棕榈酸通过调节子宫内膜癌细胞应激和脂滴形成发挥抗肿瘤活性

摘要

流行病学和临床证据广泛证明了肥胖在子宫内膜癌发生中的作用。然而，脂肪酸对子宫内膜癌细胞生长的影响尚未得到广泛研究。在此，我们报告了棕榈酸显著抑制子宫内膜癌细胞和子宫内膜癌原代培养物的细胞增殖，并降低子宫内膜癌转基因小鼠模型中的肿瘤生长，同时增加细胞应激和凋亡，减少细胞粘附和侵袭。N-乙酰-L-半胱氨酸抑制细胞应激可有效逆转棕榈酸对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。棕榈酸以时间和剂量依赖性的方式增加细胞内脂滴的形成。通过阻断DGAT1和DGAT2耗尽脂滴，有效提高了棕榈酸抑制细胞增殖和诱导裂解caspase 3活性的能力。总之，这项研究为棕榈酸对细胞增殖和侵袭以及脂滴形成的影响提供了新的见解，这些可能在肥胖驱动的子宫内膜癌的治疗中具有潜在的临床相关性。

1.简介

子宫内膜癌（EC）是美国第四常见的女性癌症，也是最常见的妇科恶性肿瘤，预计2023年将新增66200例，13030例与疾病相关的死亡[1]. 尽管通常在早期和更有利的阶段检测到，预后更好，但在晚期诊断的EC容易复发，并且缺乏最佳的辅助治疗和策略[2]. 肥胖是EC发展的一个公认的风险因素，可能对治疗效果和预后构成威胁[三,4]. 增加的脂肪组织，特别是内脏脂肪组织，是一种内分泌器官，调节新陈代谢和炎症反应，并产生与细胞生长、分化和血管生成相关的生物活性物质，所有这些都与EC致癌有关[5]. 最近的研究发现，在肥胖和瘦削条件下，内皮细胞在脂质代谢的不同方面表现出特定的变化，包括脂肪酸代谢，这可能与内皮细胞的进展和化疗反应有关[6,7,8,9].

癌细胞通过改变脂质、碳水化合物和蛋白质的代谢，创造有利于癌细胞生长的代谢环境，使癌细胞能够有效地维持环境中结构和功能的功能[10]. 脂肪酸（FA）作为一种化学异构化合物，与脂质的合成和代谢密切相关，是能量储存、膜结构和信号传导前体分子所必需的，在癌症的癌变、进展和化疗中表现出不同的功能[11]. 最近的研究发现，饱和脂肪酸（SFAs）产生的单不饱和脂肪酸是调节生物膜流动性、功能性和灵活性的重要指标，而放松对MUFAs与SFAs比率的调节对于确定细胞增殖、侵袭性、，以及控制肿瘤细胞增殖的信号级联[12,13,14]. 膜磷脂的脂肪酸组成因游离脂肪酸的可用性、磷脂酶的酶活性、应激条件和代谢疾病而不断重塑，表明体内肿瘤生长环境条件的改变或摄入FAs比例的改变可以影响癌细胞的增殖活性[15,16,17]. 癌细胞中脂肪酸的高合成率是由脂肪酸合成酶（FAS）的酶系统启动的，以形成丰富的16碳棕榈酸（PA），这是人体中发现的最广泛认可的饱和长链脂肪酸，占体内SFA的65%，占血清总FA的28-32%，占人体膳食脂肪摄入量的10-20%[18,19]. MUFA合成的生物化学途径主要依赖于PA的去饱和或伸长，除了饮食补充外，PA还通过体内所谓的伸长酶和去饱和酶的作用来实现。一些MUFA，如皂苷酸和棕榈油酸，显著影响细胞膜的组成和性质，并改变乳腺癌细胞中生长因子和信号级联的表达[13,20]. 越来越多的证据表明，去饱和酶，包括硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD1），已成为调节支持癌细胞生化和生物表型的代谢和信号通路的关键角色，以SCD1为靶点有可能开发新的癌症治疗药物[21,22]. 除了PA的棕榈酰化参与包括癌基因和抑癌基因在内的多个基因的功能调节外，人们普遍认为PA是通过β-氧化促进细胞生长的能量来源，并通过在癌细胞中作为信号分子参与癌细胞膜的合成[23,24]. 膳食中PA摄入量增加或血浆磷脂PA循环水平升高与乳腺癌风险密切相关[25,26]. 然而，越来越多的证据表明，在各种临床前模型中，PA直接或间接地抑制癌细胞增殖，诱导细胞应激和凋亡，导致细胞周期阻滞，并损害细胞侵袭性[18,25,27]. 重要的是，PA能有效抑制细胞活力并诱导细胞凋亡，同时神经母细胞瘤细胞膜中PA成分也随之增加，而不会影响总的多不饱和含量。PA与油酸和花生四烯酸的结合导致细胞膜脂质体的变化，抑制半胱氨酸天冬氨酸酶的激活和维持细胞活性，表明膜FA重组在抑制细胞生长中的重要作用，以及包括PA在内的膳食FA干预癌症的潜力[28,29].

