内源性脂肪酸激活角质形成细胞过氧化物酶体增殖物激活受体-β/δ（PPARβ/δ）

摘要

核激素受体依赖于与配体、蛋白质和染色质的相互作用，在转录活性和非活性复合物之间处于动态平衡。本研究验证了内源性配体激活角质形成细胞过氧化物酶体增殖物激活受体-β/δ（PPARβ/δ）的假说。佛波酯治疗或原代角质形成细胞的HRAS感染增加了与PPARβ/δ活性增强相关的脂肪酸。脂肪酸导致PPARβ/δ依赖性染色质占用和血管生成素样蛋白4表达增加(Angptl4号机组)mRNA分析显示硬脂酰Co-A去饱和酶1(Scd1号机组)调节角质形成细胞中作为PPARβ/δ配体的细胞内单不饱和脂肪酸的增加。用棕榈油酸或油酸激活PPARβ/δ会导致表达HRAS的角质形成细胞在细胞周期的G2/M期停滞，而在类似处理的HRAS表达细胞中没有发现Pparb/d（磅/天）-角质形成细胞缺失。表达HRASScd1号机组-无效小鼠角质形成细胞表现出增强的细胞增殖，这种作用通过用棕榈油酸或油酸处理而减轻。与这些发现一致，PPARβ/δ与GW0742或油酸的配体激活阻止了UVB诱导的非黑色素瘤皮肤致癌作用，这种作用需要PPARβ-δ。这些研究的结果表明，PPARβ/δ在角质形成细胞中具有内源性作用，并可被饮食和细胞成分中的脂质激活。

1.简介

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是配体激活的转录因子。PPAR存在三种亚型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，每种亚型都具有一些独特但重叠的功能[1]. 配体结合后，PPAR与维甲酸X受体（RXR）异源二聚体化，导致用于重塑染色质和改变PPAR靶基因表达的其他蛋白质的募集（例如组蛋白乙酰转移酶、RNA聚合酶）[2]. 细胞对特定配体/信号作出反应，并通过与PPAR相互作用调节细胞活动以维持体内平衡。PPAR介导的转录调控是动态的。有几种调节核受体活性的动态机制，包括：（1）影响内源性/外源性配体可用性的机制，（2）影响受体相对表达的机制，以及（3）调节染色质重塑辅助蛋白的机制[三,4,5,6]. 例如，在禁食期间从脂肪中释放并输送到肝脏的非酯化脂肪酸是PPARα的内源性配体[7]. 在这种机制中，内源性脂肪酸对PPARα的配体激活增加了编码脂质转运蛋白、脂质结合蛋白和脂肪酸稳定酶的靶基因的表达，这些靶基因促进脂质底物产生能量，以满足细胞在禁食期间的需要[7]. 这种PPARα特异性机制对于满足禁食期间细胞的能量需求尤为关键[8]，在大多数物种中每天占主导地位的一种细胞状态。

PPAR的相对表达被用来帮助确定这些转录因子在不同细胞和组织中的重要作用。例如，PPARα在肝细胞中的表达相对较高，这反映在该受体对脂肪酸氧化以在肝脏产生能量的需求上，肝脏是脂质代谢稳态调节的核心组织[7]. 相反，PPARβ/δ在上皮细胞（包括肠和皮肤中的上皮细胞，尤其是角质形成细胞）中以相对较高的水平组成性表达[9,10]. 基于合成配体和转基因模型的研究，现已认识到PPARβ/δ在上皮细胞中具有重要的功能作用[11,12]. PPARβ/δ的配体激活通过PPARβ／δ依赖机制诱导终末分化，从而抑制小鼠原代角质形成细胞和人角质细胞的增殖[12]. 局部应用PPARβ/δ配体也可以通过PPARβ／δ依赖机制对化学诱导的非黑色素瘤皮肤癌进行化学预防，该机制靶向癌前肿瘤，因为角化棘皮瘤的减少仅见于配体治疗的野生型小鼠，而在Pparb/d（磅/天）-无效小鼠[13,14,15]. 有趣的是，在表达高水平HRAS的细胞中，角质形成细胞中PPARβ/δ对细胞增殖的抑制作用更大[13]通过在细胞周期的G2/M期诱导有丝分裂阻滞，通过PPARβ/δ依赖性阴性选择介导对HRAS表达细胞的抑制[16].

