于进入肝脏的LPS中，细胞上的mCD14或细胞释放的sCD14都会与内毒素相互作用，从而促进与其他类型细胞的摄取或启动。另一种可能是门脉周围区域的肝细胞的LPS清除率高于中央区域。目前正在进行研究，以确定肝细胞CD14是如何处理的。

致谢

这项工作得到了NIH拨款R01-GM-50441的部分支持。

我们要感谢Debra Williams、Suhua Nie和Angela Green的技术协助，以及Margaret Bullers的秘书协助，以及Rosemary Hoffman在流式细胞术方面的协助。

S.L.和L.S.K.对这项工作做出了同等贡献。

参考文献

1Arditi M，Zhou J，Torres M，Durden D L，Stins M，Kim K S。脂多糖以可溶性CD14依赖性方式刺激血管内皮细胞中丝裂原活化蛋白激酶p44、p42和p41的酪氨酸磷酸化。免疫学杂志。1995年；155:3994–4003.[公共医学][谷歌学者]
2Baumann H、Morella K K、Wong G H W.TNFα、IL-1β和肝细胞生长因子协同刺激大鼠肝癌细胞中的特定急性期血浆蛋白基因。免疫学杂志。1993;151:4248–4255.[公共医学][谷歌学者]
三。Bellezzo J M、Britton R S、Bacon B R、Fox E S。LPS介导的大鼠Kupffer细胞NF-kappaβ活化可独立于CD14诱导。美国生理学杂志。1996;270：G956–G961。[公共医学][谷歌学者]
4Boggaram V，Mendelson C R.兔胎肺中主要表面活性蛋白（SPA）编码基因的转录调控。生物化学杂志。1988;263：19060年至19065年。[公共医学][谷歌学者]
5Burgmann H、Winkler S、Locker G J、Presterl E、Laczika K、Staudinger T、Knapp S、Thalhammer F、Wenisch C、Zedwitz-Liebenstein K、Frass M、Graninger W。可溶性CD14的血清浓度升高是革兰氏阳性脓毒症的预后标志。临床免疫免疫学。1996;80:307–310.[公共医学][谷歌学者]
6Caput D、Beutler B、Hartog K、Thayer R、Brown-Shimer S、Cerami A。在指定炎症介质的mRNA分子的3′-非翻译区域中确定常见核苷酸序列。美国国家科学院程序。1986;83:1670–1674. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Cybulsky M I，Chan M K W，Movat H Z。内毒素、白细胞介素-1和肿瘤坏死因子诱导的急性炎症和微血栓及其在革兰氏阴性感染中的意义。实验室投资。1988;58:365–376.[公共医学][谷歌学者]
8Davis L G，Kuehl W M，Battey J F.核转录速率测定运行。收件人：Davis L、Kuehl M、Battey J，编辑。分子生物学的基本方法。第二版，康涅狄格州斯坦福德：阿普尔顿和兰格出版社；1994年，第384-395页。[谷歌学者]
9Delude R L、Fenton M J、Savedra R，Jr、Perera P-Y、Vogel S N、Thieringer R、Golenbock D T。脂多糖诱导的核因子-κB的CD14介导易位不需要酪氨酸激酶活性。生物化学杂志。1994;269:22253–22260.[公共医学][谷歌学者]
10Dentener M A、Bazil V、Von Asmuth E J、Ceska M、Buurman W A.CD14参与人单核细胞和肺泡巨噬细胞释放脂多糖诱导的肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-8。免疫学杂志。1993;150：2885–2891。[公共医学][谷歌学者]
11Fearns C，Kravchenko V V，Ulevitch R J，Loskutoff D J。小鼠CD14基因在体内的表达：骨髓外的合成和脂多糖的调节。《实验医学杂志》。1995年；181:857–866. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Fearns C，Loskutoff D J.肿瘤坏死因子α在脂多糖诱导小鼠CD14基因表达中的作用。感染免疫。1997;65:4822–4831. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Fearns C，Ulevitch R J.重组白细胞介素-1β对小鼠体内CD14基因表达的影响。震惊。1998;9:157–163.[公共医学][谷歌学者]
14Ferrero E，Goyert S M.编码单核细胞分化抗原CD14基因的核苷酸序列。核酸研究。1988;16:4173. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Ferrero E，Hsieh C-L，Francke U，Goyert S M.CD14是富含亮氨酸蛋白家族的成员，由具有多个受体基因的基因合成酶编码。免疫学杂志。1990;145:331–336.[公共医学][谷歌学者]
