路易体病的疾病特异性α-突触核蛋白种子和多系统萎缩在甲醛固定石蜡包埋人脑中得以保存
,概念化,方法,验证,形式化分析,调查,写作——原稿,写作–审查和编辑,可视化,项目管理,1,2 ,概念化,方法,验证,调查,写作–审查和编辑,项目管理,1,三 ,调查,写作–审查和编辑,1 ,概念化,资源,写作–审查和编辑,资金获取,1,三，4和,概念化,方法,验证,形式化分析,调查,资源,写作——原稿,写作–审查和编辑,可视化,监督,项目管理,资金获取1,2,三，4,5,*
弗拉基米尔·乌夫斯基（Vladimir N.Uversky），学术编辑
2多伦多大学实验医学和病理生物学系，多伦多，ON M5S 1A8，加拿大
三加拿大安大略省多伦多市大学健康网络克伦贝尔脑研究所M5T 0S8
4加拿大安大略省多伦多市多伦多西部医院帕金森病及莫顿和格洛丽亚·舒尔曼运动障碍诊所Edmond J.Safra项目
5加拿大安大略省多伦多市大学卫生网络实验室医学项目M5G 2C4
2023年3月24日收到；2023年5月30日修订；2023年5月31日接受。
- 补充资料
GUID:8D5ABB7-860D-4F4F-827F-C38F5A4E765C
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摘要
最近的研究已经能够使用种子扩增分析（SAAs）检测来自突触核蛋白病患者的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织中的α-突触核蛋白（αSyn）种子，但由于蛋白质提取效率有限，灵敏度相对较低。为了引入冷冻组织的替代方案，我们开发了一种简化的蛋白质提取方案，用于评估FFPE人脑中疾病特异性接种。我们评估了不同组织制剂、脱蜡和蛋白质提取缓冲液的蛋白质提取效率，使用甲醛固定组织和单个路易体病（LBD）患者的FFPE组织。或者，我们使用商用试剂盒将热诱导抗原检索和分离结合起来。我们的新型蛋白质提取方案已经过优化，可用于10个4.5µm厚或2 mm直径的FFPE组织切片，这些切片可用于种子SAA。我们证明，从FFPE中提取的蛋白质仍然保留了播种潜力，并进一步显示了LBD和多系统萎缩的疾病特异性播种。据我们所知，我们的研究首次重述了FFPE人脑中疾病特异性α-Syn接种行为。我们的发现为重新评估存档的人类脑组织开辟了新的视角，将疾病特异性种子试验扩展到更大的队列，以促进同核蛋白病的分子亚型划分。
关键词：α-同核蛋白、蛋白质提取、FFPE、SAA、播种行为
1.简介
突触核蛋白病是一种神经退行性疾病，其特征是神经元丢失和各种细胞类型中错误折叠的α-突触核素（αSyn）沉积。αSyn是一种由SNCA公司基因，定位于神经元突触前末端[1]. 其致病形式由不溶性β-片状富集结构和Ser129残基的磷酸化组成[2,三]. 突触核蛋白病包括帕金森氏病（PD）、帕金森氏症伴痴呆（PDD）和路易体痴呆（DLB），统称为路易体病（LBD）和多系统萎缩（MSA）。神经病理学上，LBD的特征是神经元中形成包涵体，特别是路易体（LB）和路易神经节[4,5]统称为路易病理学。LBD的临床症状包括运动迟缓、僵硬、静息震颤、姿势不稳定和其他非运动症状。另一方面，MSA的神经病理学特征是少突胶质细胞中αSyn的积累，称为胶质细胞质内含物（GCI）[6]. 临床上，MSA患者病情进展更快，伴有运动和小脑症状以及自主神经功能衰竭[7].
同核蛋白病的这种多样性来源于同一种αSyn蛋白，但最近关于结构和生化差异的发现导致了这样一种假设，即错误折叠的αSyn的不同构象导致不同的多态性或菌株[8,9,10,11]. 不同的多态性显示出不同的细胞对细胞增殖率，假设参与确定同核蛋白病的临床和神经病理学表型，如朊病毒疾病[12,13]. 基于此，利用种子扩增分析（SAAs），如实时震动诱导转换（RT-QuIC）或蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA），在体外重现了LBD和MSA中错误折叠的αSyn的种子行为。SAA是一种基于震动的循环扩增技术，利用自我繁殖的特性，扩增α-Syn种子，可在死后脑组织和脑脊液和皮肤等体内样本中检测到并具有高灵敏度和特异性[14,15]. SAA允许使用硫黄素T（ThT）实时检测聚集的αSyn，该硫黄素T结合到错误折叠αSyn的β片状结构。ThT荧光在多个时间点进行测量，以便分析不同受试者之间的动力学差异[16]. 不同的温度、pH值、盐和缓冲液成分可以改变体外纤维生长和检测的敏感性，进一步实现对致病种子的选择性检测[17,18,19]. 我们小组最近的研究确定了有利于LBD或MSA种子活性的最佳检测条件，并证明种子不仅在同核蛋白病之间不同，而且在受试者的不同区域之间也不同[20,21].
