益生菌的功效短乳杆菌对抗牙釉质表面脱矿过程的体外研究结果

摘要

背景。牙釉质在保护人类牙齿底层方面起着至关重要的作用；因此，保存它至关重要。本实验研究旨在评估短乳杆菌在体外抵消脱钙剂对牙釉质形态和矿物成分的作用。方法。样本包括12颗健康的人类后牙。每颗牙齿的冠状部分在纵向上被细分为两个相等的部分。标本被随机分为四组：人工唾液、，短乳杆菌悬浮液、脱盐剂（DA）和DA plus短乳杆菌采用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分别评估表面微观形貌和矿物含量。使用单向方差分析进行统计分析，然后进行Tukey的事后检验。结果。SEM分析没有突出显示牙釉质微观结构的显著变化短乳杆菌-处理后的样本与对照组进行比较。当标本与益生菌接触时，DA对牙釉质结构的损伤大大减少。DA处理显著降低了关键釉质矿物质（即钙和磷）的重量%。值得注意的是，益生菌能够逆转脱矿过程，使钙和磷重量%恢复到基本水平，包括钙磷比。结论。调查结果表明短乳杆菌能够有效保护牙釉质表面免受DA的损伤，提高牙釉质的抗脱矿能力。总的来说，短乳杆菌通过一种新的机制，在模拟龋齿过程的化学挑战下保护牙齿表面，证实其在预防或抵消龋齿损伤作用方面的功效。

1.简介

龋病是一种常见的、复杂的慢性疾病，由口腔微生物群的生态失衡引起，主要依赖于形成致病性生物膜[1,2]. 此外，口腔致龋病原体导致牙釉质羟基磷灰石晶体脱矿和牙齿硬组织结构的蛋白水解破坏[三]. 牙釉质具有特殊的品质，可以保护牙齿内层免受热量、机械应力、变色、细菌和其他微生物的侵入，并保护牙本质底层免受外界伤害[4,5].

研究表明，一些益生菌抑制致龋菌群的生长，释放抗菌化合物，在营养方面超过口腔病原体，并减少生物膜的生成[6,7]. 根据一个定义，益生菌是“活微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处”。由于其作用方式包括粘附、聚集和竞争性抑制，以及增强粘膜屏障和影响免疫系统产生抗炎作用的能力，它们在预防和治疗各种疾病方面都是有效的[8,9,10,11,12,13,14,15].

服用一些益生菌可能是保持牙齿健康的一个好方法，可以作为口腔疾病的替代或补充治疗[16]. 益生菌，尤其是乳酸菌，已被证明能够平衡口腔中的微生物群，改变免疫和炎症反应，分泌抗菌化合物，竞争口腔病原体的营养成分，增强粘膜屏障，减少病原体生物膜的形成，以及预防或减轻牙周病[6,17,18].

短乳杆菌CD2，最近重新分类为短乳酸杆菌[19]是一种多功能益生菌，主要用于口服药物，已在包括龋齿在内的各种条件下进行了评估[20,21]牙龈炎和牙周炎[22,23,24,25,26]，口腔粘膜炎[27,28]白塞病和口腔溃疡[29,30]. 除对抗病原菌外，短乳杆菌研究表明，通过下调诱导型一氧化氮合酶2（NOS2）通路，从而抑制NO的生成，从而影响宿主的炎症反应[21,22]，一种有效的炎症介质。术后对口腔最有益的影响短乳杆菌无论是在健康还是疾病状态下，这一假设都被归因于精氨酸脱氨酶（ADI）的高水平[21,22,31]这是它最令人兴奋的特性之一。人体细胞中缺乏的ADI是一种酶，可以转化口腔中的精氨酸，从而形成瓜氨酸和氨（NH_三). 在水溶液中，NH_三形成铵离子（NH₄⁺)对维持生理唾液pH值，从而防止牙釉质脱钙至关重要[32,33]. 的确，唾液NH水平_三发现与龋齿活跃的受试者相比，无龋齿健康受试者的龋齿表达上调[33,34,35]. 这些差异可能归因于细菌ADI水平较高。考虑到NH_三是一种质子受体（即弱路易斯碱），较高的pH值和酸中和条件为致龋微生物的生长和优势创造了不利的环境。因此短乳杆菌在考虑口服时，这可能是这种益生菌的一大优势。这些特点使短乳杆菌控制口腔疾病发展和进展的候选人。ADI通过代谢具有较高化学亲和力的精氨酸，阻止精氨酸酶和NOS2使用后者，从而分别抑制与口臭、肿瘤细胞增殖和NO有关的多胺（即腐胺和亚精胺）的合成，也是与牙周炎症相关的最有效的炎症介质之一[22,31].