鉴于PA是人类饮食和人体中最常见的SFA，肥胖和代谢紊乱是EC致癌和进展的最重要风险因素，有必要评估PA在EC细胞增殖和肿瘤生长中的作用[4,18]. 了解PA在EC细胞和肿瘤生长中的作用对于设计使用这种膳食补充剂的新型治疗和预防策略至关重要。在本研究中，我们旨在研究PA对EC细胞系和EC转基因小鼠模型中细胞增殖和肿瘤生长的影响。我们的结果表明，PA抑制EC细胞增殖和侵袭，增加细胞脂滴的形成，并降低肿瘤生长。

2.材料和方法

2.1. 细胞培养和试剂

本研究使用了两种人类子宫内膜癌细胞系石川（RRID:CVCL_2529）和ECC-1（RRID:CVCL_7260）。这两种细胞系都是从北卡罗来纳大学教堂山分校Lineberger癌症中心的细胞库中获得并鉴定的。在实验期间，我们每隔六个月通过支原体检测试验（InvivoGen，加州圣地亚哥，美国）定期检测细胞培养物中的支原体污染。石川细胞保存在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中，ECC-1细胞保存在含10%FBS的RPMI 1640培养基中。所有培养基均添加青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 ug/mL）和L-谷氨酰胺（2 mM/mL）。细胞在加湿的5%CO中培养₂37°C的培养箱。PA来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。T863和PF-06424439来自开曼群岛（美国密歇根州安娜堡）。免疫印迹抗体包括PERK（#5683）、IRE1-α（#2394）、ATF4（#1185）、Bip（#3177）、CLPP（#14181）、Calnexin（#2679）、BCL-XL（#2764）、MCL-1（#5453）、PARP（#9532）、α-微管蛋白（#2144）、β-肌动蛋白（#3700）、蜗牛（#3879）、VEGF-C（#2445）、Vimentin（#5741）、N-cadherin（#13116）、MMP-9（#13667）、p-s6（#4858）、s6（#2217）、p-Akt（#4060）、，从Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）获得Akt（#4691）、p-42/44（#4370）、42/44、p38（#4511）、p-4E-BP1（#2855）、p-ACC（#1181）、ATGL（#2439）、FASN（#3180）、ACSL-1（#9189）、Lipin-1（#14906）、CPT1A（#12252）、HK I（#2024）和HK II（#2867）。Glut1（#A6982）、Glut4（#A7637）、LDHA（#A1146）、DGAT1（#16857）和DGAT2（#13891）购自Abclonal Technology（美国马萨诸塞州沃本）。免疫化学抗体包括Ki-67（#12202）、BCL-XL（#2764）、p-ACC（#11818）、ATGL（#2439）、p-44/42（#4370）、p-s6（#4858）和VEGF-R2（#9698）均来自细胞信号技术。PERK（#SC377400）从圣克鲁斯科技公司购买。抗体使用详情见补充表S1增强化学发光蛋白质印迹检测试剂从Amersham（美国伊利诺伊州阿灵顿高地）获得。所有其他化学品均购自赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

2.2. BSA结合PA的制备

PA的制备如前所述[30]. 简言之，将0.053 g PA（Sigma-Aldrich，P0500，St.Louis，MO，USA）粉末溶解在210μL NaOH溶液（0.2 M）中，在75°C的振荡水浴中加热15分钟，直到PA NaOH溶液变清。然后，添加840μL的30%无脂肪酸BSA（Sigma-Aldrich，A9576，St.Louis，MO，USA），将混合物涡流10 s，然后在55°C下进一步培养10分钟。在BSA-PA复合物中，PA的最终浓度为20 mM，PA:BSA的比率为5:1。通过0.22μm过滤器过滤BSA结合的PA，并将其作为等分样品储存在−20°C的冷冻柜中。当细胞用PA处理时，对照细胞用等量的BSA溶液处理。

2.3. 人源性EC的原代培养

人类EC组织的采集得到了北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会的批准，并在北卡罗来那大学医院进行（IRB#10-1206）。在获得所有患者的知情同意后，从子宫切除术时的EC患者中收集了17个肿瘤组织(补充表S1). 病理学家在UNC-CH对EC进行病理诊断。将5×5 mm的立方体样品置于含有抗生素的DMEM/F12培养基中，并转移至实验室进行原代培养。用PBS清洗组织三次，然后在37°C水浴中用0.5%胶原酶IA、0.1%DNA酶和100 U/mL青霉素和链霉素消化30–60分钟，并摇晃。用PBS冲洗两次后，肿瘤细胞（2×10⁴/每孔）接种于96周的培养板中，并在含有10%FBS的DMEM/F12中培养。用PA处理72小时后用MTT法测定细胞增殖。

2.4. 磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}EC转基因小鼠模型

为了研究PA对体内肿瘤生长的影响，我们利用磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}EC小鼠模型[31]. 该动物研究由北卡罗来纳大学教堂山分校动物护理和使用委员会（IACUC）批准（方案编号21-209）。这些小鼠被安置在我们的动物设施中，进行12小时的光照和12小时的黑暗循环，并允许自由获取食物（50 IF/6F饮食，PecoLab，圣保罗，明尼苏达州，美国）和水。6至8周龄雌性小鼠注射5µL 2.5×10¹¹左子宫角中重组腺病毒Ad5-CMV-Cre的P.F.U（转移载体核心，美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学）。将小鼠随机分为两组：对照组和PA治疗组（每组18只）。注射Ad5-CMV-Cre后8周，用PA（10 mg/kg，100µL/只小鼠口服灌胃，每日）或载体（100μL，水与0.2 N-NaOH的比例为2.5:1，每日）治疗小鼠4周。动物研究证实，这种剂量的PA可以有效抑制癌症生长，包括肝癌和胰腺癌，并且不会产生任何副作用[32,33,34]. 在整个治疗过程中，每周给小鼠称重两次。在PA治疗期间，小鼠表现出正常的活动和行为，两组均无小鼠死亡。所有小鼠均被一氧化碳处死₂治疗4周后出现窒息。仔细采集并记录EC肿瘤、内脏脂肪组织、肝脏和血液。