尽管这些化验显示出很高的敏感性和特异性，但由于尸检率普遍下降，以及这些标本在超低温冷冻柜中的储存成本不断上升，因此尸检后冷冻脑组织的可用性较低。为了克服这一局限性，FFPE组织可用于种子试验，以便进一步评估大规模队列。FFPE仍然是组织保存的金标准，广泛用于医院、脑库和研究实验室，允许对人类死后大脑进行神经病理学评估。然而，甲醛固定的组织在大分子之间有各种交联，尤其是蛋白质和甲醛之间形成希夫碱[22]. 这些分子间和分子内交联提高了蛋白质的稳定性，这对组织保存至关重要。尽管FFPE组织保留了可以理解潜在疾病机制的生物信息，但一旦组织固定，它们仅限于组织学分析。尽管存在这一局限性，一些研究报告成功地从FFPE或甲醛固定组织中提取和回收疾病相关朊蛋白（PrP）[23,24]. 由于在档案组织中对错误折叠的PrP进行免疫检测可能比较困难，一些研究小组使用FFPE组织，使用SAA敏感地检测慢性消耗性疾病（CWD）和散发性克雅氏病（sCJD）中的错误折叠PrP[25,26]. 虽然甲醛填充降低了蛋白质提取效率，但使用传统上用于均质冷冻组织的简单PBS缓冲液，从FFPE组织中提取错误折叠的PrP就足够了，并且由于错误折叠的朊蛋白具有较高的感染性，后续的SAA不受提取效率的限制[27].
此外，少数研究已成功检测并扩增FFPE皮肤、颌下腺和胃肠道中错误折叠的αSyn[28,29,30]. 然而，作者一直报道蛋白质提取效率的局限性，可能是由于蛋白质和其他大分子在固定过程中形成甲醛交联所致[31,32,33]，组织中残留的石蜡残留物，或使用的组织数量少（5–6µm组织切片）。报道了使用不同的蛋白质提取缓冲液去除石蜡残留物和逆转甲醛交联的不同技术[34,35,36,37,38]. 在不同的技术中，通过抗原检索应用热能和根据离子强度差异校正的提取缓冲液被确定为高效蛋白质提取的关键要素[39,40,41,42].
考虑到FFPE组织可以提供将接种行为与神经病理学特征的脑区联系起来的优势，并允许对更大的队列进行调查，我们旨在建立一个简化的蛋白质提取协议，专门用于评估FFPE人类脑组织中αSyn的接种。
2.材料和方法
2.1. 案例选择
6名LBD受试者（4名女性）、2名MSA受试者（1名女性）和1名无病理学的受试者（1名女性）选自大学健康网络神经退行性脑集合（UHN-NBC，多伦多，安大略省，加拿大）。1名LBD受试者的颞叶皮层用于优化，黑质用于验证。在剩下的实验中，除了对照组的顶叶皮层和小脑白质外，本研究还使用了LBD受试者的颞叶皮层和MSA受试者小脑。病例选择基于使用神经退行性疾病和共同病理诊断标准的系统神经病理学评估[4,43]. 人口统计学和神经病理学评估总结于在尸检过程中，在征得患者或其亲属知情同意的情况下收集人脑组织，并由机构审查委员会批准。所有组织在甲醛中固定2周，并包埋在石蜡中进行染色和保存以供研究。本研究由大学健康网络研究伦理委员会（编号20-5258）批准。
表1
| 案例 | 性别 | 死亡年龄 | PMD（小时） | 储存（年） | ABC得分* | CAA公司 | 路易体病理学 | 路易车身制动阶段 | 晚NC阶段 | 其他神经病理诊断 |
|---|
| 控制1 | F类 | 52 | 28 | 三 | 无 | 无 | 无 | 无 | 无 | 早期Fahr病 |
| LBD 1号机组 | M（M） | 74 | 不适用 | 2 | A1B1C1型 | 类型2 | 新皮质 | 第5阶段 | 无 | 无 |
| LBD 2号机组 | F类 | 73 | 不适用 | 26 | A2B3C3型 | 无 | 新皮质 | 第5阶段 | 第2阶段 | 无 |
| LBD 3号机组 | F类 | 73 | 2.5 | 25 | A2B3C2型 | 无 | Limbic公司 | 第4阶段 | 第2阶段 | 无 |
| LBD 4号机组 | F类 | 82 | 24–36 | 25 | A2B2C2型 | 无 | 新皮质 | 第5阶段 | 无 | ARTAG Medial Temporal GM、WM、Brainstem |
| 体重5磅 | F类 | 62 | 15 | 25 | A3B3C3飞机 | 无 | 新皮质 | 第5阶段 | 第1阶段 | 无 |
| LBD 6号机组 | M（M） | 78 | 40 | 三 | A3B2C1飞机 | 类型2 | 新皮质 | 第5阶段 | 第2阶段 | 右额脑膜瘤 |
| MSA 1号机组 | F类 | 68 | 4 | 36 | A1B1C0型 | 类型2 | 无 | 无 | 无 | ARTAG中时WM |
| MSA 2 | M（M） | 64 | 不适用 | 三 | {“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“A0B1C0”，“term_id”：“123467301”，“term_text”：“AOB1C0“}}A0B1C0型 | 无 | 无 | 无 | 无 | 第二部分（Braak阶段），AGD（阶段II） |
2.2. 免疫组织化学
使用切片机将FFPE组织切割成4.5µm厚的切片，并用单克隆5G4抗鼠抗体进行免疫染色[44]，仅标记疾病相关αSyn（1:4000；用80%甲酸预处理5分钟；德国莱比锡Roboscreen）。使用DAKO EnVision FLEX目标检索解决方案执行目标检索。使用DAKO EnVision检测试剂盒、EnVision FLEX过氧化物酶阻断溶液、3,3′-二氨基联苯胺显色剂和EnVision FLEX+小鼠链接剂（丹麦格洛斯特鲁普DAKO）来观察抗体反应。
使用TissueScope获得数字图像TM（TM）LE120和TissueSnapTM（TM）（休伦，圣雅各布斯，安大略省，加拿大）并使用休伦查看器软件进行裁剪(图S1).
