介绍
染色质在细胞核内高度组织化,异染色质在细胞核外围(NP),常染色质在核质中[1]. 在特定的细胞类型、年龄和疾病中观察到异染色质分布的改变,这提出了一个问题,即是什么介导了细胞核内适当的异染色素组织[2–6].
核膜(NE)相关蛋白,包括层粘连蛋白和内核膜蛋白,对于NP处异染色质的正确系留非常重要。这些蛋白作为锚,通过适配器蛋白(如异染色素蛋白1(HP1)、,这些蛋白质的缺失通常会干扰外周异染色质的定位[7–15]. 最近,还发现了细胞型特异性异染色质锚定,其功能是在外围连接细胞型特异基因[16–18]. 这表明,调节NE相关蛋白质组可以影响染色质组织,这在细胞命运的背景下可能具有更广泛的意义。
组蛋白翻译后修饰(PTMs)在异染色质组织中也是至关重要的。外周异染色质的一个经典标志是组蛋白H3在赖氨酸9(H3K9me2/3)上的二甲基化和三甲基化,并且它被几个赖氨酸甲基转移酶沉积是异染色素在NP定位所必需的[19–21]. 这些异染色质标记的缺失与外周异染色素的丢失有关,这是细胞核内染色质组织正常的另一个关键因素[22–24].
此外,转录和染色质致密化参与异染色质在NP的定位。例如,人工诱导的外周相关基因的转录或染色质去凝聚使其重新定位到核内部[25,26]. 相反,转录减少可以增加基因与NP的接触[25]. 总的来说,这些例子描述了异染色质组织的重要介体,它们必须受到严格的调控才能在细胞核内建立常规染色质模式。
在这里,我们提出了一个有趣的现象,即NE相关蛋白Lamin B1(LmnB1)的过度表达(OE)改变了染色质组织,从而导致外周异染色质丢失,并在核质内形成异色DNA焦点。以前曾报道过LmnB1 OE染色质组织的类似变化,但表明这是Lap2表达减少或衰老诱导的结果[27,28]. 在另一项研究中,LmnB1 OE也被证明能诱导衰老,但研究表明,LmnB1OE诱导的衰老与hTERT表达不相容[29].
在我们利用hTERT永生化的RPE1细胞进行的研究中,我们观察到这些异染色质病灶可以独立于衰老形成。此外,LmnB1 OE似乎不会减少其他NE相关蛋白或组蛋白甲基化标记的表达,这些标记在外周异染色质栓系中很重要。这表明染色质组织的这些变化涉及一种独特的机制。鉴于LmnB1在特定类型的癌症(如肝细胞癌、肺腺癌、肾透明细胞癌)和某些神经系统疾病(如成人型常染色体显性白质营养不良、共济失调毛细血管扩张症)中高度表达[27,30–35],我们探讨了LmnB1 OE诱导的染色质重组对基因表达的影响。我们发现了100多个调控错误的基因,并观察到许多基因在LmnB1 OE上表达下调。
材料和方法
抗体
Lamin B1(sc-56144;IF 1:250)和Lap2(sc-28541;IF 1:500;WB 1:1000)抗体购自Santa Cruz Biotechnology;Lamin A(L1293;IF 1:1000;WB 1:1000)抗体购自Sigma-Aldrich;LBR(12398–1-AP;IF 1:100;WB 1:1000)抗体购自赛默飞世尔科学公司;HP1α(#2616;IF 1:200;WB 1:1000)、H3K27me3(#9733;IF 1:1600)和β-肌动蛋白(#3700;WB 1:1000)抗体购自Cell Signaling Technology;H3K9me3(ab8898;IF 1:500;WB 1:1000;Cut&Run 1:100)抗体购自Abcam;H3K9me2(#39041;IF 1:500;WB 1:2000)抗体购自Active Motif;GAPDH(MAB5718;WB 1:5000)抗体购自研发系统。
免疫荧光显微镜
细胞生长在盖玻片上,并在室温下用4%PFA在1×PBS中固定5分钟。用IF缓冲液(10 mg/mL BSA,0.1%Triton-X-100,0.02%SDS,在1×PBS中稀释)封闭盖玻片20分钟,然后用稀释在IF缓冲中的一级和二级抗体孵育。盖玻片用Hoechst(1μg/mL,分子探针)短暂孵育,并用Vectashield(Vector Labs)固定。在徕卡SP8共焦显微镜上使用63×1.4NA油浸物镜进行成像。斐济被用于量化LmnB1的荧光强度,并生成表示DNA与SAHF标记共定位的绘图剖面。LmnB1荧光强度值归一化为mCherry稳定细胞系中观察到的平均荧光强度。线扫描通常是通过单个核的短轴生成的。然而,在过度表达LmnB1的细胞中,轴是根据诱导的DNA焦点的定位来选择的。对于RPE1克隆细胞系,分析每个OE构建体的两个克隆系,并进行两个生物复制(n个 = 4) ,除非图图例中另有规定。对于IMR90细胞系,进行了三次生物复制(n个 = 3).