2.5. 细胞活性测定

采用MTT法评估细胞活力。总之，石川和ECC-1细胞在6.0×10的浓度下进行电镀^三细胞/孔和4.0×10^三然后用不同浓度的PA处理细胞72小时。将MTT（5 mg/mL）添加到每个孔中1小时。随后，丢弃培养基，并向每个孔中添加100µL二甲基亚砜（DMSO）以终止反应。使用微孔板阅读器（美国北卡罗来纳州莫里斯维尔市帝肯）在562 nm的波长下检测每个样品的光密度（OD）值。PA对细胞增殖的影响以对照的百分比计算。AAT Bioquest计算器用于确定IC50值。每个实验至少进行三次，以评估结果的一致性。

2.6. 菌落分析

石川和ECC-1细胞是从库存培养物中获得的，并以400个细胞/孔的密度在六孔板中进行电镀。将细胞附着到微孔后（培养后约2至3小时），用不同浓度的PA处理细胞。PA处理后36小时，用新鲜培养基替换培养基，每3天更换一次培养基。培养10–12天后，用PBS清洗每个孔，并用6.0%戊二醛和0.5%结晶紫的混合物染色。使用Image J软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院V1.8.0）对克隆进行成像和量化。

2.7. 基于细胞的功能分析的制备

除了以下基于细胞的功能检测中的伤口愈合和跨孔检测外，石川和ECC-1细胞在其常规培养基中培养，并用1、100和250μM PA处理不同时间。对照细胞用等量的BSA溶液处理。所有实验均至少进行了三次，以评估反应的一致性。

2.8条。葡萄糖摄入测定

葡萄糖摄取量由2-NBDG葡萄糖摄取试验测定（美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市BioVision）。简单地说，用PA处理96周板上的石川和ECC-1细胞16–18小时。用HBSS清洗细胞，并在含有2-[N-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖（2-NBDG，100μg/mL）的无葡萄糖培养基中培养15分钟。用Hanks’s平衡盐溶液（HBSS）清洗两次后，使用帝肯平板阅读器测量每个孔中细胞2-NBDG的荧光强度（Ex/Em=465/540）。实验一式三份，重复三次。

2.9. 乳酸含量测定

石川和ECC-1细胞在6孔板中以2.5×10的速度培养⁵细胞/微孔过夜，然后用PA处理24小时。收集培养基，使用BioVision乳酸检测试剂盒（Milpitas，CA，USA）并按照制造商的说明评估乳酸生成。使用帝肯平板阅读器在450 nm处测定OD值。同时，用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）收集每个孔中的细胞，并用细胞仪（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Nexcelom Bioscience）计算细胞密度。将每个孔中的乳酸水平标准化为细胞数。

2.10. ATP测定

使用发光ATP测定试剂盒（AAT bioquest，美国加利福尼亚州桑尼维尔）研究PA对EC细胞中ATP产生的影响。石川和ECC-1细胞接种于5×10^三/将100µL ATP检测溶液加入每个孔中，混合，并在室温下孵育20 min。立即在帝肯平板读取器上测量发光强度。检测ATP后，向每个孔中添加5μL MTT溶液（5 mg/mL），并在37°C下培养平板1 h。根据MTT分析测定的活细胞计数，将ATP水平归一化。

2.11. 裂解半胱天冬酶3、8和9 ELISA分析

石川细胞和ECC-1细胞以2.5×10的浓度放置在6孔板中⁵细胞/孔和3.5×10⁵细胞/孔。24 h后，将细胞暴露于PA中14 h，并向每个孔中添加150–180µL的1×caspase裂解缓冲液。收集细胞裂解物，并通过BCA分析（Thermo Fisher）测定蛋白质浓度。将总共30 ug的裂解物添加到96 well黑色板的每个孔中。将带有caspase 3、8或9底物的反应缓冲液添加到每个孔中，并在37°C下与裂解液混合20分钟。使用帝肯微孔板阅读器记录裂解caspase 2（Ex/Em=400/505）、裂解caspase8（Ex/Em=376/482）、裂解caspase 9（Ex/Em2=341/441）的荧光强度。

2.12. 活性氧（ROS）测定

使用荧光细胞内总ROS活性测定试剂盒（AAT Bioquest，Sunnyvale，CA，USA）检测ROS生成的变化。石川和ECC-1细胞（6.0×10^三细胞/孔）接种到黑色96-well板中。24小时后，用PA处理细胞，并在37°C下孵育12小时，以诱导ROS的产生。然后将DCFH-DA（15µM）应用于细胞并孵育30分钟。使用Tecan微孔板读取器在Ex/Em 485/530 nm处测量荧光强度。

2.13. 线粒体膜电位测定

使用JC-1和TMRE（AAT Bioquest，Sunnyvale，CA，USA）专用荧光探针分析线粒体膜电位。将石川和ECC-1细胞在96 wel板中放置过夜，并用PA处理14 h。然后用2µM JC-1或800µM TMRE在37°C下处理细胞30 min。微板阅读器分别在JC-1分析的Ex/Em=480/590 nm和TMRE分析的Ex/Em=549/575 nm处测量荧光强度。