2.3. 样品采集
为了测试蛋白质提取效率，通过以下方法制备FFPE组织：（1）在带正电荷的玻璃载玻片上切割4.5-µm厚的切片，总计45-µm组织；（2）在1.5 mL低蛋白结合管（德国纽姆布雷赫特市萨斯特特）中切割4.5-¦Μm厚卷轴，总计45-µm组织；（3）收集4 mm的FFPE块微穿孔，（4）收集2 mm的FFFE块微穿孔和（5）收集4 mm甲醛固定组织微穿孔。为了确保微穿刺后FFPE块可再次使用，在微穿刺收集之前将石蜡熔化，并将其余组织重新埋入。为了融化蜡，将FFPE块放置在Tissue Tek上®在62°C的温度下，在包埋机（日本长野樱花Finetek）的石蜡熔化室中培养10分钟。使用带有柱塞的一次性活检冲头（Integra Miltex，York，PA，USA），传统上用于皮肤活检，收集FFPE组织块的微粒。采集每个样本后，安全丢弃活检冲头，以避免交叉污染。
2.4. 脱蜡
为了测试石蜡去除的效率，测试了两种方法：（1）二甲苯-乙醇和（2）庚烷-甲醇。对于二甲苯-乙醇，组织在新鲜二甲苯中在室温下培养两次10分钟，然后在一系列分级乙醇（90%、80%、70%、50%）中再水化，在室温下在蒸馏水中再水化各5分钟。将载玻片上的组织放在架子上并浸入染色皿中，而对于低蛋白结合管中的组织（优化方案中的C管（Miltenyi BioTec，Auburn，CA，USA）），小心地去除上清液并用下一种溶液替换。对于庚烷-甲醇，组织在室温下在庚烷中培养10分钟，每隔5分钟旋涡10秒，然后与5%混合五/五甲醇和涡流10秒。然后去除上清液，并在室温下在生物安全柜中干燥组织5分钟。将载玻片上的组织放在架子上，并将其浸入染色皿中数次。
在脱蜡和再水化后，用涂有Sigmacote（Sigma，St.Louis，MI，USA）的切片机刀片小心刮取载玻片上的组织2分钟，并在生物安全柜中干燥20分钟。将刮下的组织转移到干净的1.5 mL低蛋白结合管中并称重。
2.5. 抗原提取和分离
FFPE组织分离试剂盒（Miltenyi BioTec，Auburn，CA，USA）用于根据制造商的说明进行抗原检索和分离，但需稍作修改。简言之，将脱蜡组织转移到C管中，并使用提供的缓冲液在80°C水浴中培养75分钟。一旦样品冷却，仔细去除上清液，使用提供的缓冲器和酶，在gentleMACS™解离器（Miltenyi BioTec，Auburn，CA，USA）上解离样品。然后将解离的组织转移到1.5mL低蛋白结合管中，并在4°C下以5000×克.丢弃上清液，将组织颗粒重新悬浮在PBS中。再次在4°C下以5000×克，并去除上清液。称量所得组织颗粒并用于蛋白质提取。
2.6. 蛋白质提取和定量
为了测试不同蛋白质提取缓冲液的效率，对脱蜡组织进行称重，并小心地转移到Precellys®含有氧化锆珠的2 mL蛋白质安全软组织均质管（CK14；美国马里兰州罗克维尔Bertin Corp）。冰镇10%重量/体积(周/五)提取缓冲器()添加到管中，并放置在Minilys珠子均质机（法国蒙特尼勒布伦纽克斯Bertin Technologies SAS）中，高速运行30秒。将试管置于冰上5分钟，再重复均质2次。对于抗原回收和分离处理的组织，称量组织颗粒并将其重新悬浮在10%的冰镇中周/五PBS被转移到均质管之前。均质后，将组织匀浆转移到1.5 mL低蛋白结合管中，在冰上培养10 min，并在4°C下离心10 min 10000×克如前所述[20]. 将上清液收集在一个1.5 mL低蛋白结合管中，然后在0.5 mL低蛋白连接管中进行校准，以避免过度的冻融循环。
表2
| 缓冲器 | 缓冲器组成 |
|---|
| 缓冲器1 | 1×磷酸盐缓冲盐（pH 7.4）
蛋白酶抑制剂 |
| 缓冲区2 | 1×磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）
0.01%β-巯基乙醇
蛋白酶抑制剂 |
| 缓冲区3 | 1×Tris缓冲盐
（50mM Tris-HCl（pH 7.5）
150 mM氯化钠）
蛋白酶抑制剂 |
| 缓冲区4 | 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）
蛋白酶抑制剂 |
| 缓冲区5 | 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）
1%壬基苯氧基聚氧乙烯醚-40
150 mM氯化钠
蛋白酶抑制剂 |
| 缓冲器6 | 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）
1%壬基苯氧基聚氧乙烯醚-40
蛋白酶抑制剂 |
蛋白质提取后，进行双钦酸蛋白质（BCA）分析（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA），以确定每个样品中的总蛋白质浓度。
2.7. α-Syn-SAA协议
SAA的执行如前所述[20]. 简言之，SAA反应混合物由40 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、350 mM Na组成三柠檬酸盐（西格玛，密歇根州圣路易斯市，美国）、0.1 mg/mL K23Q人重组α-Syn（Impact Biologicals，美国宾夕法尼亚州）和10µM ThT（西格马，密歇斯加州圣路易斯）。在本研究中，使用了K23Q人重组αSyn，因为它在没有种子的情况下不太容易自发聚集[45]. 重组αSyn从−80°C的储存中解冻，并通过100kDa Amicon超0.5离心过滤装置进行过滤（Sigma，St.Louis，MI，USA）。对于系列稀释实验，使用1.25、2.5、5和10µg总蛋白作为SAA反应的种子。为了通过模板测试α-Syn种子差异的传递性，使用2µL SAA最终产品作为种子进行后续SAA反应。对于每个平板，包括一个阳性对照（1µg预先形成的α-Syn纤维）和一个阴性对照（去离子水）。用无DNase-/R无碱透明聚烯烃密封带（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）密封板。
为了评估LBD和MSA受试者之间的差异播种行为，进行了两项SAA方案[20,21]. 在第一个方案中，支持LBD的SAA，平板在42°C下培养，摇晃1分钟，休息1分钟。在第二个方案中（支持MSA的SAA），平板在37°C下在BMG FLUOstar Omega平板阅读器中培养，摇动1分钟（400 rpm双轨道），休息14分钟。在两个方案中，每15分钟进行一次ThT荧光测量（450±10 nm激发和480±10 nm发射，底部读数），持续90 h。
2.8. 透射电子显微镜
将10微升αSyn SAA最终产品装载到新发光的400目碳涂层铜格栅上（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德市电子显微镜科学公司），并吸附1分钟。干燥后，使用Talos L120C透射电子显微镜对格栅进行可视化（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Thermo Scientific公司）使用200 kV的加速电压。使用Eagle 4kx4k CETA CMOS相机（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）记录电子显微照片。
2.9. 统计分析
所有统计分析均使用Prism（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件第9版）进行。绘制动力学曲线，并使用Prism获得曲线下面积（AUC）。使用非配对双尾参数对动力学曲线进行比较t吨-使用Tukey的多重比较测试或单向方差分析。重要性声明于第页< 0.05.