然而，尽管有大量和越来越多的文献支持短乳杆菌在口腔医学中，目前需要足够有效的证据来证明这种益生菌对牙釉质脱矿的影响。因此，本研究旨在体外验证短乳杆菌可以抵消脱盐剂对釉质表面造成的损害。使用扫描电子显微镜（SEM）来评估表面釉质的形态。采用能量色散X射线光谱仪（EDS）检测短乳杆菌牙釉质脱矿悬浮液和牙齿表面的元素组成，特别注意钙和磷组成的改变。结合这些分析技术，可以全面了解牙齿表面的形态和化学变化。

2.材料和方法

2.1、。牙齿采集、选择和试样制备

根据拉奎拉大学内部审查委员会批准的方案，在拉奎拉大学牙科诊所获得捐赠者的知情同意后，从年龄在20至40岁之间的受试者身上采集了16颗用于正畸目的的人类牙齿。48/2022，2022年11月22日。经过仔细的临床评估和诊断，牙科临床医生计划并对7名健康患者进行选择性拔牙（前磨牙和臼齿），这些患者由于严重的牙齿过度拥挤（牙弓缺乏空间）、前牙突出和咬合矫正，不得不接受正畸治疗。患有龋齿、裂纹或缺陷的牙齿被排除在外。被拔除的16颗牙齿中有12颗完全健康，没有龋齿、裂纹和类似的结构缺陷，最终被保留用于研究。使用0.5%氯胺对牙齿进行消毒，保存在蒸馏水中，并使用Gracey刮匙（LM Dental，Parainen，Finland）和机器驱动的超声波定标器（LM Dontal，Parainen，Finland）进行刮治，以去除附着在牙齿上的所有组织标签。治疗前，将选定的牙齿储存在4°C的盐水中，加入0.1%的百里酚溶液（pH 7.0），以防止细菌生长，直至使用。随后，使用低速微电机和金刚石圆盘钻在牙骨质-牙釉质结合处近碘化方向切割所有牙齿，以将牙冠与牙根部分分开。然后将每个冠表面细分为两个部分。将24个样本随机分配给每个治疗组（每组6个）：对照组、益生菌组、脱盐剂组（DA）和DA加益生菌。

2.2. 人工唾液的制备

人工唾液溶液在试验前新鲜制备，含有氯化钠（NaCl）[0.4 g/L]、氯化钾（KCl）[0.4 g/mL]、二磷酸钠（NaH₂人事军官₄·2小时₂O） [0.69 g/L]，二水氯化钙（CaCl₂·2小时₂O） [0.9 g/L]，九水合硫化钠（Na₂S·9H系列₂O） [0.005 g/L]和尿素[1 g/L]。为了模拟唾液中葡萄糖的基本浓度，人工唾液中添加了葡萄糖[0.01 g/L]。人工唾液溶液成分来自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。使用数字pH计（Mettler Toledo，Columbus，OH，USA）检查溶液的pH，并通过添加1N氢氧化钠（NaOH）将其调节至7.0的中性pH。

2.3. 短乳杆菌悬液的制备

益生菌悬浮液是通过首先溶解一片Mucomix锭剂（Mendes Srl，Ardea，意大利）制备的；一锭含10⁹的CFU短乳酸杆菌DSM27961/CNCM I-5566，置于10 mL磷酸盐缓冲盐水中（PBS，EuroClone，West York，UK）。悬浮液在8600×克，在PBS中洗涤两次，并在4 mL人工唾液中重新悬浮。短乳杆菌制备悬浮液用于体外益生菌治疗，最终获得16.6×10⁶CFU/mL浓度。

2.4. 除盐溶液的制备

超纯H中6%的柠檬酸（美国密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich）₂O（pH 2.2）用作脱盐溶液。

2.5. 体外治疗

通过应用模拟口腔环境的pH循环模型对所有标本的牙釉质表面进行研究。

将所有24个样本小心放置在无菌12孔聚苯乙烯细胞培养板（美国纽约州纽约市科宁公司）中，浸入4 mL相应溶液中，并在37°C下连续搅拌的热混合器（德国汉堡埃彭多夫）中培养5天，确保实验的最佳条件。