2.14. 附着力测定

用100µL层粘连蛋白-1（10μg/mL）涂敷96周板中的每个孔，并在37°C下培养1小时。然后抽吸液体，并在每个孔中添加200μL封闭缓冲液，在37°C下保持45至60分钟，然后用PBS清洗，同时在冰上冷却。至每口井1.2×10⁴向细胞中添加PA。然后让平板在37°C下培养1.5–2 h。在此期间，抽吸培养基，并通过添加100µL 5%戊二醛固定细胞，并在室温下培养30 min。然后用PBS清洗粘附的细胞，并用100µL 0.1%结晶紫染色30 min。然后用水反复清洗细胞，并向每个孔中添加100µL10%乙酸以溶解染料。摇动平板5分钟，使用帝肯微孔板阅读器在562 nm处测量吸光度。

2.15. Transwell分析

通过改良的Boyden小室试验（美国纽约州科宁市科宁公司）量化细胞侵袭性。石川细胞和ECC-1细胞在1%FBS中饥饿12–14小时，接种在密度为3×10的Matrigel侵入室（孔径为8μm）顶部⁴然后将1、100和250μM PA添加到顶部室中。下部腔室充满了常规培养基。培养板4-6小时，使细胞侵入下室。移除顶部腔室并用PBS清洗下部腔室后，将100µL钙黄绿素AM溶液（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）涂敷于下部腔室，并在37°C下培养30–60分钟。下室的荧光强度由Tecan阅读器在Ex/Em 485/520 nm处测量。

2.16. 伤口愈合试验

Ishikawa和ECC-1细胞以4.0×⁵细胞/孔置于六孔板中，隔夜培养。用20μL移液管形成均匀伤口。将细胞清洗，然后在含有1%FBS的常规培养基中用PA处理48小时。刮伤后24和48小时拍摄照片，并使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院V1.8.0）测量和分析伤口宽度。通过与对照细胞的比较来测量划痕闭合的百分比。

2.17. 脂肪酸氧化（FAO）测定

FAO活性通过FAO酶分析检测（纽约州立大学布法罗分校生物医学研究服务）。石川和ECC-1细胞以2.5×10的密度放置在6孔板中⁵细胞/孔，在37°C下培养过夜，然后用PA处理24小时。用冰镇1×样品缓冲液收集细胞，离心后收集上清液。用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。在均衡蛋白质浓度后，用50µL FAO分析溶液或50µL对照溶液处理20µL每个样品。将混合溶液添加到96 well板中。盘子保存在非CO中₂培养箱在37°C下放置60分钟。OD值由帝肯阅读器在492 nm的波长下测量。从样本读数中减去空白读数。

2.18. 油红O染色分析

石川和ECC-1细胞以1.2×10的密度种植在12孔板中⁵细胞/孔并生长24小时。用PA处理两种细胞系24小时，然后将细胞在新鲜福尔马林中稳定1小时。将油红O（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）和Harris修饰的苏木精加入孔中进行染色。照片由Thermo Scientific Invitrogen EVOS显微镜（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）拍摄。

2.19. 西方免疫印迹法

用不同浓度的PA处理石川和ECC-1细胞6至36小时后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（Thermo Fisher）从两种细胞系中提取总蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher）测定蛋白质浓度。等量的蛋白质通过凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。用5%的非脂肪干乳封闭膜，然后用1:1000至3000稀释的一级抗体在4°C下培养过夜。在用TBS-T洗涤后，在室温下将适当的二级抗体与膜孵育1小时。使用增强化学发光检测缓冲液开发免疫印迹，并使用Bio-Rad成像系统（3.0.1版，加利福尼亚州Hercules，USA）显示条带。在发育完成后，用α-微管蛋白或β-肌动蛋白抗体剥离或清洗膜并进行再增殖。每个实验至少重复两次，以评估结果的一致性。

2.20. 免疫组织化学（IHC）

子宫内膜肿瘤切片（4µm）磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}小鼠用于IHC研究。脱蜡和复水后，内源性过氧化物酶在3%H中被阻断₂O（运行）₂在微波炉中使用柠檬酸缓冲液（柠檬酸钠，pH 6.0）进行10分钟的抗原提取。将载玻片与蛋白块溶液（Dako）孵育1小时，然后在冷藏室中过夜添加初级抗体（每组6张载玻片）。然后清洗载玻片，并在室温下与适当的二级抗体孵育1小时。去除二级抗体后，根据制造商的说明，使用Signal Stain Boost免疫组织化学检测试剂（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）对特异性染色进行可视化。使用Motic（美国宾夕法尼亚州Feasterville）对单个载玻片进行扫描，并使用ImagePro软件（美国加利福尼亚州V2，Vista）对数字图像进行目标蛋白表达分析。IHC评分公式用于表达目标蛋白的表达水平。

2.21. HE染色

EC小鼠的肝脏在处死后仔细采收，并用石蜡包埋。用苏木精对肝载玻片（4μm）进行染色以显示细胞核，用伊红染色以显示细胞质。使用Motic（美国宾夕法尼亚州费斯特维尔）扫描单个载玻片，并使用ImagePro软件（美国加利福尼亚州Vista）分析数字图像。