3.结果
为了评估α-Syn种子是否保存在FFPE人脑组织中，我们测试了以前报道过的不同组织制剂、脱蜡方法和提取缓冲液(a） ●●●●。然而，我们观察到这些方法的播种活性低或不一致。为了确定最有效的蛋白质提取方法，在保持疾病特异性αSyn接种行为的同时产生最高的蛋白质浓度，我们使用市售试剂盒测试了一种新的方法，该方法使用热诱导抗原回收和解离过程(b） ●●●●。使用这种新方法，我们观察到与传统提取方案相比，蛋白质提取效率有所提高，αSyn种子增加。我们使用来自五个LBD（四个存档>20年）和两个MSA受试者（一个存档>二十年）的FFPE脑组织验证了我们的优化方案(c、 d）。
FFPE蛋白质提取优化示意图。(一)使用FFPE和甲醛固定颞叶皮层对受试LBD受试者的蛋白质提取效率进行测试，与对照受试者相比，受试者使用三种不同的组织制剂、两种不同的脱蜡和再水化方法以及六种不同的提取缓冲液（均存档<2年）；(b条)引入热诱导抗原回收和分离以提高用简单PBS缓冲液提取的蛋白质产量；(c（c）)应用优化提取方案评估不同地区和LBD受试者的蛋白质提取效率和α-Syn接种（存档>20年）；(d日)评估LBD（存档<2年）黑质、MSA小脑（存档>20年）和对照（存档<2年）受试者顶叶皮层和小脑的α-Syn疾病特异性，比较仅进行抗原回收或同时进行抗原回收和分离的组织之间的接种。
3.1. FFPE人脑组织蛋白质提取及SAA研究
3.1.1. 不同组织制备、去石蜡化和提取缓冲液对蛋白质提取效率的比较
由于之前的FFPE蛋白质提取协议使用了5或6µm厚的FFPE切片，或者安装在玻璃载玻片上，或者在试管中卷轴上，我们使用总共10个4.5µm厚的FFPE颞叶皮层切片来测试蛋白质提取效率，这些切片在带正电荷的玻璃载玻片上脱蜡或直接放置在低蛋白结合管中。另外，为了尽可能保存FFPE组织，同时最大限度地使用组织量，我们还测试了从4 mm微穿孔FFPE组织中提取蛋白质的效率。对之前报道的蛋白质提取缓冲液进行了轻微修改[37]，我们比较了自制的六种不同提取缓冲液的蛋白质提取效率。不同缓冲区的组成概述如下.
使用二甲苯-乙醇脱蜡，我们发现用缓冲液2从对照组织的4mm微穿孔中提取的蛋白质量最高，用缓冲液1提取的蛋白质产量较低，而用缓冲液3、4、5和6提取的蛋白质含量最低。在LBD组织中，使用缓冲液1提取的蛋白质在所有组织制备类型中产生的蛋白质量最低，而在另一个极端，BCA显示使用缓冲液2的蛋白质量最高(a） ●●●●。值得注意的是，尽管0.01%的β-巯基乙醇与BCA相容，但还原剂可能扭曲了总蛋白的测量，错误地使值升高。当使用缓冲液1、2、5或6时，FFPE微穿孔的蛋白质浓度高于FFPE切片的蛋白质浓度。另一方面，当缓冲液3或缓冲液4用于二甲苯-乙醇脱蜡时，FFPE微穿孔的蛋白质浓度与FFPE切片的蛋白质浓度相似。在载玻片和试管中的FFPE切片之间，提取缓冲液中的蛋白质浓度存在细微差异，但缓冲液2除外，其中载玻片上脱蜡的FFPE片段的浓度高于试管中的浓度。
使用各种组织制剂、脱蜡和提取方法比较FFPE蛋白质提取效率和随后的α-Syn接种。(一)使用六种不同的提取缓冲液，从受试者顶叶皮层的4-mm微穿孔和载玻片、试管中的45-µm FFPE切片或受试者颞叶皮层的4mm FFPE微穿孔中提取二甲苯-乙醇或庚烷-甲醇脱蜡获得的蛋白质产量；(b条)LBD颞叶皮层和控制顶叶皮层4-mm FFPE微穿孔提取蛋白的后续αSyn播种潜力。
基于之前的研究，强调了在不使用二甲苯等会阻碍蛋白质提取的有毒溶剂的情况下彻底清除石蜡的重要性[46]，我们使用由庚烷-甲醇组成的另一种脱蜡和再水化方法测试了蛋白质提取效率。对于对照组织，除缓冲液1和缓冲液2外，所有提取缓冲液用庚烷-甲醇脱蜡时产生的蛋白质浓度都高于用二甲苯-甲醇脱碳的提取缓冲液。对于LBD组织，除缓冲液4外，所有提取缓冲液用庚烷-甲醇脱蜡时，与用二甲苯-乙醇脱蜡的提取缓冲液相比，在FFPE切片中产生了更高的蛋白质浓度。当缓冲液4与庚烷-甲醇脱蜡一起使用时，载玻片上的FFPE切片具有较高的蛋白质浓度，而试管中的FFPE截面与二甲苯-乙醇脱蜡切片相比具有较低的浓度。对于从4-mm FFPE微冲头提取的蛋白质，与用二甲苯-乙醇脱蜡的蛋白质相比，除缓冲液3外，所有庚烷-甲醇脱蜡的提取缓冲液中的浓度都较低。当使用缓冲液3时，蛋白质浓度与用二甲苯-乙醇或庚烷-甲醇脱蜡的蛋白质浓度相似。然而，随着庚烷-甲醇脱蜡，我们在蛋白质提取结束时在缓冲液顶部观察到一层厚厚的石蜡残渣，而不管提取的蛋白质的产量如何。