16Ferrero E、Jiao D、Tsuberi B Z、Tesio L、Rong G-W、Hazior A、Goyert S M。表达人CD14的转基因小鼠对脂多糖过敏。美国国家科学院程序。1993;90:2380–2384. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Galea E、Reis D J、Fox E S、Xu H、Feinstein D L.CD14介导培养的脑胶质细胞中一氧化氮合酶的内毒素诱导。神经免疫杂志。1996;64:19–28.[公共医学][谷歌学者]
18Geller D A、Kispert P H、Su G L、Wang S C、Di Silvio M、Tweardy D J、Billar T R、Simmons R L。脓毒症模型中肝细胞脂多糖结合蛋白的诱导和急性期反应。Arch Surg公司。1993;128:22–27.[公共医学][谷歌学者]
19Geller D A、Lowenstein C J、Shapiro R A、Nussler A K、Di Silvio M、Wang S C、Nakayama D K、Simmons R L、Snyder S H、Billiar T R。人肝细胞诱导型一氧化氮的分子克隆和表达。美国国家科学院程序。1993;90:3491–3495. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Goldblum S E，Brann T W，Ding X，Tobias P S.脂多糖（LPS）结合蛋白和可溶性CD14在体外作为LPS诱导内皮屏障功能改变的辅助分子。临床研究杂志。1994;93:692–702. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Golenbock D T，Liu Y，Millham F H，Freeman M W，Zoeller R A.中国仓鼠卵巢成纤维细胞中人CD14的表面表达赋予巨噬细胞对细菌内毒素的反应性。生物化学杂志。1993;268:22055–22059.[公共医学][谷歌学者]
22Grumwald U，Krüger C，Schütt C.可溶性CD14的内毒素中和能力是一种高度保守的特异性功能。圆形冲击。1993;39：220–225。[公共医学][谷歌学者]
23Hampton R Y、Golenbock D T、Penman M、Krieger M、Raetz C R。清除剂受体对内毒素的识别和血浆清除。自然。1991;353:342–344.[公共医学][谷歌学者]
24Haziot A、Chen S、Ferrero F、Low M G、Silber R、Goyert S M。单核细胞分化抗原CD14通过磷脂酰-肌醇键固定在细胞膜上。免疫学杂志。1988;141:547–552.[公共医学][谷歌学者]
25Haziot A、Ferrero E、Kontgen F、Hijiya N、Yamamoto S、Silver S、Stewart C L、Goyert S M。CD14缺陷小鼠对内毒素休克的耐受性和革兰氏阴性菌的传播减少。免疫。1996;4:407–414.[公共医学][谷歌学者]
26Haziot A，Rong G W，Lin X Y，Silver J，Goyert S M。重组可溶性CD14预防内毒素（脂多糖）治疗小鼠的死亡率免疫学杂志。1995年；154电话：6529–6532。[公共医学][谷歌学者]
27Haziot A，Rong G W，Silver J，Goyert S M。重组可溶性CD14通过脂多糖介导内皮细胞的活化。免疫学杂志。1993;151:1500–1507.[公共医学][谷歌学者]
28Hirano S.腹腔和气管内注射脂多糖后PMN的迁移反应。美国生理学杂志。1996;270：L836–L845。[公共医学][谷歌学者]
29Hunt J S、Soares M J、Lei M-G、Smith R N、Wheaton D、Atherton R A、Morrison D C。脂多糖产物修饰了显示80-kDa脂多糖结合蛋白的大鼠滋养层细胞的DNA合成。免疫学杂志。1989;143:1606–1613.[公共医学][谷歌学者]
30Jarvelainen H A、Oinonen T、Lindros K O。酒精诱导大鼠Kupffer细胞中CD14内毒素受体蛋白的表达。酒精临床实验研究。1997;21:1547–1551.[公共医学][谷歌学者]
31Kim Y M，de Vera M E，Watkins S C，Billiar T R。一氧化氮通过诱导热休克蛋白70的表达来保护培养的大鼠肝细胞免受TNFα诱导的凋亡。生物化学杂志。1996;272:1402–1411.[公共医学][谷歌学者]
32Kirkland T N，Finley F，Leturcq D，Moriarty A，Lee J D，Ulevitch R J，Tobias P S.通过CD14进行脂多糖结合分析。生物化学杂志。1993;268:24818–24823.[公共医学][谷歌学者]
33Koj A、Gauldie J、Baumann H。细胞因子和激素网络的生物学观点。收录人：Mackeiwicz A、Kushner I、Baumann H，编辑。急性期蛋白质：分子生物学、生物化学、临床应用。佛罗里达州博卡拉顿：CRC出版社。；1993年，第275页。[谷歌学者]