细胞、组织和动物模型中的合成配体和遗传操作也有助于阐明PPAR的作用。然而，内源性PPAR配体的鉴定和功能表征仍然难以捉摸[17]. 有证据表明，在没有任何外源配体的情况下，角质形成细胞表现出PPARβ/δ的组成性转录活性[6]. 当PPARβ/δ在小鼠原代角质形成细胞中消融时，400多个基因的表达发生改变[6]. 此外，先前的研究表明，角质形成细胞经佛波酯治疗后会产生内源性PPARβ/δ配体[18]. 基于这些原因，本研究对角质形成细胞中存在内源性PPARβ/δ配体的假设进行了检验，该配体可被识别并具有功能特征。

2.材料和方法

2.1. 角质细胞培养

两天大的新生儿Pparb/d（磅/天）野生型，Pparb/d（磅/天）-空[19],第1页野生型，或Scd1号机组-无鼠标[20]用于分离原代角质形成细胞并如前所述进行培养[21]. 如之前的研究所示，角质形成细胞在使用佛波酯（佛波酯-12-氨基丁酸-13-乙酸酯；TPA）治疗后会产生内源性PPARβ/δ配体[18]，如前所述，在含有25 ng TPA/mL的培养基中培养80–90%融合角质形成细胞8小时[18]. 每个治疗组使用四个100 mm培养皿。经过此处理后，细胞被胰蛋白酶化，并通过差速离心（100000×克)一个小时。

2.2. HPLC分馏

细胞溶质部分用1体积的细胞溶质/2体积的溶剂（己烷/乙酸乙酯；1:1）稀释，旋涡，然后离心（3000 rpm）。向每个样品中添加200毫克无水亚硫酸钠，然后在氮气下干燥，并在99%己烷、1%异丙醇和0.1%乙酸中重新悬浮。然后使用这些富含脂质的组分通过高效液相色谱（HPLC）分离化合物。使用Waters系统进行HPLC纯化，该系统由Waters 600E多溶剂输送装置和控制器以及Waters 996光电二极管阵列检测器组成（Waters，Milford，MA，USA）。该系统使用Waters Millenium进行集成和操作³²软件（3.20版）。使用己烷/异丙醇/乙酸溶剂系统在LiChrosphere 5µm Silica-60（4.6×250 mm）色谱柱（Supelco，Belleforte，PA，USA）上进行正相HPLC纯化[989:10:1(v（v）/v（v）/v（v）)]以1 mL/min的速度施用，异丙醇浓度在30分钟内线性梯度增加2.5%/min。在检测PPARβ/δ活性之前，每分钟收集部分，在氮气下干燥，并在100%乙醇中再次悬浮。

2.3. 定量聚合酶链反应（qPCR）

如前所述，从2天大的新生儿中分离出原代小鼠角质形成细胞[21]. 在37°C和7%CO条件下，在低钙（0.05 mM）Eagle最小必需培养基中培养角质形成细胞，其中含有8%螯合胎牛血清₂[21]. 培养角质形成细胞，直至其约80%融合，然后用0.2μM GW0742（阳性对照）、100μM亚油酸、100μM油酸或100μM棕榈油酸处理。处理8小时后，使用TRIZOL并按照制造商推荐的方案（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从细胞中分离总mRNA。mRNA编码血管生成素样4(Angptl4号机组)使用定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析进行定量。使用2.5µg总RNA和MultiScribe逆转录酶试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）生成cDNA。使用Primer Express软件（3.0版，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）为实时PCR设计引物。用于定量mRNA的正向和反向引物的序列和GenBank登录号为Angptl4号机组（NM_020581）正向，5′-TTCTCGCGCACAGAAGTTG-3′，反向，5′-CATCCACACTCTACAGCCAC-3′。mRNA被归一化为编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因(Gapdh公司; BC083149）使用以下引物：正向，5′-GGTGGAGCCAAAAAGGGTCAT-3′，反向，5′-GGTTCACCATCACAAAACAT-3′。qPCR反应在iCycler中使用SYBR绿色PCR主混合液（芬兰埃斯波Finnzymes）进行，并使用MyiQ实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad实验室）进行检测。PCR使用以下条件：95℃15 s，94℃10 s，60℃30 s，72℃30 s并重复45个循环。PCR包括无模板控制反应，以控制污染和/或基因组扩增。所有反应的效率均大于95%。mRNA的相对表达水平标准化为Gapdh公司并使用单向方差分析进行统计显著性分析（Prism 5.0，GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA）。