3.1.2. 不同组织制备、脱蜡和提取缓冲液提取α-Syn的种子
在所有提取缓冲液中，庚烷-甲醇脱蜡产生了不同的蛋白质浓度，但我们观察到，在使用二甲苯-乙醇脱蜡的所有提取缓冲区中，使用4mm FFPE微穿孔进行提取时，蛋白质浓度得到了一致的提高。因此，我们使用测试LBD受试者和对照受试者的4-mm FFPE微穿孔来比较使用不同的脱蜡和提取缓冲液提取的αSyn的接种。在庚烷-甲醇脱蜡过程中，当用缓冲液1、2或4提取时，对照组呈阳性，而LBD组织中的αSyn在缓冲液1中约30 h出现播种，在缓冲液2中约28 h出现播种不一致，并且没有在缓冲液3、4、5或6中播种(b） ●●●●。我们怀疑，由于播种需要真正的液-气界面，使用正庚烷-甲醇脱蜡法去除石蜡的不足可能导致反应混合物中形成薄石蜡层，从而导致播种不足。对于用二甲苯-乙醇脱蜡的组织，当用缓冲液2、3、5或6提取时，对照组为阳性，而用缓冲液1从LBD组织中提取的错误折叠的αSyn在用提取缓冲液2提取的30 h时显示为阴性接种和阳性接种。含有Tris的提取缓冲液4、5和6（而非缓冲液3）显示出αSyn种子。当在pH 8.0（缓冲液4）下仅用Tris-HCl提取蛋白质时，我们在5 h观察到αSyn种子活性，而用NaCl和NP40（缓冲液5）提取的蛋白质在20 h播种，用NP40（缓冲器6）提取的蛋白在12 h播种，我们观察到用二甲苯-乙醇脱蜡的组织中的种子活性较低或延迟，但用庚烷-甲醇脱蜡组织中的αSyn种子大多为阴性，且脱蜡明显不完全。因此，我们从此改用二甲苯-乙醇。
3.2. 甲醛固定人脑组织中蛋白质的提取及SAA研究
基于先前的SAA研究和我们对石蜡残渣导致蛋白质提取效率低的观察，我们比较了从甲醛固定和FFPE颞叶皮层获得的蛋白质浓度。正如预期的那样，BCA测量结果显示，当使用缓冲液1、2、3或6进行二甲苯-乙醇脱蜡提取时，4 mm甲醛固定组织微穿孔的蛋白质浓度高于使用缓冲液4 mm FFPE组织微穿孔提取的蛋白质浓度，并且使用缓冲液1,2,3,5,6进行庚烷-甲醇脱蜡提取(a） ●●●●。我们评估了使用所有六种缓冲液提取的αSyn的接种，尽管甲醛固定的脑组织的蛋白质浓度最高，但我们没有观察到接种(b） ●●●●。因为医院和智库很少大规模存档甲醛填充的人脑组织用于未来的研究，而且因为我们的结果是阴性的，所以我们从研究中删除了这种组织类型。需要进一步研究和进一步优化，以逆转交联并从2周的甲醛固定人脑组织中提取具有种子潜力的蛋白质。
使用甲醛固定人脑组织的不同提取缓冲液的蛋白质提取效率和随后的αSyn接种潜力。(一)用不同的缓冲液提取LBD的甲醛固定FFPE颞叶皮层4mm微穿孔获得的蛋白质产量；(b条)当使用缓冲液1-6从甲醛固定的人脑组织中提取蛋白质时，观察到αSyn接种阴性。
3.3. FFPE蛋白提取和α-Syn-SAA的优化
3.3.1. 热诱导抗原提取和分离提取FFPE蛋白
从FFPE组织中提取的传统蛋白质不足以提取足够数量的蛋白质，用于种子αSyn SAA。因此，基于先前强调热暴露对交联逆转的重要性的文献，我们在使用商用试剂盒提取蛋白质之前，将热诱导抗原回收与分离结合起来，此外，使用简单的PBS提取缓冲液。通过使用二甲苯-乙醇脱蜡和随后的抗原回收和分离，我们观察到使用缓冲液1提取的蛋白质产量增加了两倍以上，即使使用2毫米的微穿孔(a） ●●●●。具体而言，蛋白质浓度从最高到最低依次为：4-mm FFPE微穿孔>2-mm FFPE微穿孔>载玻片上脱蜡的45-µm FFPE切片>试管中脱蜡的45µm。还从颞皮质的2毫米微突起中提取蛋白质，并将LBD受试者的黑质记录<2年(b） 四名LBD受试者的额叶皮层存档时间超过20年(c） 蛋白质产量相似。
利用抗原回收和分离提取的蛋白质优化α-Syn-SAA。(一)不同组织制剂蛋白质产量的比较；(b条)从对照组的FFPE顶叶皮层和LBD受试者的颞叶皮层和黑质获得的蛋白质产量，已存档<2年（LBD 1）；(c（c）)从四名LBD受试者的FFPE额叶皮层获得的蛋白质产量已存档20年以上（LBD 2-5）；(d日)αSyn接种来自PBS可溶部分的连续稀释总蛋白，在蛋白提取之前使用抗原回收和分离提取；(e（电子）)从PBS可溶性级分中连续稀释的总蛋白的αSyn接种，在没有抗原回收或解离的情况下提取；(（f）)使用5µg PBS可溶部分总蛋白评估α-Syn种子接种潜力，这些总蛋白是在蛋白质提取之前通过抗原回收和分离从不同组织制剂中提取的；(克)<2年存档的FFPE LBD人脑组织中α-Syn种子活性的受试者间和受试者内异质性(n个= 1; 颞皮质和黑质）和>20岁(n个= 4; 额叶皮层）与FFPE对照人脑组织(n个= 1; 顶叶皮层和小脑）；(小时)不同组织制剂的曲线下面积、T50和最大ThT值；(我)αSyn种子的受试者间和受试者内异质性的曲线下面积、T50和最大ThT值。****，第页<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（ANOVA）。