电子显微镜
如前所述,通过电子显微镜制备培养细胞[37]. 简单地说,细胞在10厘米的培养皿中培养到大约70%的汇合处。轻轻倒出培养基,并在含有3 mM CaCl的100 mM二羧酸缓冲液中加入约1 mL 2.5%戊二醛2轻轻添加预热至37°C的(二羧酸缓冲液)并旋转。将约5 mL冰镇固定剂轻轻添加到培养皿中,并将细胞固定在冰上30分钟。细胞用冰镇二羧酸缓冲液清洗三次,然后染色45分钟用1.5%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾在二羧酸缓冲液中在黑暗中在室温下还原分钟。用冰水冲洗盘子三次,然后用细胞刮刀将细胞从培养皿中释放出来,并在Eppendorf管中造粒进行进一步处理。
细胞颗粒在4°C下用1%醋酸铀酰染色过夜,并用冰水清洗三次。通过改变冰镇溶液中乙醇浓度的增加,使细胞连续脱水,然后在室温下在无水乙醇中进行两次培养45分钟。然后用Epon 812(电子显微镜科学)渗透细胞,并将其嵌入Eppendorf管中。使用金刚石刀(Diatome)在超薄切片机(徕卡UC7)上采集每个细胞系的超薄切片(60 nm),并在Carl Zeiss Libra 120kV PLUS能量过滤透射电子显微镜上进行成像。
使用斐济量化NP处的异染色质高度。垂直于核膜进行测量,每100 nm记录一次最大高度。共评估了11μm的NE,仅包括双膜清晰可见的区域。
CellEvent衰老绿色检测试剂盒
RPE1细胞用多西环素培养9天,或用多柔比星(500 nM)处理48小时,然后PBS洗脱培养9天后收集。在使用CellEvent衰老绿色检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行衰老检测的前一天,将细胞接种到ibidi 8孔室中。根据制造商的协议制备样品。每个细胞系中可见50多个细胞,其中一个克隆系过度表达mCherry,两个克隆系过量表达LmnB1。分析每个细胞系的两个生物复制品。
Click-It EdU图像工具包
细胞生长在盖玻片上,并使用3μM的蚜虫灵在1/S阶段滞留24小时,然后用多西环素和10μM EdU孵育蚜虫灵处理后的额外24小时。根据Click-iT EdU荧光检测协议(Thermo Fisher Scientific)制备盖玻片,并在徕卡SP8共焦显微镜上用63×1.4NA油浸物镜成像。每个OE构建体在两个克隆细胞系中观察到50多个细胞,每个细胞系有两个生物复制。
蛋白质印迹
在RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1%Triton-X、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS)中裂解细胞,并使用BCA蛋白质测定法(Thermo Fisher Scientific)对蛋白质浓度进行标准化。在孵育前,用5%脱脂牛奶在1×TBST中封闭膜15分钟,在封闭缓冲液中稀释初级和次级抗体。次级抗体与HRP结合用于检测。用两个生物复制品对每个OE构建体的两个克隆细胞系进行分析。
切割和运行排序
用强力霉素处理RPE1细胞24小时,每个样本采集500000个细胞。样本包括每个OE构建的两个克隆细胞系,以及两个技术复制品。将H3K9me3抗体(ab8898)在抗体结合缓冲液中稀释为1:100。切割和运行是根据EpiCypher CUTANA协议执行的,但以下情况除外。抗体结合期间未添加CUTANA H3K4 MetStat Spike-in Control dNucs(第四节)。大肠杆菌在染色质消化后添加之前,将刺入DNA稀释为1:10(第六节)。
根据制造商的协议,使用NEBNext Ultra II文库试剂盒Illumina制备纯化的Cut&Run DNA进行测序。mCherry样品使用约15μL的切割和运行DNA,LmnB1样品使用8μL的切割和运行DNA。在连接接头之前,将接头以1:15稀释。约4 uL的i7和i5引物组合用于PCR扩增。在Illumina NextSeq平台上对库进行测序(配对端75)。