2.4. ChIP分析

Pparb/d（磅/天）野生型或Pparb/d（磅/天）-用载体（DMSO）、GW0742（0.2μM）、棕榈烯酸（100μM）或油酸（100µM）处理空白的原代角质形成细胞3小时。使用1%甲醛进行交联10分钟，轻轻搅拌，然后将甘氨酸添加到最终浓度125 mM，再轻轻搅拌10分钟。在添加裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8、1%十二烷基硫酸钠、10 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物）之前，用PBS洗涤细胞两次。用Diagenode Bioruptor™（美国新泽西州斯巴达市Diagenodes）剪切DNA，获得500-1500个碱基对片段。蛋白A琼脂糖（美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司）珠在使用前用1μg/μL牛血清白蛋白和0.1μg/微升鲑鱼精子DNA（Invitrogen）溶液封闭1小时。在用兔IgG（圣克鲁斯生物技术）、乙酰化组蛋白H4（美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔Upstate生物技术）或PPARβ/δ的特异性抗体进行免疫沉淀之前，用封闭蛋白A琼脂糖对剪切后的染色质（每个免疫沉淀中2个260 nm量化DNA单位）进行预处理1小时[9]. 3小时后，通过添加封闭蛋白A琼脂糖捕获免疫复合物，并培养过夜。用低盐洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8、2 mM EDTA、0.1%脱氧胆酸钠、1%Triton-X、150 mM NaCl和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）洗涤回收的珠子三次，然后用高盐洗涤缓冲溶液（20 mM-Tris-HCl pH 8、2mM EDTA，0.1%脱氧胆酸钠，1%Triton-X、500 mM NaC1和蛋白酶抑制剂混合物）洗涤一次，一次使用TE8（10 mM Tris-HCl pH值8，1 mM EDTA）。通过添加洗脱缓冲液（100 mM NaHCO）释放免疫复合物_三，1%十二烷基硫酸钠），并在65°C下通过过夜培养逆转交联。通过苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）提取纯化免疫沉淀DNA，并进行实时PCR分析，以确定已知PPARβ/δ靶基因血管生成素样蛋白4的反应元件(Angptl4号机组). 底漆设置Angptl4号机组是基于之前在内含子3编码序列中对PPRE的识别而设计的[22,23]. 用于Angptl4号机组为5′-CTAGCAGAGAGAGAAAGTTCAGAGC-3′（正向）和5′-CAATCCCTCCGGGCAGTAG-3′（反向）。如RNA分析部分所述，进行实时PCR反应。每个PCR反应都包括一个无模板对照来检测污染，并且所有PCR反应的效率都超过85%。将特定值归一化为治疗输入，并验证其大于兔IgG对照。累积量是根据对照处理的标准化褶皱累积量确定的。

2.5. HRAS感染

这个赫拉（Hras）如前所述，逆转录病毒由ψ2产生细胞产生[24]. 病毒滴度测定为1至2×10⁷使用NIH-3T3病灶形成分析的转化单位/mL。如前所述，制备并培养新生小鼠的原代角质形成细胞[21]. 角质形成细胞感染了赫拉（Hras）逆转录病毒持续两天，估计感染多重性（M.O.I）为1-12。随后在对照培养基或含有棕榈油酸、油酸或阳性对照GW0742的培养基中培养细胞。