3.3.2. 利用FFPE提取蛋白优化α-Syn-SAA
我们比较了使用缓冲液1从4-mm FFPE微穿孔中接种αSyn，以及在提取蛋白质之前是否进行额外的抗原回收和分离。当我们评估通过抗原检索和分离提取的系列稀释蛋白质的接种时，我们观察到在4个LBD复制品中连续接种5和10µg蛋白质的αSyn(d） ●●●●。我们观察到，随着总蛋白量的增加，最大ThT值降低，这可能是由于其他大分子的存在，这些大分子在浓度更高的样品中作为潜在的抑制剂，可能抑制SAA反应。所有四种稀释液的对照病例均为阴性。然而，在提取蛋白时没有进行抗原回收和分离，我们观察到，在所有四种稀释液的四个重复中，α-Syn的接种是不一致的，对照组也显示阳性曲线，蛋白含量为1.25和1.50µg(e） ●●●●。在蛋白质提取之前，如果没有抗原回收和解离，LBD和对照之间的区别就不清楚，即使是4毫米的微穿孔也不足以在FFPE LBD组织中持续植入错误折叠的αSyn。相反，通过抗原提取和分离提取的5µg蛋白质足以在FFPE LBD受试者的四个重复中产生一致的阳性αSyn种子，而对照组则显示阴性曲线。因此，我们在所有SAA中使用了5µg总蛋白。
3.3.3. 用不同组织制剂从FFPE组织中提取蛋白质的αSyn种子
比较不同类型组织制剂中αSyn的接种情况，LBD受试者的FFPE颞叶皮层的4mm和2mm微穿孔均显示阳性曲线(f） 有显著不同(第页<0.0001）来自对照组顶叶皮层(h） ●●●●。因此，我们确定2毫米的微穿孔足以用于未来的实验。有趣的是，从载玻片上45-µm FFPE切片中提取的蛋白质不仅存在显著差异(第页<0.0001），但也有显著差异(第页<0.0001）与从45-µm FFPE切片中提取的蛋白质在试管中接种相比(h） ●●●●。在脱蜡过程中，我们观察到，尽管存在严格的涡流，但自由浮动FFPE涡卷的某些区域并未完全接触到二甲苯。我们怀疑，与载玻片上的脱蜡相比，管中FFPE段的脱蜡不足可能是导致αSyn的播种量显著降低和延迟的原因。因此，在提取蛋白质之前，FFPE组织脱蜡并在载玻片上再水化，可以彻底脱蜡，从而在提取过程中增加蛋白质量，并提高αSyn种子活性的可靠性。
3.3.4. 保存20年以上的FFPE组织提取蛋白质的αSyn种子
为了测试种子是否保存在存档时间超过20年的FFPE人脑组织中，我们对存档时间>20年的另外四名LBD受试者的额叶皮层进行了SAA，受试LBD受试者的颞叶皮层和黑质存档时间<2年，试验对照组受试者的顶叶皮层和小脑记录<2年。我们不仅观察到α-Syn种子，还观察到种子活动中受试者之间和受试者内部的变异性(g） 。α-Syn种子显著不同(第页<0.0001）在存档<2年的LBD1的颞皮层和黑质之间，以及LBD2额叶皮层的αSyn种子之间存在显著差异(第页<0.0001）来自LBD 3–5的额叶皮层(i） ●●●●。所有LBD曲线都有显著差异(第页＜0.0001）。
3.4. 分离前后蛋白质提取效率和αSyn种子活力的比较
考虑到在解离步骤中剧烈的组织处理可能导致蛋白质在过程中丢失，我们测试了解离步骤是否可以消除。我们使用了来自受试对照受试者的顶叶皮层和小脑、来自受试LBD受试者黑质和来自受试MSA受试者小脑的2mm FFPE微穿孔。为了比较LBD和MSA，我们使用了我们小组先前建立的支持LBD和避免MSA的SAA协议。在对照、LBD和MSA受试者的所有FFPE组织中，与在提取蛋白质之前同时进行抗原提取和解离的组织相比，仅进行抗原提取的组织中提取的蛋白质产量显著较低(a） ●●●●。与我们的提取结果一致，从LBD和MSA FFPE组织中提取的仅提取抗原的蛋白质与提取和分离抗原后提取的蛋白质相比，显示出更长的延迟期和更低的AUC。另一方面，当只提取抗原时，对照FFPE组织显示出自发聚集。
