衰老小鼠肝脏COX1表达缺陷

线粒体能量代谢随年龄变化

线粒体膜电位降低，超氧化物生成增加，表明呼吸链功能障碍，伴随着氧化磷酸化过程。因此，我们通过实时呼吸测定法评估线粒体耗氧量，以确定氧化磷酸化是否随年龄而明显下降。在ADP和底物（状态3）的非限制量存在下，积极呼吸的线粒体达到最大生理呼吸。我们发现，与12W年龄的小鼠相比，65W肝脏线粒体的状态3呼吸较低(图2A） ●●●●。添加寡霉素和CCCP来测量非耦合最大呼吸显示出类似的差异。当我们量化每种情况下三次测量所得的平均值时，我们观察到在所有条件下耗氧量都显著降低(图2B） ●●●●。随后，我们测量了NADH和NAD⁺肝组织裂解物中的水平。有趣的是，这两种代谢物在65 W线粒体中都增加了(图2C） ●●●●。然而，全国广告部⁺/两个年龄组的NADH比率相似。令人惊讶的是，实验组肝裂解物中ATP水平的量化显示，65 W小鼠样品中的ATP水平显著升高(图2D） ●●●●。为了评估稳定状态下ATP含量的增加是否是糖酵解增加的结果，我们还测量了相同样品中的乳酸水平，发现在65 W小鼠样品中乳酸水平增加(图2E） ●●●●。因此，我们的结果表明，在老年小鼠的肝脏样本中，呼吸链的活性降低，细胞表现出高度的糖酵解代谢。

在单独的窗口中打开

图2。

线粒体代谢随年龄变化。（A） 通过Seahorse Flux Analyzer对两组新分离的线粒体进行耗氧率测量，以确定线粒体的呼吸容量（平均值±标准差。，n个=4). （B） 基质注射后计算基础呼吸；注射寡霉素后计算解偶联呼吸，注射CCCP后计算最大呼吸。根据三次测量的平均值（平均值±标准偏差，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生吨-测试，n个=4). （C） 使用NAD/NADH比色分析试剂盒（Sigma-Aldrich），从两组中等量的组织裂解物中测定NAD和NADH总量。NAD+被计算为NAD总量与NADH之间的差值。还计算了NAD/NADH比值。NAD+、NADH浓度（吸光度）和NAD/NADH比率归一化为幼鼠样品的平均值（柱散点图显示生物复制品的平均值和分布，*表示P（P）<0.05来自双尾非配对吨-试验，ns=无显著性，n个=3). （D和E）每个队列使用等量的组织裂解物，通过荧光分析试剂盒（Abcam）分别测定ATP和乳酸水平（柱散点图显示生物复制品的平均值和分布，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生吨-测试，n个=3).

线粒体呼吸复合物IV活性随着年龄的增长而降低

65 W小鼠线粒体中观察到的呼吸减少使我们检查了不同小鼠分离线粒体中线粒体DNA的数量。为此，我们使用等量的纯化线粒体，并用RNA酶处理获得的DNA以耗尽线粒体RNA。随后，我们使用实时PCR对线粒体DNA进行定量评估。为了完全覆盖线粒体DNA，我们使用了为几个线粒体基因设计的引物。这些分析表明，12W和65W小鼠的mtDNA拷贝数相似(图3A） ●●●●。接下来，我们分析了线粒体OXPHOS复合体的选定亚基的蛋白质水平。在所述的线粒体蛋白中，只有COX1在老年实验队列中显示减少(图3B） ●●●●。斑点定量分析证实，在65 W队列中，COX1水平仅在统计学上显著降低(图3C） ●●●●。这些发现表明了对呼吸链细胞色素c氧化酶（复合物IV）的选择性作用。因此，我们评估了分离的线粒体中复合物IV的活性。正如稳态蛋白质分析所预期的那样，我们发现在65周的线粒体样品中复合物IV的活性显著降低，与12周的样品相比具有显著的变异性(图3D） ●●●●。这些关于复合物IV活性的发现与COX1稳态水平的降低相一致。

在单独的窗口中打开

图3。

OXPHOS复合物IV随年龄增加而减少。（A） 从接受mtDNA分离和后续qPCR的队列中分离出等量线粒体，以测试不同的mt基因，以估计相对mtDNA量（平均值±标准偏差。，n个=4). （B） 通过Tris-Tricine-SDS-Page和免疫印迹检测OXPHOS，从两组中分离线粒体(n个=3). （C） 使用ImageJ计算曲线下的面积，并将其归一化为Vdac（平均值±s.e.m.，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生吨-测试，n个=3）（D）使用活性测定微孔板试剂盒（Abcam）测量复合物IV活性。复合物IV活性标准化为幼年小鼠样品的活性，显示平均值±标准偏差（*表示P（P）<0.05来自双尾未配对吨-测试，n个=3).