2.6. 记者分析

使用之前描述的含有小鼠或人类PPARβ/δ配体结合域的质粒，在SV40启动子控制下融合到酵母转录因子Gal4的DNA结合域，在Gal4 DNA响应元件控制下融合至UAS萤火虫荧光素酶报告子，以检测配体活性[25]. 按照制造商建议的程序，使用荧光素酶报告试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）和Turner TD-20/20光度计（美国加利福尼亚州桑尼维尔市Turner BioSystems）测量荧光素素酶活性。荧光素酶活性标准化为每个样品的β-半乳糖苷酶活性。计算相对于载体对照细胞（DMSO）的归一化荧光素酶活性的折叠诱导，并表示每个治疗组三个独立样本的平均值。

2.7. 定量Western Blot分析

如前所述，制备用于Western blot和免疫沉淀的细胞裂解物和样品[9,26]. 如前所述，使用放射性检测方法进行蛋白质印迹分析[9]. 使用的主要抗体如下：酰基辅酶A羧化酶（ACC）；脂肪酸合成酶；脂肪酸去饱和酶1/2（FADS1，FADS2）；超长链脂肪酸长链酶6（ELOVL6）；细胞色素-b5还原酶1（CYB5R1）；和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1），（美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）或抗β-肌动蛋白（美国宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔罗克兰）。抗PPARβ/δ抗体如前所述[9]. 原始数字可以在中找到补充资料.

2.8条。流式细胞术

控制和HRAS表达Scd1号机组野生型或Scd1号机组-空白角质形成细胞在加入或不加入GW0742、油酸或棕榈油酸的情况下培养24小时，并用溴脱氧尿苷（BrdU）和/或碘化丙啶染色，并分析细胞周期进展，如前所述[16,27,28]. 使用FCS Express软件（4.00版）确定细胞周期每个阶段的细胞百分比。

2.9. 角质形成细胞的Coulter计数和BrdU标记

对照和HRAS表达Scd1号机组野生型和Scd1号机组-空白角质形成细胞在加入或不加入GW0742、油酸或棕榈油酸的情况下培养6天，如上所述。使用库尔特计数器测定平均细胞数，如前所述[29]. 五天后，用BrdU标记细胞24小时，并进行免疫组织化学分析，以确定BrdU标签细胞的平均数量，如前所述[29].

2.10. 气相色谱/质谱

Pparb/d（磅/天）野生型角质形成细胞，无论是否感染HRAS，均培养72小时。如前所述，将细胞胰蛋白酶化、均质，并使用GC/MS定量脂肪酸[30].

2.11. 野生型和Scd1-Null小鼠的局部十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）治疗

Scd1号机组野生型和Scd1号机组-这些研究使用了年龄在6-8周、Sv/129基因背景的空白雌性小鼠[20]. 将小鼠剃毛以去除背部毛发，24小时后，将溶于200µL丙酮中的25µg TPA（美国密苏里州圣路易斯Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA）或200µL丙酮施加于剃毛部位。TPA应用48小时后，对小鼠实施安乐死，取出皮肤并在液氮中冷冻。取下一段皮肤，放入10%磷酸缓冲福尔马林中进行免疫组织化学，以评估PCNA、角蛋白5或细胞核的相对免疫反应性，如前所述。皮肤样本用磷酸盐缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中，并以5μm厚切片。使用标准方法进行苏木精和伊红染色。如前所述进行免疫荧光染色[29]. 使用了以下主要抗体：抗角蛋白5或抗PCNA。幻灯片保存在黑暗的容器中。样品清洗三次，并在室温下与二级抗体孵育。使用了以下二级抗体：抗兔、抗鼠和与AlexaFluor488或AlexaFluxor647偶联的抗鼠。染色玻片安装在含有DAPI的安装试剂中，用于细胞核染色。使用ImageJ（版本1.46）手动对阳性/阴性细胞进行定量。