LBD和MSA FFPE脑组织中α-Syn种子活性的比较，无论是否分离提取。(一)在使用PBS提取蛋白质之前，仅通过抗原提取或同时进行抗原提取和分离，从受试对照受试者顶叶皮层和小脑、受试LBD受试者颞叶皮层和受试MSA受试者小脑的2mm FFPE微穿孔中获得的总蛋白质产量；(b条)评估LBD中有利于SAA的疾病特异性αSyn种子，并比较从游离或非游离（仅抗原回收）组织中提取的蛋白质的αSyn播种活性；(c（c）)评估MSA-favouring SAA中疾病特异性αSyn种子接种，并比较从游离或非游离（仅抗原回收）组织中提取的蛋白质的αSyn接种；(d日)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于比较使用LBD-有利SAA提取的PBS可溶部分中的αSyn种子活性；(e（电子）)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于比较使用MSA-favouring SAA提取的PBS-可溶部分中的αSyn种子活性。***，第页< 0.001; ****,第页通过Tukey多重比较检验的单因素方差分析（ANOVA），<0.0001。
支持LBD的SAA比MSA更能放大LBD中错误折叠的αSyn的种子。当仅用抗原回收法提取蛋白质时，LBD的αSyn种子接种为阴性，而用抗原回收和分离法均观察到种子接种，显示出显著差异(第页<0.0001）在LBD组织之间播种，有或没有分离(b、 d）。另一方面，MSA-favouring SAA比LBD更能放大MSA中错误折叠的αSyn的种子。使用MSA-favouring协议，当仅使用抗原检索提取时，LBD的αSyn种子与同时使用抗原检索和分离提取的相比AUC更低(c） ●●●●。这表明存在显著差异(第页<0.0001）LBD组织的αSyn接种与未分离之间(e） ●●●●。最后，当仅用抗原回收提取蛋白质时，MSA的αSyn种子与用抗原回收和分离提取的蛋白质相比，AUC更低，显示出显著差异(第页<0.0001）在MSA组织之间播种，有或没有分离(e） ●●●●。
3.5. FFPE人脑组织中疾病特异性播种模式的复制
为了进一步验证我们优化的蛋白质提取和SAA结果，我们比较了使用5µg从2-mm FFPE微穿孔中提取的蛋白质、用二甲苯-乙醇脱蜡、在使用缓冲液1提取蛋白质之前进行抗原回收和分离处理的额外LBD和MSA受试者。LBD有利于SAA，与MSA相比，LBD显示出最高AUC和最大ThT值，而MSA显示出较LBD更低的AUC和更低的最大ThT，以更高的对比度放大LBD(a） ●●●●。LBD的αSyn种子有显著差异(第页<0.0001）来自控制(c） ●●●●。使用MSA-favouring SAA，我们观察到MSA中的AUC高于LBD，而LBD中错误折叠的αSyn显示阳性种子，但AUC低于MSA，以更高的对比度放大MSA曲线(b） ●●●●。MSA的αSyn接种与对照组显著不同(第页<0.0015）和LBD(第页< 0.0001) (d） ●●●●。我们没有在对照组中观察到播种。这与我们之前使用LBD和MSA-favouring SAA协议在尸检后冷冻人脑组织中的发现一致[20,21]. 最重要的是，在随后的LBD有利于SAA反应中，当接种SAA终产物时，LBD和MSA之间的α-Syn接种差异可以通过模板传递，并且两个曲线都显著不同(第页<0.0001）相互比较(图S2).
LBD和MSA FFPE脑组织中保存的α-Syn疾病特异性的生化和超微结构验证。(一)LBD偏爱SAA时观察到的疾病特异性αSyn种子差异；(b条)MSA预防SAA中观察到的疾病特异性αSyn种子差异；(c（c）)曲线下面积、T50和最大ThT值，用于使用有利于SAA的LBD比较LBD、MSA和对照FFPE人脑组织中的αSyn接种活性；(d日)使用MSA-favoring SAA比较LBD、MSA和对照FFPE人脑组织中αSyn种子活性的曲线下面积、T50和最大ThT值；(e（电子）)利用LBD FFPE颞叶皮层透射电镜证实SAA生成的αSyn纤维中观察到的偶尔扭转；(（f）)TEM证实使用MSA FFPE小脑在SAA生成的αSyn纤维中观察到厚的缠绕扭曲。**，第页< 0.01; ****,第页<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（ANOVA）。比例尺输入(e（电子）)表示100 nm。
总之，我们已经证实，FFPE人脑组织在短期和长期存档材料中保留了播种潜力，最重要的是，显示了LBD和MSA受试者之间的疾病特异性播种。我们的优化协议概述于表S1.