2.22. 血清血管内皮生长因子（VEGF）和甘油三酯（TG）测定

根据制造商的指示，使用研发VEGF ELISA试剂盒（目录号：MMV00，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）和BioVision甘油三酯定量试剂盒（类别号：ab65336）检测PA治疗后的血清VEGF和TG水平。对PA治疗组和对照组的每个样品进行三次测量。使用帝肯平板阅读器在570 nm处读取平板，以进行VEGF和TG测量。

2.23. 统计分析

所有数据均以三次独立分析的平均值±标准偏差报告。学生的t吨-本研究采用单因素方差分析和检验。使用GraphPad Prism 8（美国加利福尼亚州拉霍亚）统计软件计算比较结果。所有测试都是双面的第页<0.05视为显著。

3.结果

3.1. PA抑制EC细胞增殖及AKT/mTOR、MAPK和p38通路

为了研究PA是否影响EC细胞增殖，石川和ECC-1细胞接受了MTT分析。如所示图1A、 两种细胞系经不同浓度的PA处理后，细胞活力均显著下降，72小时后石川和ECC-1细胞的IC50值分别为348.2±30.29µM和187.3±19.02µM。当两种细胞系都用生理浓度为250µM PA处理72小时时[18]与BSA对照组相比，石川细胞和ECC-1细胞的细胞增殖分别减少了25.7%和65.1%。与MTT分析一致，集落分析显示，在用250µM PA处理36小时并持续细胞培养10-12天后，与各自的对照细胞相比，Ishikawa和ECC-1细胞的集落形成分别减少了约40.6%和70.8%(第页=0.025）(图1B） ●●●●。由于患者源性肿瘤的原代细胞培养物可能比癌细胞系更好地预测细胞毒药物的抗肿瘤活性，因此17个EC原代细胞总培养物与不同浓度的PA培养72小时。MTT分析显示，原代培养细胞对PA处理表现出不同的反应。在17种原代细胞培养物中，有9种在250µM PA条件下表现出至少10%的细胞增殖抑制(图1C和图S1).

为了研究AKT/mTOR、MAPK和p38通路在PA介导的细胞增殖抑制中的作用，用不同浓度的PA处理石川和ECC-1细胞24小时，并用免疫印迹法检测这些通路的变化，使用针对特定磷酸化形式AKT的抗体，MAPK和第38页。结果表明，250μM PA处理后，磷酸化AKT、S6、4E-BP1、p38和p42/44在两种细胞系中的表达均下调(图1D） ●●●●。这些结果表明，PA通过影响AKT/mTOR、MAPK和p38通路降低细胞活力。

3.2. PA诱导EC细胞凋亡

为了评估PA对诱导EC细胞凋亡活性的影响，用不同浓度的PA处理石川和ECC-1细胞系14 h，并用裂解的caspase 3、caspase 8和caspase 9 ELISA测定PA处理细胞的凋亡活性。如所示图2A–C、100µM和250µM处理显著增加了这两种细胞系中裂解caspase 3、8和9的活性。用250µM PA处理EC细胞，石川细胞的裂解半胱天冬酶3增加了1.92倍，ECC-1细胞增加了2.35倍(第页= 0.028). Western blotting结果显示，PA处理14 h后，两种细胞系中Bcl-xL和Mcl-1的表达均降低，PARP蛋白的裂解表达呈剂量依赖性增加(图2D） ●●●●。为了评估线粒体凋亡途径在PA诱导的凋亡中的作用，两种细胞系均用Z-VAD-FMK（10µM，泛酸蛋白酶抑制剂）预处理1.5 h，然后用250µM PA处理14 h用于caspase 3分析，72 h用于MTT分析。与对照处理细胞相比，Z-VAD-FMK预处理阻断了PA诱导的裂解caspase 3活性，并显著挽救PA诱导的凋亡(第页= 0.041) (图2E、 F），表明PA诱导的细胞凋亡依赖于EC细胞的外源性和内源性线粒体凋亡途径。

3.3. PA诱导EC细胞应激

为了研究细胞应激对PA诱导的EC细胞凋亡的作用，采用DCFH-DA法评估细胞ROS水平。用100µM或250µM PA处理这两种细胞系显著增加了ROS的产生(图3A） 。与对照组相比，在250µM剂量下，PA使石川细胞和ECC-1细胞的ROS生成分别增加1.43倍和1.53倍(第页= 0.026). 为了进一步确认PA诱导的ROS增加是否与线粒体功能有关，采用JC-1和TMRE ELISA检测线粒体膜电位（ΔΨm）的变化。在石川细胞中，100µM PA似乎通过TMRE降低了ΔΨM，但JC-1分析没有降低；然而，通过JC-1和TMRE分析，两种细胞系中250µM PA的ΔΨM均有统计学降低(第页= 0.034). 在ECC-1细胞中，与对照细胞相比，100µM和250µM PA处理14小时后，在两种分析中均诱导ΔΨM损失(第页= 0.015) (图3B、 C）。通过Western blotting分析检测PA对内质网应激相关蛋白表达的影响。结果表明，100或250µM PA处理细胞24小时后，两种细胞系中PERK、ATF4、BiP、IRE1-α和CLPP的蛋白表达均上调(图3D） ●●●●。这些结果表明，细胞应激也是PA在EC细胞系中抗增殖作用的部分原因。