2.12. Pparb/d-Null与SKH小鼠杂交的紫外线诱导皮肤癌

雌性SKH1小鼠(Pparβ/δ^+/+或Pparβ/δ^−/−)UVB照射（180 mJ/cm²)每周3次，持续25周。UVB照射的量和频率以及本研究的时间框架是根据先前发表的UVB诱导肿瘤研究中使用的方法设计的[28]. 本研究使用了产生UVB和UVC范围波长的紫外线发射灯。通过使用反射高于UVB波长的滤光片，可以特别防止UVC光照射到老鼠身上。在每次UVB照射之前，通过使用UVB专用辐射计测量的发射UVB光的强度来计算照射时间。照射后立即在背部局部涂抹200µL载体对照物（丙酮）、高度特异性PPARβ/δ配体（1.0µM GW0742）或25µM油酸。GW0742和油酸浓度的基本原理是基于先前的研究，研究表明，这些浓度在能够激活PPARβ/δ的范围内[31,32]. 对照或配体溶液于第1周开始背部局部应用。每周测量并记录一次病变的发生率、多样性和体积。每只小鼠的损伤发生率定义为出现第一个可测量损伤的周。每只小鼠的病变多重性定义为每周发现的病变总数。在第25周最后一次照射后6小时内，通过过度暴露于二氧化碳和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。每个治疗组的样本量在7-11只小鼠之间。使用ANOVA和Bonferroni事后检验（Prism 10.0，GraphPad Software，San Diego，CA，USA）对数据进行统计显著性分析。当第页≤ 0.05.

3.结果

3.1. TPA治疗后角质形成细胞胞浆中PPARβ/δ活性增加

先前的研究表明，TPA治疗后角质形成细胞产生内源性PPARβ/δ配体[18]. 由于TPA激活磷脂酶，导致角质形成细胞释放脂肪酸[33]检测了从对照小鼠原代角质形成细胞或经TPA急性处理的小鼠角质形成淋巴细胞中获得的细胞液有机部分。与过去的研究一致[18]与对照组相比，一部分有机角质形成细胞胞浆导致PPARβ/δ报告活性增加(图1A） 。由于TPA激活磷脂酶，导致角质形成细胞释放脂肪酸，包括亚油酸和油酸[33]角质形成细胞在亚油酸、油酸或棕榈油酸中培养，PPARβ/δ靶基因血管生成素样蛋白-4的表达(角度4)，已测量。的表达式Angptl4号机组与对照组相比，野生型原代角质形成细胞对合成配体GW0742以及亚油酸、油酸和棕榈油酸的反应中mRNA增加(图1B） ●●●●。这种影响在Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图1B） ●●●●。此外，ChIP分析表明，棕榈油酸增加了PPARβ/δ在Angplt4号机组PPRE，在类似治疗中未观察到这种效果Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图1C） ●●●●。

3.2. HRAS激活PPARβ/δ

TPA激活PKCα和其他蛋白质，包括HRAS[34,35]. 因此，研究了HRAS对角质形成细胞信号传导的影响。有趣的是，表达HRAS的野生型角质形成细胞的Angptl4号机组mRNA与对照组相比，这种影响在Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图2A、 B）。有趣的是Angptl4号机组mRNA在Pparb/天-与野生型角质形成细胞相比，无角蛋白细胞(图2A） 与过去的研究一致，研究表明该基因的基础表达由PPARβ/δ组成性负调控[36]. PPARβ/δ的表达不受HRAS或GW0742的影响(图2B） ●●●●。然而，HRAS的表达导致小鼠和人类同种型PPARβ/δ报告基因活性的增加，与阳性对照GW0742的情况相当(图2C） ●●●●。