3.6. 疾病特异性FFPE衍生αSyn的结构验证
为了证实文献中报道的LBD和MSA之间的结构差异，我们在TEM下评估了种子试验期间产生的纤维。我们使用优化的蛋白质提取方案从另一名FFPE LBD和MSA受试者（LBD 6和MSA 2）中提取蛋白质，存档时间<2年。我们证实了LBD和MSA中αSyn原纤维之间的疾病特异性超微结构差异，其中LBD种子反应产生的原纤维具有长而薄的原纤维，偶尔有扭曲(e） 与MSA-必需反应生成的纤维相比，该反应具有较薄的纤维，且纤维缠绕且经常扭曲(f） ●●●●。
4.讨论
在这项研究中，我们证明了错误折叠的αSyn的疾病特异性接种，包括生成的纤维的超微结构差异，在FFPE人脑组织中得以保存(). 据报道，从FFPE组织中提取足够数量的高质量蛋白质具有挑战性[28,29]. 许多研究已经研究了不同的脱蜡方法和提取缓冲液，包括商用的FFPE蛋白质提取试剂盒，以从FFPE组织中获得更高的蛋白质产量[47,48,49,50]. 尽管商用蛋白质提取试剂盒可有效用于蛋白质组分析，但提取会使蛋白质悬浮在由专用试剂组成的提取缓冲液中，这可能会改变SAA的性能。为了克服这些局限性，我们的研究建立了一个优化的蛋白质提取方案，该方案使用抗原检索和分离来去除石蜡残留物和反向交联，用一种简单的PBS缓冲液（通常用于均质死后冰冻脑组织以备SAA），留下一个可用于蛋白质提取的游离组织颗粒。与FFPE提取试剂盒和其他提取方法不同，我们的协议还避免了将缓冲区结转至SAA，保留了原始SAA缓冲区组成。此外，组织颗粒可以在任何选择的缓冲液中重新悬浮，从而广泛适用于其他SAA协议或生化分析。
先前的SAA研究报告了在PD、偶发LBD和MSA受试者的甲醛固定人体组织中检测到错误折叠的αSyn，最近，Hepker等人利用苍白球的FFPE核心开发了一种动力学分析播种能力恢复（KASAR）协议，具有很高的灵敏度和特异性[51,52,53]. 然而，尽管取得了成功的发现，但脑组织固定的时间相对较短（18小时），或在浓度较低的甲醛溶液中（4%），或固定在不会迅速渗透组织的多聚甲醛中。不幸的是，这并没有反映出大多数医院和智库使用的组织处理程序。在本研究中，在全身组织处理和石蜡包埋之前，我们的所有脑组织都在10%中性缓冲甲醛中处理了2至3周，这突出了我们的研究结果在许多医院、脑库和研究实验室存档的FFPE人脑组织中的适用性。此外，我们获得了较高的蛋白质产量，并在20多年前固定并嵌入石蜡的FFPE人脑组织中观察到αSyn种子。最重要的是，为了保存疾病特异性αSyn种子，我们避免长时间暴露在高温下进行交联逆转，因为不清楚长时间暴露于高温是否会改变原纤维结构或导致部分蛋白质损失。
此外，通过我们简化的方案，包括抗原检索和分离，从2mm FFPE微穿孔中提取的蛋白质足以产生阳性种子活性。我们还证明，FFPE脑组织中保留了疾病特异性种子活性。我们发现，在两种有利于LBD或MSA播种的条件下，MSA受试者始终表现出较高的播种活动，与LBD受试者相比，延迟期更短。在TEM下评估FFPE SAA生成的αSyn纤维时，优化方法还可以捕获LBD和MSA纤维之间的超微结构差异。这一发现与文献中报道的结构变异性相一致，LBD受试者薄αSyn纤维的形成可能是由于用冷冻电子显微镜观察到的单丝结构所致，而MSA受试者厚交织纤维的形成则可能是由于两种不同的原丝构成的纤维结构所致[10,11].
在单个人脑组织中，多种αSyn多晶型可能存在于不同的亚细胞位置。目前尚不清楚在FFPE蛋白质提取过程中是否优先提取蛋白质子集（即膜或细胞质），或者蛋白质提取步骤中的某些过程是否会导致可溶性或不溶性蛋白质的部分去除，这强调了需要谨慎解释。尽管存在这一局限性，但我们使用优化的FFPE蛋白质提取和SAA方法观察到LBD和MSA受试者之间存在明显差异。冷冻组织作为蛋白质分析和种子试验的金标准，我们简化的蛋白质提取方案可以揭示FFPE人脑组织中保存的疾病特异性种子活性。这将允许重新评估大量存档FFPE组织，为未来基于蛋白质的研究铺平道路。
5.结论
据我们所知，这项研究首次概述了死后FFPE人脑组织中LBD和MSA之间的疾病特异性差异。我们开发了一种简化的蛋白质提取方案，将FFPE组织的用途扩展到免疫组织化学目的之外。此外，我们的研究扩大了对不同α-Syn多态性的研究，并基于种子差异对疾病进行了进一步的亚类化，使用大量可用且高度特征化的FFPE人脑组织作为冷冻组织的替代品。
致谢
作者特别感谢患者及其家人的捐赠。我们感谢Lindsey Fiddes和多伦多大学Temerty医学院显微成像实验室对透射电子显微镜成像技术的支持，以及Ali Karakani的技术支持。我们感谢Joel Watts在设备使用方面的支持。图1是用Biorender.com设计的。
资金筹措表
这项研究得到了爱德蒙德·萨夫拉慈善基金会、克伦贝尔基金会、马来亚银行基金会和罗西基金会的支持。A.K.得到了神经退行性疾病研究中心（CRND）研究生基金会、联合利华/利普顿神经科学研究生奖学金和杰西·凯欣研究生奖的支持。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析或解释，也没有参与手稿的撰写。
作者贡献
概念化、A.K.、I.M.-V.、A.E.L.和G.G.K。；方法，A.K.、I.M.-V.和G.G.K。；验证、A.K.、I.M.-V.和G.G.K。；形式分析，A.K.和G.G.K。；调查、A.K.、I.M.-V.、J.L.和G.G.K。；资源、A.E.L.和G.G.K。；书面原稿编制，A.K.和G.G.K。；写作审查和编辑，A.K.、I.M.-V.、J.L.、A.E.L.和G.G.K。；可视化、A.K.和G.G.K。；监督，G.G.K。；项目管理、A.K.、I.M.-V.和G.G.K。；资金收购、A.E.L.和G.G.K.所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
机构审查委员会声明
本研究由大学健康网络研究伦理委员会（编号20-5258）批准。
知情同意书
在征得患者或其亲属的知情同意并获得当地机构审查委员会批准的情况下，收集人脑的尸检组织。
数据可用性声明
本研究中提供的数据可向相应作者索取。
利益冲突
G.G.K.拥有5G4抗体的共享专利。其他作者声明没有相互竞争的利益。
脚注
免责声明/出版商注释：所有出版物中包含的声明、意见和数据仅为个人作者和贡献者的声明、观点和数据，而非MDPI和/或编辑的声明、看法和数据。MDPI和/或编辑对内容中提及的任何想法、方法、说明或产品造成的任何人员或财产伤害不承担任何责任。
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