3.4. PA减少EC细胞的粘附、迁移和侵袭

为了研究PA对EC细胞黏附和侵袭的影响，对石川和ECC-1细胞进行了层粘连蛋白-1黏附试验、穿孔试验和伤口愈合试验。在石川细胞中，PA在250µM的最佳浓度下减少了细胞粘附和侵袭，而在ECC-1细胞中，除了在250μM PA的剂量下抑制细胞粘附和侵入外，100µM PA还显著降低了细胞粘附性和侵袭能力(第页= 0.018) (图4A、 B）。同样，伤口愈合试验的结果表明，100µM或250µM PA抑制石川和ECC-1细胞的迁移。与对照细胞相比，用100和250µM PA处理细胞48小时后，Ishikawa细胞的迁移分别被抑制12.4%和44.4%，ECC-1细胞的迁移潜力分别被抑制31.1%和51.9%(第页=0.026）(图4C） ●●●●。为了确定上皮-间充质转化（EMT）过程是否涉及PA介导的侵袭和迁移，将石川和ECC-1细胞与不同浓度的PA孵育过夜，并使用Western blot检测EMT和血管生成标记物的表达。结果表明，高浓度PA（250µM）降低了两种细胞系中VEGF-C、MMP9、蜗牛、波形蛋白和N-Cadherin的表达(图4D） ●●●●。总之，我们的结果表明PA具有抑制EC细胞粘附和侵袭的潜力。

3.5. 细胞应激调节PA诱导的迁移和侵袭

为了验证细胞应激在PA诱导的迁移和侵袭中的作用，石川和ECC-1细胞用0.1 mM NAC（N-乙酰-l-半胱氨酸）预培养3 h，然后在指定时间用250和500µM PA处理。用NAC对两种细胞株进行预处理，有效地消除了PA相关的ROS水平。此外，NAC部分逆转了PA对细胞增殖的抑制作用，并减弱了PA诱导的细胞凋亡(第页= 0.031) (图5A、 B）。此外，NAC能够减轻PA对两种细胞系的伤口愈合抑制和侵袭能力降低的影响(第页= 0.029) (图5C、 D）。Western blotting结果表明，NAC预处理降低了两种细胞系中PA-介导的Bcl-xL、Mcl-1、Calnexin和PERK的下调(图5E） ●●●●。这些结果表明，细胞应激途径是控制PA对EC细胞增殖、凋亡和侵袭作用的潜在触发因素。

3.6. PA引起EC细胞脂质积累和脂质生成增加

鉴于外源性脂肪酸增加了脂滴（LD）的形成，并且LDs被认为参与了癌细胞的多种代谢过程，我们通过油红O染色研究了PA在EC细胞系LDs形成中的调节作用。24小时后，PA以剂量依赖性的方式增加石川和ECC-1细胞中LD的积累(第页= 0.033) (图6A） 。此外，与未经处理的细胞相比，用100µM PA处理两种细胞系以时间依赖性方式增加了油红O染色，石川细胞在9小时达到最大值，ECC-1细胞在18小时达到最大(第页= 0.023) (图6B） ●●●●。在用100μM PA处理两种细胞系后，通过Western印迹分析以时间过程的方式观察ACC和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）的磷酸化。在100µM PA处理的24小时内，PA显著增加了两种细胞系的ACC磷酸化和ATCL表达(图6C） ●●●●。由于LD是储存甘油三酯（TGs）和其他中性脂质的主要细胞内细胞器，因此通过ELISA测定细胞内TG水平。用100µM和250µM PA隔夜处理细胞，石川细胞的细胞内TG生成量分别增加了20.9%和54.1%，ECC-1细胞的细胞间TG生成分别增加了46.6%和66.4%(第页<0.05），伴随着ATGL、长链酰基辅酶A合成酶-1（ACSL-1）和脂肪酸合成酶（FASN）在两种细胞系中的表达增加(图6D、 E）。为了评估PA对EC细胞线粒体脂肪酸氧化（FAO）的影响，两种细胞系均以100µM PA的时间过程方式处理。有趣的是，在处理后18小时内，两种细胞系中都观察到CTP1A的表达增加和FAO的活性增加，而当细胞被100和250µM PA处理24小时时，CPT1A的表达和FAO活性降低(图6F、 G）。综上所述，这些结果表明，PA可有效增加EC细胞中LD的形成和从头合成脂肪酸，支持PA处理EC细胞中同时合成脂肪酸和FAO的概念[35,36].

由于脂肪酸可以刺激癌细胞代谢重编程，我们接下来研究了PA对EC细胞糖酵解代谢的影响。100和250µM剂量的PA处理24小时后，两种细胞系的葡萄糖摄取和乳酸生成均显著降低(第页= 0.043) (图6H） ●●●●。为了进一步支持这一点，高浓度PA降低了石川和ECC-1细胞中谷氨酸1、谷氨酸4、LDHA、己糖激酶（HK）I和己糖激酶II的表达，这是通过Western blotting分析评估的(图6一） ●●●●。最后，与处理24小时后的对照细胞相比，250µM PA使石川细胞和ECC-1细胞的细胞ATP生成分别减少了15.3%和19.3%(第页= 0.014) (图6J） ●●●●。这些数据支持PA代谢和糖酵解活性之间存在反馈调节。