质量检查后(fastQC;https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)读数被删减(TrimGalore;https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore网站/)与人类基因组hg38和BWA对齐[43]. 重复读取用Picard Toolkit标记(https://broadinstitute.github.io/picard网站/)如果满足以下任何标准(适用于正向和反向对端读取),则将其过滤掉:读取映射到ENCODE黑名单的、标记为重复的、未唯一对齐的,或配对方向或距离/染色体错误的[44,45]. 为了可视化,使用deeptools(bamCoverage)创建了重要人物轨迹[46]. 使用epic2调用峰值(仓大小1000,允许间隙3[47]; 带输入控制)。差异绑定[48]用于研究H3K9me3在过度表达mCherry和LmnB1的细胞中的差异沉积;未观察到差异性H3K9me3区域,调整后的p值<0.05。使用HOMER注释峰值[49]和生物导体包ChIPseeker[50]. FeatureCounts(Rsubread Bioconductor包[51]; 用于计算H3K9me3 Cut&Run在基因和启动子区域的读取数。如上文mRNA测序部分所述,使用DESeq2的缩放方法对读取计数进行标准化。如果H3K9me3标记了转录起始位点(TSS)、启动子(来自TSS的<3kb)或基因体,则在H3K9 me3峰值内称为基因。
DamID排序分析
之前发布的RPE1细胞LmnB1 DamID数据集来自4D核小体数据存储库[52]4DNFIMZGJCYC和4DNFIRDCJXYU)。使用床上工具仅过滤所有重复试验中出现的峰值[53]并用ChIPseeker注释[50]. 如果LmnB1结合的基因在两个重复中与LmnB1-DamID峰重叠,并且如果LmnB1-DamID峰与TSS或启动子重叠(TSS中<3kb),则称为LmnB1绑定的基因。使用超几何检验确定差异表达基因与H3K9me3峰、LmnB1峰或两个峰重叠的显著性(Bioconductor软件包GeneOverlap)[53].
统计分析
使用GraphPad Prism进行正态性和Mann-Whitney试验(双侧)。在RStudio进行超几何检验(双侧)。必要时,对所有p值进行调整以进行多次比较。
数据可用性
RNA-sequencing和Cut&Run-sequencing数据可在GEO:GSE212110上获得。
结果和讨论
拉明B1过度表达改变异染色质组织
越来越多的人类疾病,包括癌症,与LmnB1的错误表达有关[27,30,32,33,35]. 为了专门研究LmnB1 OE的功能后果,我们建立了两个细胞系RPE1和IMR90,其中包含稳定整合的多西环素诱导的mCherry标记LmnB1的OE。免疫荧光成像显示,多西环素诱导使LmnB1的表达增加约两倍,这在先前报道的LmnB1高水平特定类型癌症的范围内[32,35,54]. 此外,我们观察到LmnB1 OE与染色质组织的变化相一致,从而在细胞核内形成点状DNA病灶(补充图S1A,S1B)。这在超过80%的过度表达LmnB1的细胞中很明显,在LmnB1-ΔCaaX的OE中没有观察到,LmnB1是一个四氨基酸缺失突变体,阻止其翻译后处理和插入NE。此外,在Lap2β的OE上没有观察到这些变化,一种与LmnB1相互作用的内核膜蛋白。重要的是,尽管RPE1细胞是近二倍体的,并且是hTERT的永生化细胞,但在RPE1和IMR90细胞中都观察到了这种表型。这表明LmnB1必须经过适当处理并在NE过度表达,以引起染色质组织的这些变化。
接下来,我们对LmnB1的OE上形成的DNA焦点进行了表征。通过免疫荧光成像,我们观察到DNA病灶与H3K9me3共定位(). 此外,在LmnB1 OE(70/70个核)诱导的染色质组织发生这些变化的每个细胞中都检测到这种共定位。我们还注意到NP处H3K9me3信号同时减少,在脱去强力霉素后24小时内恢复(补充图S2)。此外,我们确认LmnB1表达在24小时内减少(补充图S2)。这表明LmnB1 OE可能阻止异染色质在NP的定位,导致核质内异染色斑的异常形成。