34Kozak M.真核生物mRNA翻译起始位点上游序列的编译和分析。核酸研究。1984;12:857–871. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Krüger C、Schütt C、Obertacke U、Joka T、Müller T E、Knöller J、Knóller K、König W、Schöndeld W。多发伤和严重烧伤患者的血清CD14水平。临床实验免疫学。1991;85:297–301. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
第35页。R·兰德曼。个人沟通。
36Landmann R，Reber A M，Sansano S，Zimmerli W。感染性休克患者血清中可溶性CD14的功能。传染病杂志。1996;173:661–668.[公共医学][谷歌学者]
37Landmann R、Zimmerli W、Sansano S、Link S、Hahn A、Glauser M P、Calandra T。循环可溶性CD14增加与革兰阴性感染性休克的高死亡率相关。传染病杂志。1995年；171:639–644.[公共医学][谷歌学者]
38LeGrand C B，Thieringer R.脂多糖对小鼠B淋巴瘤细胞蛋白酪氨酸磷酸化的依赖性诱导。Biochim生物物理学报。1994;1223:36–46.[公共医学][谷歌学者]
39Loppnow H、Stelter F、Schönbeck U、Schlüter C、Ernst M、Schütt C、Flad H D。尽管缺乏CD14 mRNA或内源性膜CD14的表达，但内毒素仍能激活人类血管平滑肌细胞。感染免疫。1995年；63:1020–1026. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Maitra S K，Rachmilewitz D，Eberle D，Kaplowitz N。大鼠肝细胞对内毒素的摄取和胆汁排泄。肝病学。1981;1:401–407.[公共医学][谷歌学者]
41Matsuura K、Ishida T、Setoguchi M、Higuchi Y、Akizuki S、Yamamoto S。通过脂多糖上调Kupffer细胞中小鼠CD14的表达。《实验医学杂志》。1994;179:1671–1676. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Matsuura K、Setoguchi M、Nasu N、Higuchi Y、Yoshida S、Akizuki S、Yamamoto S。小鼠CD14基因的核苷酸和氨基酸序列。核酸研究。1989;17:2132. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Mimura Y、Sakisaka S、Harada M、Sata M、Tanikawa K。肝细胞在大鼠内毒素直接清除中的作用。胃肠病学。1995年；109：1969年至1976年。[公共医学][谷歌学者]
44Morrone G、Giliberto G、Oliviero S、Arcone R、Dente L、Content J、Cortese R。重组IL-6调节一组人类急性期基因的转录激活。生物化学杂志。1988;263:12554–12558.[公共医学][谷歌学者]
45Pittner R A，Spitzer J A。内毒素和TNFα直接刺激慢性内毒素血症大鼠培养肝细胞中一氧化氮的形成。生物化学与生物物理研究委员会。1992;185:430–435.[公共医学][谷歌学者]
46Pugin J、Schurer-Maly C C、Leturcq D、Moriarty A、Ulevitch R J、Tobias P S。人内皮细胞和上皮细胞的脂多糖活化由脂多糖结合蛋白和可溶性CD14介导。美国国家科学院程序。1993;90:2744–2748. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Ramadori G，Meyer zum Buschenfelde K-H，Tobias P S，Mathison J C，Ulevitch R J.兔肝细胞脂多糖结合蛋白的生物合成。病理生物学。1990;58:89–94.[公共医学][谷歌学者]
48Read M A、Cordle S R、Veach R A、Carlisle C D、Hawiger J。CD14的无细胞池通过人内皮细胞中的脂多糖介导转录因子NF-κB的激活。美国国家科学院程序。1993;90：9887–9891。 [谷歌学者]
49Roger M.杂交探针检测。收录人：Ausubel F M、Brent R、Kingston R E、Moore D D、Seidman J G、Smith J A、Struhl K编辑。分子生物学的当前协议。第2卷。纽约州纽约市：John Wiley&Sons，Inc。；1987年，第14.4.1–14.4.3页。[谷歌学者]
50Ruiter D J，van der Meulen J，Brouwer A，Hummel M，Jr，Mauw B J，van der Ploeg J C M，Wisse E.静脉注射后肝细胞吸收内毒素。实验室调查。1981;45：38–45。[公共医学][谷歌学者]
51Russell D A、Tucker K K、Chinookoswong N、Thompson R C、Kohno T。在啮齿动物内毒素血症中联合抑制白细胞介素-1和肿瘤坏死因子：提高生存率和器官功能。传染病杂志。1995年；171:1528–1538.[公共医学][谷歌学者]