3.7. 抑制LD形成增加EC细胞对PA的敏感性

为了研究LD的形成在PA介导的生长抑制中的作用，我们选择了两种小抑制剂T863和PF-06424439来阻断DGAT1和DGAT2的功能，DGAT1与DGAT2催化哺乳动物TAG生物合成的最后一步[37,38]. 为了减少PA诱导的细胞增殖抑制对LD形成的影响，用150µM PA和5µM T863或5µM PF-06424439及其组合处理Ishikawa和ECC-1细胞24小时。如图7A、 B，通过T863靶向DGAT1或通过PF-06424439靶向DGAT2减少了LD的形成，并且在减少两种EC细胞中LD的形成方面，T863被证明比PF-06424439更有效(第页= 0.019). 重要的是，PA结合T863和PF-06424439完全阻止LD的形成。MTT分析表明，T863阻断DGAT1而PF-06424439阻断DGAT2有效地提高了PA抑制细胞增殖的敏感性，但T863、PF-06444439和PA的联合作用在两种细胞系中产生了最大的细胞抑制作用(第页= 0.036) (图7C） ●●●●。与我们的MTT结果一致，通过与T863和PF-06424439联合处理，LDs的耗竭显著增加了PA处理的EC细胞中裂解caspase 3的活性(第页= 0.021) (图7D） ●●●●。这些结果表明，在高浓度PA存在下，LDs对EC细胞具有细胞保护作用。

3.8. PA抑制Lkb1肿瘤生长和增加脂质生成^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}EC的鼠标模式

为了测定PA对肿瘤生长的抗癌活性，磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}小鼠（18只/组）经口灌胃给予10mg/kg PA或载体，每日1次，共4周。每只小鼠的体重每周测量两次。在治疗期间，小鼠表现出正常活动，体重没有明显变化(图8A） 。与对照组相比，治疗结束后小鼠的血清甘油三酯（TGs）和肝脏重量没有变化(图8B、 C）。然而，肝切片的H&E染色显示，PA处理的小鼠中膨胀的肝细胞显著增加，表明PA增加了肝细胞中脂肪的积累(图8D） ●●●●。与对照小鼠相比，PA治疗显著降低了43.2%的肿瘤重量(第页= 0.022) (图8E） ●●●●。最后，应用IHC染色分析PA治疗后各组细胞增殖的差异。与对照组相比，PA抑制Ki-67的表达52.4%(第页=0.025）(图8F） ●●●●。这些结果表明，PA在体内外均能有效抑制EC细胞增殖和肿瘤生长。

为了评估PA抑制体内肿瘤生长的机制，用IHC检测Bcl-xL、PERK、VEGF-R2、phospho-ACC、ATGL、phosphal-42/44和phos-S6的表达，用ELISA测定子宫内膜肿瘤中血清VEGF的生成磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}老鼠。PA对治疗4周后血清VEGF水平没有影响(补充图S2)；然而，与对照组小鼠相比，经PA治疗的小鼠子宫内膜肿瘤中Bcl-xL、VEGF-R2、phospho-42/44和phospho-S6的表达显著降低，而PERK的表达增加(第页= 0.015) (图8G） ●●●●。为了观察PA对体内脂质代谢的影响，采用Western blotting分析法测定EC组织中脂肪酸合成的变化磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}老鼠。结果表明，PA处理增加了FASN、Lipin-1和磷酸化-ACC的表达，并降低了S6的磷酸化表达(图8H） ●●●●。IHC也证实了类似的结果，表明PA有效地增加了EC组织中ACC和ATGL的磷酸化表达(图8我和补充图S3). 总的来说，这些结果表明，尽管PA不会增加体重，但在治疗4周后，它会增加肿瘤组织中的脂肪生成。PA抑制体内肿瘤生长的机制包括增加细胞应激和凋亡、减少血管生成、抑制AKT/mTOR和MAPK通路活性。

4.讨论

FAs与EC的进展和预后有关[39]. 然而，关于PA对多种癌症中细胞增殖、粘附、迁移、侵袭、肿瘤生长和脂肪酸代谢的影响，存在相互矛盾的报道[18]. 最近的研究表明，PA通过靶向多种细胞信号和代谢途径在体内外具有抗肿瘤潜力[18,25,34,40]. 虽然代谢异常与EC的致癌和进展之间的关系已经建立，但包括PA在内的FAs对EC中细胞增殖和肿瘤生长的关键重要性尚未得到很好的研究。利用EC细胞系和EC转基因小鼠模型，我们发现生理浓度的PA在体内外通过抑制AKT/mTOR和MAKP信号通路，显著降低细胞活力，引起细胞应激和凋亡，减少细胞侵袭和迁移，并抑制肿瘤生长。EC细胞增加细胞内脂肪酸合成和LD形成，以响应不同浓度的PA。LDs有可能保护EC细胞免受PA诱导的细胞抑制作用。在PA处理的EC细胞中，细胞应激是控制细胞增殖、凋亡和侵袭的触发因素。此外，使用来自人类EC组织的17种原代细胞培养物来检测不同浓度PA对细胞增殖的影响，这表明在MTT分析中，这些原代培养物对250和500µM PA处理的反应不同。虽然我们在原代培养物中未发现病理分级、临床分期、病理诊断和PA敏感性之间存在任何相关性，但我们推测PA反应的这些差异可能与EC的不同分子分类和代谢状态有关。总的来说，这些结果突出了PA在EC细胞的细胞生存和肿瘤生长中的作用磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}EC小鼠模型。