将24个切片严格随机分配给每个治疗组（每组6个），如下所示：

• 第1组：将标本浸泡在4mL人工唾液中，每天用新鲜人工唾液替换。该方案每天重复五天。
• 第2组：用16.6×10的益生菌溶液处理标本⁶CFU/mL持续6小时/天，然后将其广泛清洗，并在新鲜人工唾液中再培养18小时。每天重复该方案，持续五天。
• 第3组：将标本浸泡在DA（6%柠檬酸）中2分钟，然后将其广泛清洗并在新鲜人工唾液中培养24小时。每天重复该方案，持续五天。
• 第4组：标本在DA（6%柠檬酸）中浸泡2分钟，然后在益生菌悬浮液（16.6×10⁶CFU/mL）培养6小时，然后将其广泛清洗，并在人工唾液中再培养18小时。每天重复该方案五天。

随后，通过使用pH计（美国俄亥俄州哥伦布市梅特勒-托莱多）在基线、3、6、12和24小时从各孔吸取溶液，记录所有条件下的pH值。对所有基线和pH循环后的状态测量进行了平均描述，与基线值相比没有显著变化（pH值范围：6.95–7.03）。在最终暴露于处理后，用蒸馏水清洗所有样本四次（每次5分钟），然后在乙醇溶液（30-50-70-90%）中脱水，并在100%乙醇中脱水两次，每次10分钟。

2.6. 扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）

SEM观察由蔡司FEG SEM Gemini SEM 500（拉奎拉大学显微镜中心）进行。在环境条件和可变压力（23帕斯卡）下，在10 kV和8.5 mm工作距离下操作SEM，未对试样进行金属化，以避免出现伪影和裂纹。随机获得釉质表面的扫描电镜照片，放大倍数为500×、2000×、5000×和10000×。对获得的显微照片进行描述性评估，观察所有不同分析组的牙釉质微观形态的变化。

样品的定性元素分析是通过EDS进行的，使用配备微量分析牛津EDS（Oxford Aztec Live with Detector Ultim Max 100）的SEM进行。操作参数为8.5mm工作距离、10kV加速电压、500倍放大率。分析了釉质化学元素的重量浓度（%）。特别是，我们关注的是钙和磷含量及其比值（Ca/P），以评估不同处理后矿物密度的变化。

2.7. 统计分析

使用GraphPad Prism版本8.02（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）对数据进行评估。为了比较各组的平均值，我们使用了单向方差分析（ANOVA），然后进行了Tukey的事后检验。数据表示为平均值±标准偏差第页当数值低于0.05时，被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1. 短乳杆菌对牙釉质表面形态的影响

使用SEM分析研究并比较每个处理过的样品和对照样品的表面形貌。不同处理条件后，牙釉质表面500倍放大的典型SEM显微照片如所示图1。对照样品显示出正常釉质的典型外观，表面相对光滑平坦，存在抛光划痕。经处理的试样表面短乳杆菌牙釉质无损伤迹象，无棱镜暴露或棱镜间隙，表明生理结构得以保存。不出所料，在所有接触DA的标本中都观察到不规则的表面图案，有明显的釉质完整性丧失、棱镜溶解、牙釉质棒外露和棱镜间棒结构紊乱的迹象，以及明显的形态缺陷，区域显示出凹坑、气孔、，和微腐蚀，即使放大500倍也很明显。值得注意的是，暴露于DA中并用短乳杆菌牙釉质表面的侵蚀和变形明显减少，棱镜曝光强烈减弱，棱镜间隙明显减小，如图1.

图2显示了暴露于DA或DA和益生菌组合的样本在2000倍和5000倍放大倍数下的代表性SEM图像短乳杆菌在这些较高的放大倍数下，暴露在DA表面的标本上，牙釉质棒和典型的鱼鳞状结构的明显缺失更为明显，如图2在这些更高的放大倍数下，对抗DA侵蚀作用的益生菌效果似乎更加明显。因此，经DA与益生菌联合处理的标本证实，釉质表面有明显改善，在某些生长方向上形成杆状微晶。与软化试样相比，棱柱芯的溶解较少，表面上有更多衰减的微侵蚀，孔和侵蚀区域的数量显著减少。