3.3. 生物信息学分析揭示PPARβ/δ在脂质代谢中的作用

利用先前发布的微阵列数据进行生物信息学分析Pparb/d（磅/天）野生型或Pparb/d（磅/天）-无角朊细胞和HRAS表达Pparb/d（磅/天）野生型或Pparb/d（磅/天）-无角朊细胞，有或没有PPARβ/δ与GW0742的配体激活（GEO登录号GSE32498[6,16]). 特别令人感兴趣的是由PPARβ/δ配体GW0742和HRAS在野生型和Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图3A） 。12个基因的表达有重叠(Acsl3公司,最小二乘法,Tmtc2号机组,Bnip3号机组,同步器1,Angptl4号机组,化石1,Gm5246公司,见解1,Fgfbp1型,普格德邦，以及Acsbg1公司)发生的(图3B） ，但与表达HRAS的角质形成细胞相比，表达HRAS野生型角质化细胞中这些基因的表达通常更高Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图3C） ●●●●。6个基因被PPARβ/δ特异性调节(图3B、，Scd1号机组,Gdpd1号机组,错误2,Vwa8型,1991年8月18日，以及斯纳尔). 由于SCD1是单不饱和脂肪酸合成的速率限制因子，因此qPCR分析对照或表达HRAS的野生型或Pparb/天-没有角质形成细胞的人被用来检测其他调节脂肪生成的酶(图4A） 。的表达式传真1,传真2,传真3,5r1周期，以及Scd1号机组与对照组相比，HRAS增加了野生型角质形成细胞中的mRNA，并且在HRAS表达的野生型角质细胞中，PPARβ/δ与GW0742的配体激活反映了这种作用(图4A） 。这种影响在Pparb/d（磅/天）-无HRAS表达的角质形成细胞和对GW0742的反应(图3C和图4A） 。基于qPCR分析Acc公司,Cyb5r2（循环5r2）,埃洛夫l6,Fasn公司，以及Scd2号机组与对照组相比，HRAS或GW0742对mRNA的反应没有差异。为了确定qPCR分析检测到的差异mRNA表达是否与蛋白质相似，进行了Western blot分析(图4B） ●●●●。GW0742对PPARβ/δ的配体激活不会影响野生型角质形成细胞中除CYB5R1外的任何蛋白质的表达，与对照组相比，CYB5 R1的表达相对较高(图4B） ●●●●。与mRNA分析一致，在表达HRAS的野生型角质形成细胞中，FADS1、FADS2、ELOLV6、CYB5R1和SCD1蛋白的相对表达较高，而在表达HRAS-的野生型角朊细胞中，这种影响没有被发现Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图4B） ●●●●。这些数据表明，对PPARβ/δ信号的HRAS依赖性调节可能影响单不饱和脂肪酸的合成，这些脂肪酸可能作为该受体的配体(图4C） ●●●●。

3.4. HRAS增加原代角质形成细胞中的油酸和棕榈油酸水平并激活PPARβ/δ

为了确定在表达HRAS的角质形成细胞中发现的成脂蛋白表达的变化是否影响脂质的合成，进行了GC-MS分析。与对照组相比，角质形成细胞中HRAS的表达导致棕榈油酸、油酸、弹性酸和亚油酸的数量增加(图5A） 。ChIP分析表明，油酸增加了PPARβ/δ在Angplt4号机组野生型角质形成细胞中的PPRE与合成PPARβ/δ配体GW0742观察到的PPRE相似，但在Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞(图5B） ●●●●。因为SCD1是一种对合成单不饱和脂肪酸（尤其是油酸和棕榈油酸）进行催化的速率限制酶[37])这些观察结果共同表明，HRAS激活导致合成脂肪酸，激活角质形成细胞中的PPARβ/δ。由于PPARβ/δ的配体激活导致通过诱导有丝分裂阻滞来负选择表达高水平HRAS癌基因的细胞[16]，检测细胞周期进展。与先前的研究一致，表达HRAS的角质形成细胞中PPARβ/δ的配体激活导致细胞周期G2/M期的有丝分裂阻滞，与对照组相比，油酸或棕榈油酸也能产生这种效应(图6). 重要的是，在类似处理的HRAS表达中没有发现这种作用Pparb/d（磅/天）-无效角质形成细胞(图6).

3.5. 油酸和棕榈油酸抑制角质细胞增生

HRAS表达Scd1号机组-与野生型对照组相比，空白角质形成细胞的增殖增强(图7)，其表型与Pparb/d（磅/天）-无角质形成细胞[16]. 有趣的是，GW0742、油酸和棕榈油酸都在Scd1号机组-与对照组相比，角质形成细胞为零(图7). 类似地，TPA局部治疗导致野生型小鼠的表皮增生，并且这种影响在Scd1号机组-与对照组相比，无小鼠(图8). 与体外原代角质形成细胞的观察结果类似，TPA治疗的这种表型Scd1号机组-空白小鼠皮肤非常相似(图8)与TPA治疗中观察到的结果相比Pparb/d（磅/天）-与对照组相比，无表皮增生增强的小鼠皮肤[19]. 更重要的是，GW0742、棕榈油酸和油酸抑制了TPA诱导的Scd1号机组-无鼠标(图8). 总的来说，这些结果表明，补充外源性单不饱和脂肪酸可以挽救Scd1号机组-null小鼠，可能通过PPARβ/δ的配体激活。