层粘连蛋白B1过度表达改变了核膜异染色质的定位。(a) 用强力霉素处理24小时并用H3K9me3标记的RPE1稳定细胞系的典型共焦图像。图中显示了穿过原子核中心的单个z切片。右侧的曲线图显示了mCherry和LmnB1稳定细胞系图像中白色虚线上DNA(Hoechst)和H3K9me3之间的荧光信号重叠。在过度表达LmnB1的细胞中,70/70个细胞核在H3K9me3和DNA病灶之间显示共定位。(b) 用强力霉素处理24小时的RPE1稳定细胞系的典型透射电镜图像。箭头表示核膜内有异染色质。虚线表示所采取的示例测量。在总长度为11µm的范围内,每隔100 nm测量一次异染色质垂直于内核膜的最大高度,并在右侧绘制。误差线表示平均值±标准偏差。统计显著性的Mann-Whitney检验:****第页 < 0.0001. C=细胞质;N个 = 核心。
为了证实免疫荧光成像检测到的外周异染色质的变化,我们对这些细胞进行了透射电子显微镜(TEM)处理,异染色素可以清楚地显示为NE下的电子密集信号(,箭头)。补充了我们用免疫荧光观察到的结果()TEM成像显示LmnB1 OE外周异染色质显著减少或丢失(). 此外,在过度表达LmnB1的细胞中,NP处异染色质高度的测量值显著降低。总之,我们的数据表明,NE处LmnB1的OE阻止了细胞核内的异染色质组织。
拉明B1过度表达不会诱导衰老表型
由于LmnB1 OE与表达hTERT的细胞的衰老无关[29],我们想直接测试染色质组织中观察到的变化是否与衰老无关。为了解决这个问题,我们首先分析了我们在系统中观察到的DNA病灶和衰老相关异染色质病灶(SAHF)之间的潜在相似性,这两种病灶已被证明在衰老细胞中形成[5,55,56]. 此前,我们提出了DNA病灶与H3K9me3(SAHF的一个标记)之间的共定位(). 因此,我们检测了SAHF的其他标记物,包括HP1α、H3K9me2和H3K27me3。我们在约86%(42/49)的细胞核中观察到DNA病灶与HP1α共定位,但与H3K9me2没有共定位(图S2A、S2B)。此外,我们没有观察到H3K27me3的任何主要定位变化,这表明在SAHF的H3K9me3核心周围形成了一个环[55] ().
拉明B1过度表达诱导DNA病灶与HP1α共定位,但不与H3K9me2或H3K27me3共定位。用强力霉素处理24小时并用(a)HP1α、(b)H3K9me2和(c)H3K27me3标记的RPE1稳定细胞系的典型共焦图像。图中显示了穿过原子核中心的单个z切片。右侧的曲线图显示了mCherry和LmnB1稳定细胞系图像中白色虚线上DNA(Hoechst)和HP1α、H3K9me2或H3K27me3之间的荧光信号重叠。在过度表达LmnB1的细胞中,诱导的DNA病灶在42/49个细胞核中与HP1α共定位,但在>50个细胞核中未与H3K9me2或H3K27me3共定位。
我们还使用CellEvent衰老绿色检测试剂盒监测LmnB1 OE后9天的衰老诱导。同时,我们用阿霉素处理RPE1细胞,以在我们的系统中显示出积极的衰老诱导作用。与之前的发现一致,我们在LmnB1 OE上没有观察到任何衰老细胞(补充图S3)[29]. 综上所述,这表明我们系统中LmnB1 OE诱导的DNA焦点与衰老无关,并且是SAHF独有的。
拉明B1过度表达影响外周异染色质的栓系
为了了解LmnB1 OE如何改变外周异染色质定位,我们首先询问这些变化是否代表异染色质在NP处的靶向或束缚缺陷。由于异染色质必须在每次细胞分裂后重新定位到NP,我们评估了LmnB1 OE在没有有丝分裂的情况下是否仍能引发异染色质组织的相同变化。为了验证这一点,我们首先用蚜虫灵将细胞阻滞在G1/S期,然后用强力霉素诱导LmnB1 OE。通过免疫荧光成像,我们观察到超过55%的过度表达LmnB1的滞留细胞中形成了与H3K9me3共定位的DNA病灶(). 胸腺嘧啶核苷类似物EdU缺乏荧光信号证实,当LmnB1过度表达时,这些细胞没有进行DNA合成。这表明我们观察到的表型独立于与有丝分裂相关的染色质重组,并表明LmnB1 OE可能会破坏完整细胞核中NP处异染色质的栓系。