3.2. 短乳杆菌对牙釉质元素组成的影响

使用EDS测量四组中每个试样釉质表面的矿物含量（重量百分比），EDS是一种显微分析技术，广泛用于结合SEM评估结构和形态变化，并定量估计元素组成的数量。图3显示了四个治疗组（对照组、DA组、，短乳杆菌、和DA+短乳杆菌所有SEM显微照片（放大500倍）证实了上述观察结果。因此，对照组或经益生菌处理的样本显示出正常且规则光滑的釉质表面(图3，左侧图像）。另一方面，在五次柠檬酸暴露（DA处理）后，SEM显微照片证实了具有棱镜间孔的脱矿釉质的典型图像。此外，成像显示，用DA plus处理的标本的釉质超微结构有明显改善短乳杆菌与单用DA相比，牙釉质表面更光滑，气孔数量和大小减少。釉质表面无机化合物的检测结果显示在图3EDS光谱和相应值（重量%，σ）记录在表中。治疗时使用短乳杆菌与对照组相比，似乎没有显著影响釉质的元素组成，如图3脱矿处理对Ca、P、C和O的表面积百分比有显著影响。特别是，结果表明，与对照试样相比，脱矿过程后钙和磷的重量百分比明显下降。值得注意的是，经DA plus处理的样品的表面矿物成分（Ca、O、P和C）短乳杆菌显示出与对照或益生菌处理样品的元素组成相当的成分，从而证实了短乳杆菌防止柠檬酸的侵蚀和脱矿作用。

图4报告了不同处理组（对照组，短乳杆菌、DA和DA+短乳杆菌）钙磷比也显示在底部直方图中。很明显，添加短乳杆菌将用除盐器处理的样品中Ca（重量%）和Ca/P比率的显著降低的平均值恢复到与对照或单独益生菌的水平没有显著差异的水平。与单独使用DA的样本相比，接触DA+益生菌的样本中的P水平也显示出增加的趋势，尽管它们没有达到统计显著性。

4.讨论

牙釉质是人体内最耐用的组织，由矿物相和有机成分组成[36,37]. 矿物相是主要成分，占总重量的95-96%，主要由块状六角羟基磷灰石晶体形状的磷酸钙盐组成。其他成分包括碳酸钙、氟化钙、磷酸镁和其他微量盐类[37]. 牙釉质的主要功能是保护其下方的牙本质层，牙本质层负责包裹牙髓，牙髓是一种高度血管化和神经支配的软组织。由于这些特点，牙釉质可以保护牙齿内部免受热量、机械损伤、变色以及细菌和其他微生物进入牙齿。由于其高矿物质浓度，牙釉质对脱矿很敏感，而脱矿是最终导致龋齿的过程。最初的牙釉质损伤可能发展得非常快，口腔环境中的脱矿和再矿化循环处于平衡状态。如果不采取预防措施阻止牙釉质表面损伤的发展，可能会形成牙齿空洞。因此，主要目的是以有利于牙齿再矿化的方式调节口腔中的矿物质平衡。

越来越多的体外和体内数据支持益生菌的使用短乳杆菌作为口腔医学中合适的治疗辅助或替代方法。短乳杆菌是一种专性异发酵乳酸菌（LAB），具有多种复合口腔益生菌特性，为其临床应用奠定了基础（抑制或排除口腔病原体、抑制或破坏病原体生物膜、口腔持久性和抗炎作用）[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30]. 然而，据我们所知，没有具体证据表明短乳杆菌防止或抵消牙釉质脱矿的能力。本体外研究旨在研究短乳杆菌在pH循环模型中，增加牙釉质对酸侵蚀的抵抗力，从而抵消脱矿作用。如上所述，脱矿和再矿化会影响表面的机械性能，包括硬度，而硬度与矿物含量直接相关。正如在这方面越来越多的科学研究所证明的那样，扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）被认为是评估脱矿和体外再矿化过程中表面结构变化的有效方法[38,39,40,41,42,43,44,45,46,47]. 因此，SEM-EDS用于评估釉质表面的结构和形态变化，并定量估计每个治疗组釉质重量百分比中的矿物质含量。结果表明，益生菌短乳杆菌有可能抵消柠檬酸对釉质表面的脱矿作用，从而提高釉质的形态和矿物质含量。事实上，DA暴露后用益生菌混悬液治疗显著降低了釉质棱柱体和棱柱间间隙的溶解，从而改善了柠檬酸损坏的釉质表面。这与单独暴露于DA的标本进行了比较。EDS对釉质表面矿物成分的研究提供了证据，证实了扫描电子显微镜（SEM）的结果。与钙和磷有关的数据，它们之间的联系是再矿化过程的关键指示[48]，特别有趣。众所周知，脱矿过程导致牙釉质表面钙和磷离子的溶解和释放。这导致牙釉质的传统超微结构和元素组成丧失[48,49]. 在我们的体外实验中，柠檬酸的暴露也导致了表面钙羟基磷灰石的分解。这导致牙釉质棒的出现，并增加了来自牙齿表面的反向散射光的强度。与对照组相比短乳杆菌-处理后的样本显示矿化釉质表面状况良好，其特征没有任何变化，脱钙组的钙和磷含量显著下降。这导致牙釉质超微结构受损，因为棱镜间空隙增加，个别微晶通过溶解而转化。然而，试样暴露于DA中，然后用短乳杆菌与单独进行DA的那些相比，显示出钙与磷的比率的显著改善。