动物

所有小鼠的维护及其研究均根据《德国动物福利法》的指导方针进行，并经德国尼德萨森州的Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit批准（AZ:33-942502-04-14/1720）。这些动物要么被保存在标准啮齿动物喂食WT C57BL/6N小鼠的IVC（单独通风笼）中的高屏障（SPF规定的无病原体）区域，只有动物护理人员才能进入。WT C57BL/6N小鼠历史上是从德国苏尔兹菲尔德Charles River Laboratories，Research Models and Services GmbH获得的。随后，它们被保存在哥廷根马克斯·普朗克多学科科学研究所的动物设施中，直到达到适当的实验年龄。

线粒体分离

在各年龄段处死动物以分离肝脏。然后使用玻璃器皿在15 ml隔离缓冲液（IB）中均匀化这些物质，其中包含10 mM Tris-MOPS pH 7.4、1 mM EGTA/Tris和200 mM蔗糖。在700×克，10分钟，4°C。线粒体以7000×克，10分钟，4°C。然后将其清洗并重新悬浮在隔离缓冲液中，并使用Bradford分析测定其蛋白质浓度。

线粒体蔗糖颗粒纯化

为了从分离的线粒体中去除线粒体外核酸，首先用50 U苯甲酸酶在4°下处理样品30分钟。离心（2×，14000×克（10 min，4°C）和IB中的再悬浮（如线粒体分离所述的成分，含有2.5 mM EDTA）阻止了苯甲酸酶的活性。通过将1体积的含有1.7M蔗糖的分离缓冲液放入离心管中并用2体积的含有1M蔗糖的分离缓冲液覆盖离心管来制备蔗糖梯度。线粒体最终被重新悬浮在1 M蔗糖隔离缓冲液中，并小心地装载到梯度上。在4°C下离心25 min，25000 rpm（SW41Ti，Beckman Coulter）后，从间期分离出线粒体。

线粒体膜电位测量

使用流式细胞仪（FACSCanto，BD Biosciences）对分离的肝线粒体（如上所述）进行膜电位测量。将线粒体重悬于新制备的分析缓冲液（pH 7.0；250mM蔗糖、20mM Tris-MOPS、100µM Pi（K）、0.5mM MgCl₂，5 mM琥珀酸盐，2µM鱼藤酮）。向所有样品中添加100µM四甲基罗丹明-甲酯类-氯甲醚，TMRM（Life Tech；T668），未染色对照品除外，并在室温下对样品进行避光培养10分钟。测量在Ex488/Em590 nm下进行。

线粒体呼吸分析（海马）

通过Seahorse XFe96分析仪（Agilent；S7894-10000）上的呼吸测定法获得新分离的肝线粒体（如上所述分离）的耗氧率（OCR）。线粒体在线粒体测定（MAS）缓冲液（pH 7.4；70 mM蔗糖、210 mM甘露醇、5 mM HEPES、1 mM EGTA、10 mM KH）中重新悬浮₂人事军官_4,5 mM氯化镁₂0.5%BSA（w/v），浓度为0.1 mg/ml。线粒体在Seahorse XF96细胞培养微板（Agilent；101085-004）中校准，并在2000×g下在室温下离心5 min。在Seahorse XFe96传感器盒（Agilent；101085-004）的端口A中，提供丙酮酸盐（MAS缓冲液中0.1 M丙酮酸、40 mM琥珀酸、40 M M ADP）或琥珀酸盐（100µM琥珀酸酯、40µM ADP将溶于MAS缓冲液中的μM抗霉素和鱼藤酮分别添加到传感器盒的端口B、C和D中。测量采用了改进的Mito压力测试方案。这些修改包括取消细胞板的平衡步骤，以尽量减少分离线粒体上的应力时间，并增加另一个端口注射以适应底物。