3.6. 油酸和合成配体对UVB诱导的皮肤癌的PPARβ/δ依赖性抑制作用

PPARβ/δ与GW0742的配体活化对化学诱导的皮肤癌具有化学预防作用[13,14,15]. 这种作用需要PPARβ/δ，因为仅在配体处理的野生型小鼠中观察到对恶性转化的抑制，而在配体治疗的野生型鼠中没有观察到Pparb/d（磅/天）-无鼠标[13,14,15]. 在SKH-1小鼠中检测PPARβ/δ配体活化对UVB诱导的皮肤肿瘤的肿瘤发生率、肿瘤多样性和肿瘤体积的化学预防作用Pparb/d（磅/天）-野生型或Pparb/天-使鼠标无效。SKH1 X中UVB诱导的肿瘤形成延迟Pparb/d（磅/天）^+/+与对照组相比，小鼠局部施用油酸或GW0742，且在GW0742处理的或SKH1 X中未观察到这种效果Pparb/天^−/−老鼠(图9A） 。SKH1 X中UVB诱导肿瘤形成的发生率略有延迟Pparb/d（磅/天）^−/−与对照组相比，通过局部施用油酸的小鼠，但在GW0742处理或对照SKH1 X中未观察到这种效果Pparb/d（磅/天）^−/−老鼠(图9A） 。GW0742或油酸对PPARβ/δ的配体激活抑制SKH1 X的肿瘤多重性Pparb/d（磅/天）^+/+第17周至第25周的小鼠，在类似治疗或SKH1 X中未观察到这种效果Pparb/d（磅/天）^−/−老鼠(图9B） ●●●●。在过去5周的治疗中，SKH1 X组的肿瘤多样性较高Pparb/d（磅/天）^−/−小鼠与SKH1 X相比Pparb/d（磅/天）^+/+老鼠(图9B） ●●●●。平均肿瘤体积不受PPARβ/δ与GW0742或SKH1 X中油酸的配体激活的影响Pparb/d（磅/天）^+/+老鼠(图9C） ●●●●。在SKH1 X中，从第23周到第25周的平均肿瘤体积更大Pparb/d（磅/天）^−/−小鼠与对照SKH1 X的比较Pparb/d（磅/天）^+/+老鼠(图9C） ●●●●。有趣的是，SKH1 X的平均肿瘤体积从第23周到第25周更低Pparb/d（磅/天）^−/−与对照组SKH1 X相比，小鼠对GW0742或油酸治疗的反应Pparb/d（磅/天）^−/−老鼠(图9C） ●●●●。

4.讨论

这些研究的前提是基于Wahli研究小组2001年的开创性工作，该研究表明角质形成细胞是PPARβ/δ配体的来源[18]. 本研究的结果扩展了最初的观察结果，表明HRAS可增加角质形成细胞中的油酸和棕榈油酸，从而调节这些细胞中的PPARβ/δ活性。这与TPA导致角质形成细胞中脂肪酸释放的观察结果一致[33]. 先前的研究表明，角质形成细胞中存在内源性配体并动态调节基因表达，这一点得到了强有力的支持Pparb/d（磅/天）角质形成细胞中导致数百个PPARβ/δ靶基因组成表达的改变[6]. 此外，在缺乏外源性配体的情况下，增加PPARβ/δ的基础表达可以抑制人类皮肤、神经母细胞瘤、乳腺癌、黑色素瘤和睾丸癌细胞系移植到小鼠体内的肿瘤的大小和生长[12,38]). PPARβ/δ在上皮细胞中的组成性、核定位也相对较高，PPARβ／δ与其异二聚体伙伴RXR共同免疫沉淀[9]. 这些观察结果有力地支持了PPARβ/δ具有组成活性的假设，并且在正常的基础角质形成细胞生理学中具有关键作用，包括诱导终末分化[39,40,41]. 对于上皮细胞，如肠或皮肤中的上皮细胞，PPARβ/δ的基础表达与小鼠和人类的其他组织相比相对较高，尤其如此[9,10].