当前实验研究的局限性之一是，尽管我们努力模拟口腔环境，但本研究并未考虑一些关键参数，如自然唾液成分和口腔微生物群。事实上，用于人工诱导牙釉质损伤（即pH循环）的模型并不是微生物生物膜代谢作用的结果，因此排除了后者在龋齿过程中的关键因素牙齿表面的致龋作用。pH循环模型中发生的交替脱矿和再矿化循环，模拟了龋病形成过程中矿物质损失和增加的动力学，被科学家接受并广泛使用，作为动物龋病测试的适当替代方法[50].

首先，我们的结果表明短乳杆菌暴露对正常牙釉质表面的形态和元素组成没有影响。虽然选定的实验室在治疗包括龋齿在内的口腔疾病方面的作用已经得到了很好的确定，但它们的产酸性和尿酸性已经引起了一些困惑和怀疑，即它们可能会导致牙齿脱矿并增加龋齿的风险[51,52]. 然而，我们的发现表明短乳杆菌与其他实验室相比，作为弱酸生产商，可能不会对口腔健康造成重大风险，主要是在蛀牙方面[53]. 这为研究实验室的产酸和尿酸性质及其潜在效益和风险提供了新的视角。另一方面短乳杆菌预防或修复pH循环模型中脱盐剂造成的损伤，不能归因于益生菌及其抗菌产品对抗致龋微生物和生物膜形成的公认能力[20,21,54,55,56]. 类似地，通过短乳杆菌通过ADI活性，可以积极影响体内牙齿再矿化和脱矿之间的平衡，从而有助于防止致龋微生物群的出现，但不能参与本工作中使用的实验模型。因此，所观察到的效应的潜在机制，尤其是牙齿羟基磷灰石的再矿化作用、缓冲能力、牙釉质中离子的交换，以及是否存在促进再矿化过程的离子（钙和磷酸盐）（氢离子）[57]，需要进一步调查。此外，即使我们的体外研究可能无法完全转化为体内条件和实际消费效果，对于其他口腔条件，也有证据表明所用益生菌产品的功效[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30]. 在这方面，我们特别强调了随机、安慰剂对照临床试验的结果，这些试验报告了短乳杆菌在高龋齿风险或1型糖尿病儿童的某些口腔健康参数上，含锭剂与安慰剂的比较表明，与相对安慰剂相比，益生菌组的检查风险因素有显著改善[20,21].

最后，本研究可能受到所用牙釉质样本类型的限制，这可能会影响结果在更广泛的牙科条件（即受试者的年龄）中的通用性。至少对于牙齿研究对象的年龄范围（20-40岁）而言，该产品是有效的。应对牙釉质矿化度降低或口腔健康状况受损的老年人群的牙釉质进行疗效评估。

总的来说，在体外研究的局限性下，研究结果似乎令人鼓舞，而且最重要的是，表明短乳杆菌牙釉质在五天后发生重组。因此，短乳杆菌作为一种强大的再矿化剂出现，并通过一种新的作用机制证实了其在预防或抵消龋齿病变作用方面的功效，这种新的作用机理与先前的临床试验所强调的作用机制相辅相成。

5.结论

目前的研究结果支持使用多功能益生菌的可能性短乳杆菌作为一种实用的方法，诱导对釉质脱矿过程的抵抗，刺激再矿化，从而预防早期龋齿。尽管需要进行更多的研究来确定观察到的效应背后的机制，但结果令人鼓舞。此外，建议对此问题进行进一步的临床研究，以评估短乳杆菌.