52Schletter J，Heine H，Ulmer A J，Rietschel E T。内毒素活性的分子机制。微生物学建筑学。1995年；164:383–389.[公共医学][谷歌学者]
53Schumann R R、Leong S R、Flaggs G W、Gray P W、Wright S D、Mathison J C、Tobias P S、Ulevitch R J。脂多糖结合蛋白的结构和功能。科学。1990;249:1429–1431.[公共医学][谷歌学者]
54Seglan P.分离大鼠肝细胞的制备。收录人：普雷斯科特·D，编辑。细胞生物学方法。纽约，N.Y：学术出版社。；1976年，第28-83页。[公共医学][谷歌学者]
55Stelter F、Pfister M、Bernheiden M、Jack R S、Bufler P、Engelmann H、Schutt C。髓系分化抗原CD14为N个-和哦-糖化的。N-连接糖基化对不同可溶性CD14亚型的贡献。欧洲生物化学杂志。1996;236：457–464。[公共医学][谷歌学者]
56Su G L、Freeswick P D、Geller D A、Wang Q、Shapiro R A、Wan Y-H、Billiar T R、Tweardy D J、Simmons R L、Wang S C。大鼠脂多糖结合蛋白的分子克隆、表征和组织分布。免疫学杂志。1994;153:743–752.[公共医学][谷歌学者]
57Takai N、Kataoka M、Higuchi Y、Matsuura K、Yamamoto S。大鼠CD14的一级结构和大鼠单核细胞系统细胞对LPS反应时CD14、细胞因子和NO合成酶mRNA表达的特征。白细胞生物学杂志。1997;61:736–744.[公共医学][谷歌学者]
58Takakuwa T、Knopf H P、Sing A、Carsetti R、Galanos C、Freudenberg M A。在Lpsn、Lpsd和肿瘤坏死因子受体缺陷小鼠中诱导CD14表达。欧洲免疫学杂志。1996;26:2686–2692.[公共医学][谷歌学者]
59Tobias P S、Soldau K、Kline L、Lee J-D、Kato K、Martin T P、Ulevitch R J.通过脂多糖结合蛋白介导THP-1细胞上脂多糖（LPS）与CD14的交叉链接。免疫学杂志。1993;150:3011–3021.[公共医学][谷歌学者]
60Ulevitch R J，Tobias P S.细菌内毒素刺激细胞的受体依赖机制。免疫学年度回顾。1995年；13:437–457.[公共医学][谷歌学者]
61Wan Y-H、Freeswick P D、Khemlani L S、Kispert P H、Wang S C、Su G L、Billar T R。脂多糖（LPS）、白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子和地塞米松在LPS治疗大鼠正常肝细胞和肝细胞LPS结合蛋白表达调节中的作用。感染免疫。1995年；63:2435–2442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
62Wang J H，Redmond H P，Watson R W，Bouchier-Hayes D.脂多糖和肿瘤坏死因子-α在诱导肝细胞坏死中的作用。美国生理学杂志。1995年；269：G297–G304。[公共医学][谷歌学者]
63渡边A、竹下A、北野S、花泽S。CD14介导的牙龈卟啉单胞菌人牙龈成纤维细胞中的脂多糖。感染免疫。1996;64:4488–4494. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
64West M A，Billiar T R，Curran R D，Hyland B J，Simmons R L.大鼠Kupffer细胞通过不同机制刺激和抑制体外肝细胞蛋白质合成的证据。胃肠病学。1989;96:1572–1582.[公共医学][谷歌学者]
65Whicher J T，Westacott I.急性期反应。收录人：Whicher J T，Evans S W，编辑。炎症的生物化学。第18卷。多德雷赫特，荷兰：Kluwer学术出版社；1992年，第243-269页。[谷歌学者]
66Wright S D、Levin S M、Jong M T、Chad Z、Kabbash L G.CR3（CD11b/CD18）表达一个含arg-gly-asp肽的结合位点和一个细菌脂多糖的第二个位点。《实验医学杂志》。1989;169:175–183. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
67Yamamoto H，Hanada K，Nishijima M.通过CD14介导的脂多糖刺激，使二酰甘油的产生参与核因子kappaB的激活。生物化学杂志。1997;325:223–228. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
68Zeller R，Roger M.细胞RNA原位杂交。收录：Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，Moore D D，Seidman J G，Smith J A，Struhl K，编辑。分子生物学的当前协议。第2卷。纽约州纽约市：John Wiley&Sons，Inc。；1987年，第14.3.1–14.3.14页。[谷歌学者]
文章来自感染与免疫由以下人员提供美国微生物学会（ASM）