NAD/NADH测量

NAD的量化⁺/使用NAD测定小鼠肝组织样品中的NADH比率⁺/NADH定量试剂盒（Sigma-Aldrich；MAK037）。遵守了供应商提供的协议。北美_全部的以及NADH在裂解产物的机械裂解和脱保护后在微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）上测量450 nm处的吸光度。为了与NAD分开测量NADH_全部的，北美⁺在60°C下通过30分钟培养进行热分解。

ATP测量

使用ATP检测试剂盒（比色法/荧光法）（Abcam；ab83355）并按照供应商协议的规定测量组织ATP总含量。为了测定总ATP，对小鼠肝组织进行机械裂解和脱蛋白。样品在室温下与反应混合物孵育30分钟，一式三份。使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）测量在570 nm处可检测到的甘油磷酸化产物。

乳酸测量

使用L-乳酸检测试剂盒（比色法/荧光法）（Abcam；ab65330）检测小鼠肝组织裂解物中的乳酸。实验按照供应商提供的协议进行。机械裂解后，样品脱蛋白并分析30分钟。在570 nm处用热量法检测乳酸。测量一式三份，并使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）进行可视化。

线粒体DNA分离

QIAamp®DNA血液迷你试剂盒用于从线粒体中分离线粒体DNA。分离的线粒体（见上文）在提供的样品缓冲液中以1:50稀释，并执行制造商的方案。

RNA的分离纯化

按照供应商的方案，用1ml三唑溶解分离和纯化的线粒体。然后按照制造商的说明用DNase I（ThermoFisher Scientific）处理样品。为了纯化样品，使用了RNA清洁和浓缩试剂盒（R1013，Zymo Research）。使用Nanodrop 2000测量RNA质量和浓度。

cDNA合成与qPCR

cDNA是使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（K1621；ThermoFisher Scientific）合成的，特别是在热循环器（Labcycle Gradient，SensoQuest GmbH）中使用来自分离RNA的随机六聚体引物（如前一节所述）。在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR系统（4485691；ThermoFisher Scientific）上，将该cDNA四倍用于与Sensi Mix SYBR Low-ROX试剂盒（QT625-05；Bioline）的实时PCR反应。根据要求，可提供所用引物的所有引物序列。

Tricine-SDS PAGE和western blot

使用标准方法进行Tricine-SDS-PAGE。样品在T-PER组织蛋白提取缓冲液（ThermoFisher Scientific；78510）中进行溶解。所用凝胶为10-18%梯度凝胶。使用标准的半干转移法进行蛋白质印迹。

细胞色素c氧化酶活性测定

复合物IV啮齿动物酶活性微板分析试剂盒（Abcam；ab109911）用于评估分离的小鼠肝线粒体中细胞色素c氧化酶的活性。该程序按照供应商的指示执行。该检测的原理是使用免疫沉淀的线粒体复合物IV，其活性由细胞色素c的氧化决定。使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）测量细胞色素c吸光度，细胞色素c因氧化而变为无色，在550 nm处可检测到。

图书馆准备

线粒体总RNA被纯化并浓缩在RNA-Clean Concentrator™-5柱上（美国加利福尼亚州欧文市Zymo Research）。cDNA文库是根据牛津纳米孔技术（牛津纳米孔科技有限公司，英国牛津）协议“DNA-PCR测序”用14个周期的PCR（延伸时间为8分钟）从50 ng RNA的混合物中制备的。将ONT适配器连接到650 ng cDNA。

纳米孔测序与分析

使用MinION Mk1b和R9.4.1流式细胞对纳米孔文库进行测序。使用MinKNOW（版本21.11.9）生成数据并进行基本调用。然后将fastq文件上传到Epi2Me实验室（1.1版）的差异基因表达工作流并进行分析。使用Prism 9软件（GraphPad software，San Diego，CA，USA）对获得的转录本计数进行处理，以生成热图和火山图。

统计分析

两组（或多组）数据的平均值之间的显著差异采用非配对分析吨-Prism 9软件（GraphPad software，San Diego，CA，USA）中的测试或方差分析测试，除非另有说明。

作者承认资金部分列出的资金机构。