SCD1是一种对包括油酸和棕榈油酸在内的单不饱和脂肪酸的合成进行催化的速率限制酶[37]. 本研究的结果表明，角质形成细胞中的高HRAS活性导致SCD1的更高表达和活性，这种作用需要PPARβ/δ。这与通过增加HRAS活性在角质形成细胞中发现的较高水平的棕榈油酸和油酸一致。由于PPARβ/δ的配体激活导致在细胞周期的G2/M期诱导有丝分裂阻滞，从而导致表达高水平HRAS的细胞被负选择[16]需要注意的是，油酸、棕榈油酸和GW0742阻止了TPA诱导的细胞周期G2/M期剩余细胞百分比的增加第1页-角质形成细胞缺失。同样，TPA诱导的表皮增生反应在Scd1号机组-空小鼠，这是一种与TPA治疗中发现的表型非常相似的表型Pparb/d（磅/天）-无鼠标[15,19,40,42]. 重要的是，棕榈油酸、油酸和GW0742均能逆转TPA诱导的细胞增生Scd1号机组-无表皮。这些观察结果共同支持了以下假设：HRAS表达细胞合成PPARβ/δ配体以抑制突变细胞的细胞增殖，这可能是诱导终末分化的结果。未来的研究应考虑对SCD1抑制剂的检查，以及其他单不饱和脂肪酸的影响，以补充和扩展目前的研究。

年的观察结果Scd1号机组-空白小鼠皮肤支持先前的研究，证明PPARβ/δ与合成配体的配体激活抑制化学诱导的皮肤癌发生[13,14,15]. 有趣的是，SCD1的高表达与癌细胞的生长和进展呈负相关[43]SCD1产生的单不饱和脂肪酸水平的改变可以抑制或促进癌细胞存活[43]. 相反，紫外线照射会抑制SCD1的表达，降低人体皮肤中的脂肪酸水平[44]. 这与目前的结果一致，即油酸和棕榈油酸可以抑制紫外线诱导的非黑色素瘤皮肤癌。鉴于非黑色素瘤皮肤癌的发病率不断增加[45]，进一步的研究应该检查这些脂质的饮食管理是否可以预防这种疾病。还需要进一步研究，以阐明SCD1依赖性调节如何影响其他癌症中的PPARβ/δ功能（反之亦然）。这些观察结果也与几个两阶段化学致癌研究一致，这些研究表明PPARβ/δ的配体激活抑制了局部施用二甲基苯并蒽（DMBA）和TPA引起的皮肤致癌作用[13,14,15]. 由于DMBA/TPA模型中肿瘤的恶性转化需要人力资源管理系统，目前的研究表明，在两阶段化学致癌生物测定过程中PPARβ/δ配体的产生可能有助于先前研究中观察到的抑制作用[13,14,15]. 这种机制是否反映了一个负反馈回路，以防止突变角质形成细胞的增殖，还需要进一步评估。由于UVB诱导的皮肤癌依赖于TP53基因的突变，因此TP53突变细胞对PPARβ/δ配体激活作用的敏感性有待进一步研究。另一项研究发现，SKH1 X可以减轻紫外线诱导的皮肤致癌作用Pparb/d（磅/天）-与SKH1 X相比为空Pparb/d（磅/天）野生型小鼠，这种效应通过调节SRC表达进行调节[46]. 由于几个原因，目前的研究结果无法与以前的研究进行比较。首先，用于后一项研究的紫外线光源同时使用UVB和UVA[46]，而本研究仅使用UVB，并通过使用过滤器消除了UVA/UVC的影响。这一点值得注意，因为UVB被认为是导致环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶（6-4）光产物的最主要太阳辐射源[47,48,49]更常用于皮肤致癌生物检测。其次Pparb/天-用于这两项研究的空白小鼠使用不同的方法沉默PPARβ/δ表达。这两个转基因株系中的一个或多个离靶事件可能是这种差异的基础。最后，细菌、病毒和真菌的重要共生作用正在被揭示，这可能会影响许多接触途径。因此，这两项研究也可能导致皮肤微生物组影响的差异。需要进一步工作来澄清这些问题。