层粘连蛋白B1过度表达导致染色质组织的改变并不依赖于有丝分裂。如顶部示意图所示,RPE1稳定细胞系用蚜虫灵捕获,然后用强力霉素和EdU孵育。每个OE构建的两个克隆细胞系显示了H3K9me3定位和EdU掺入的典型共焦图像。图中显示了穿过原子核中心的单个z切片。底部的曲线图显示了mCherry和LmnB1稳定细胞系图像中白色虚线上DNA(Hoechst)和H3K9me3之间的荧光信号重叠。该分数表示核内DNA病灶的细胞数量占所分析细胞总数的比例。此外,在具有核内DNA病灶(40个核和72个核)的过度表达LmnB1的细胞中,所有细胞均与H3K9me3共定位。
由于已知异染色质栓系由NE相关蛋白介导,我们评估了这些蛋白是否会受到LmnB1 OE的干扰。我们监测了经典NE相关异染色质锚定的定位和表达,包括Lamin A、Lap2和Lamin B受体(LBR)。然而,我们没有观察到这些蛋白质的定位或表达有任何变化(补充图S4)。虽然先前的研究报告了LmnB1 OE后寡突胶质细胞系(N20.1)中Lap2的表达和定位降低,但作者也报告了当LmnB1过度表达时,神经元细胞系(C17.2)和星形细胞系(SVG p12)中的核膜成分没有变化[28]. 这表明LmnB1 OE可以以细胞类型特异的方式影响核膜的成分。此外,这表明我们在系统中观察到的染色质组织的变化并不是这些NE相关蛋白表达改变的结果。
接下来,我们测试组蛋白PTM或其结合蛋白的变化是否与LmnB1 OE的外周异染色质丢失有关。我们评估了H3K9me2和H3K9 me3的全球水平,这是外周异染色质栓系的重要PTM,但通过western blot未观察到显著变化(). 此外,我们监测了H3K9me3结合蛋白HP1α的水平,但没有发现任何可能影响外周异染色质结合的损失().
Lamin B1过度表达诱导染色质组织的改变并不依赖于H3K9me3水平的改变或沉积。(a) 用强力霉素处理RPE1稳定细胞系24小时,并制备用于H3K9me2、H3K9 me3和HP1α水平的western blot分析。印迹包括每个OE构建的两个克隆细胞系。(b) 通过Cut&Run测序确定H3K9me3沉积的代表性基因组轨迹。图中显示了人类16号染色体(hg38)上的25 Mb区域(57.1–82.1 Mb)。
此外,我们使用H3K9me3特异性抗体的剪切和运行测序来分析PTM在基因组中沉积的任何差异。然而,我们发现过度表达mCherry和LmnB1的细胞之间H3K9me3基因组结合谱高度相似(). 总之,这些结果表明,LmnB1 OE通过一种独立于降低NE相关异染色质锚定或组蛋白PTM水平的机制改变了NP处异染色素的系留。
拉明B1过度表达改变基因表达
接下来,我们想评估LmnB1 OE引起的染色质组织的急剧变化是否会对基因表达产生影响。通过mRNA测序,我们在LmnB1 OE上鉴定了118个下调基因和161个上调基因(; log2倍变化<-1或>1)。这些基因的错误调控与H3K9me3水平的改变无关,这表明基因定位的改变可能会影响基因表达(补充图S5A)。为了验证这个假设,我们评估了在LmnB1 OE之前,错误调控的基因是否可能是外周定位的。我们使用在RPE1稳定细胞系中使用Cut&Run确定的H3K9me3峰值的接近度,或使用之前发布的RPE1细胞中LmnB1 DamID数据集确定的LmnB1域,来建议外围定位[52]. 该分析表明,大量下调和上调基因位于H3K9me3峰或LmnB1结构域附近(). 将此与我们通过免疫荧光观察到的H3K9me3定位变化配对(),我们认为下调基因可能被隔离在H3K9me3 DNA焦点内并被抑制,而上调基因可能更容易在核质内转录或在NP处异常转录,导致其移位到核质。对于不靠近H3K9me3峰或LmnB1结构域的错误调控基因,我们假设这些基因可能受到染色质接触改变的影响,染色质接触可能由染色质组织的改变引起。这些基因的错误调控也可能是基因组LmnB1结构域或H3K9me3区域内基因错误调控引起的次要后果。
拉明B1过表达改变基因表达。(a) 用强力霉素处理24小时的RPE1稳定细胞系中下调、上调和去表达基因的mRNA计数(标准化)。绘制平均+95%置信区间。统计显著性的Mann-Whitney检验:****第页 < 0.0001. (b) 饼图表示LmnB1结构域、H3K9me3峰值、LmnB1域和H3K9 me3峰值附近或两者都不存在的下调、上调和去表达基因的数量。具有LmnB1峰或H3K9me3峰的差异表达基因之间重叠的统计显著性超几何检验:***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001. (c) 基因本体生物学对LmnB1 OE上的去表达基因进行富集分析,显示单个基因的折叠变化。
接下来,我们检查了哪些类型的基因在LmnB1 OE上被错误调节。使用基因本体论生物过程富集分析,我们观察到上调基因中有许多发育途径,但下调基因中没有显著富集(补充图S5B)。这种富集类型表明,LmnB1 OE和染色质组织的变化可能导致该细胞类型中通常被抑制的基因上调,而下调的基因可能代表染色质组织这些变化的次级效应。
为了解决上调基因是否包括那些正常被抑制的基因,我们首先将“去表达基因”归类为那些在我们的对照mCherry细胞系中mRNA计数小于100,但在LmnB1 OE上显示上调的基因。利用这些参数,我们鉴定了179个去表达基因,其中119个基因显示了超过两倍的上调(; 补充表S1)。因此,大约74%的上调基因以前在我们的对照细胞中是沉默的或受到了相当大的抑制。同样,这些基因没有改变H3K9me3的水平,但有相当数量的基因接近H3K9 me3峰值或LmnB1结构域(; 补充图S5A)。基因本体论生物过程富集分析也显示了不同发育途径的类似富集,而这些发育途径不应在这种细胞类型中表达(; 补充表S2)。总之,这支持了我们的假设,即LmnB1 OE与基因去表达有关,并进一步表明LmnB1 EO对细胞命运的更广泛影响。
总之,我们的研究强调了维持适当水平的LmnB1对染色质组织和基因表达调控的重要性。然而,关于不同水平的LmnB1影响这些过程的机制,还有很多有待探索。由于LmnB1 OE可以改变外周异染色质的定位,而不会干扰已知异染色素适配器、系链和组蛋白PTM的表达,这些PTM对异染色剂锚定在NP上很重要,因此我们推测LmnB1 EO可能导致LmnB1相互作用蛋白在NE异常富集,从而破坏异染色蛋白结合[57]. 这些可能包括沉积活性组蛋白标记的组蛋白甲基转移酶或乙酰转移酶,导致这些外周异色区域内的转录或染色质失活,以及它们在远离NP的位置上的错误定位。
至于基因表达的变化,我们预测这些变化至少部分受到过度表达LmnB1细胞染色质组织改变的影响。异常的染色质组织可能导致基因定位、染色质可及性和染色质接触的改变,所有这些都可能改变转录输出。使用DNA荧光评估这些变化很重要就地杂交、转座酶可及染色质测序分析(ATAC-seq)和Hi-C,以更好地了解染色质组织改变与基因表达之间的相关性。
如前所述,监测其他组蛋白PTM的获得或丢失也很重要,因为这有可能影响基因表达。组蛋白PTM的异常沉积可能由LmnB1 OE本身或LmnB1 OEM诱导的染色质组织变化引起。进一步研究活性组蛋白PTM的全球变化将很有意思,因为我们观察到LmnB1 OE上的基因诱导更为明确。然而,评估异染色质标记的潜在损失,如H4K20me,也将很重要,以纳入本分析。然后可以使用切割和运行测序来观察特定组蛋白PTM在基因组中的沉积,以确定它们是否在LmnB1 OE介导的基因表达变化中发挥作用。
总之,我们的发现为未来的研究方向开辟了新的途径,这将加深我们对LmnB1 OE如何改变染色质组织和基因表达的理解。这些发现也可能在LmnB1水平升高的疾病中有更广泛的应用,例如癌症和神经疾病的子集[27,30–35]. 最近研究表明,LmnB1 OE干扰端粒稳定性和对DNA损伤的反应,我们的研究描述了可能影响细胞内环境稳定的其他错误调节过程[58,59]. 因此,必须正确调控LmnB1的表达,了解LmnB1 OE的后果是一个值得进一步研究的领域。