EC细胞的侵袭和迁移是由控制EMT过程的多种信号通路启动和介导的，包括整合素和基质降解酶，它们促进细胞从原发肿瘤中分离，进而促进细胞通过细胞-基质相互作用获得能动表型的能力[41,42]. 脂质代谢的重新编程可有效改变膜的脂肪酸组成，增强细胞膜流动性，并通过EMT信号通路促进EC进展[43,44]. 越来越多的证据表明PA对某些类型的癌细胞具有抗侵袭和抗转移作用[45]. 在胃癌中，低浓度的PA（50和100μM）通过CD36依赖的AKT通路激活诱导细胞迁移和侵袭，而高浓度的PA可能由于脂毒性而减少细胞迁移和侵入[46]. 相反，10或20μM PA对PC3和DU145前列腺癌细胞的迁移和侵袭具有抑制作用，至少部分通过调节PKCζ、整合素β1和EMT过程，并消除M2巨噬细胞诱导的EMT和结直肠癌细胞的移动。此外，100µM PA显著促进PC3细胞的细胞增殖活性、迁移能力和EMT过程[34,40,47,48]. 鉴于最近发现的PA对各种癌细胞侵袭能力的双重影响的相关性，我们最初通过在EC细胞中使用粘附、改良的Boyden室和创伤愈合试验来关注PA对细胞运动的影响。低浓度的PA不会增加或减少细胞粘附或侵袭，而超过100µM的PA会通过MMP9的失活和EMT过程的减少减少EC细胞的粘附和侵袭。IHC结果证实，PA处理降低了EC组织中VEGF-R2的表达。NAC对ROS的抑制导致了两种细胞系中PA诱导的细胞迁移的部分拮抗。我们的结果以及其他实验室以前的观察结果表明，PA对迁移和侵袭的影响可能部分取决于肿瘤类型和浓度，而PA诱导的细胞应激是EC细胞粘附和侵袭的触发因素。需要在进一步的实验中探索潜在的调控机制。

高浓度的游离脂肪酸，尤其是饱和脂肪酸，包括PA，会导致ER蛋白负荷和ER折叠之间的不平衡，最终引发ER应激、凋亡和癌细胞死亡[49,50]. 棕榈酰化通过调节内质网中的贩运、定位、稳定性和聚集与内质网应激相关[51]. 过量摄入PA可直接或间接影响细胞内ROS的积累并诱导细胞应激，其影响可能与细胞类型有关[49,52]. 外源性PA能够改变MDA-MB-231乳腺癌细胞内质网的脂质组成，内质网膜的脂质组成似乎参与抑制PA诱导的细胞增殖和凋亡[53]. 越来越多的证据表明，PA治疗引起的细胞应激是PA诱导癌细胞凋亡的重要原因。抑制细胞应激可显著降低PA诱导的心肌细胞、Leydig细胞、额叶前细胞和结肠癌细胞的凋亡[54,55,56,57]. 除了细胞应激外，PA介导的凋亡似乎还涉及许多相关因子和信号通路，包括p53、p62、p21、Sesn2、IDH1、CD36、S6K1和PI3K/Akt通路[34,58,59,60,61]. 在我们的研究中，我们发现石川和ECC-1细胞系在100µM以上的PA处理下，对ROS生成的诱导和线粒体膜电位的降低表现出不同的敏感性。EC细胞系对PA诱导的细胞应激反应的差异可以通过表征每个细胞亚群的不同脂质谱和代谢来进一步描述，因为不同的EC细胞系表现出不同的葡萄糖和脂质代谢谱[62]. 我们之前的研究表明，与其他EC细胞系相比，石川和ECC-1细胞的增殖主要依赖于通过多种复杂信号通路的糖酵解[63]. 此外，我们发现，无论两种细胞对PA的细胞应激反应有何差异，PA都能诱导两种细胞系的内源性和外源性凋亡途径。NAC对细胞应激的抑制部分减弱了两种细胞株的凋亡，提高了细胞活力。总之，我们认为，从遗传背景和代谢特征到内质网膜中的脂质组成等多种因素可能是影响PA诱导的EC细胞应激的因素。细胞应激是控制PA诱导EC细胞凋亡和细胞增殖抑制的触发因素。

LDs正在成为细胞生长、新陈代谢、侵袭、炎症、免疫、肿瘤转化和耐药性的新型调节因子。LDs的积累通常被认为有利于癌细胞的生存，因为它可以隔离神经酰胺和DAG等炎症诱导脂质，保护多不饱和脂肪酸免受导致DNA损伤的脂质过氧化，并保护癌细胞免受应激和氧化应激[64,65]. 鉴于过量的细胞内LD已被证明是自噬、自噬，尤其是脂类吞噬的底物，最近研究表明，它通过在LD中用酸性水解酶动员甘油三酯和胆固醇来调节LD的形成，以维持脂质的内稳态[66,67]. 然而，过多的FA负荷或阻碍脂质分解会导致LDs过度积累，最终导致正常细胞和癌细胞的脂质毒性[65,68,69]. 在胃癌细胞中，FAs或脂肪细胞通过以C/EBPα依赖的方式上调DGAT2的转录，诱导细胞内LD的形成[70]. 同样，用200μM PA处理HepG2细胞24小时，导致LDs的形成并刺激线粒体氧化代谢[71]. 有趣的是，拉曼显微镜观察发现，PA处理细胞中LD的平均数量和大小低于其他FA处理细胞中的LD，这表明FA类型可能对LD的形成有不同的影响[72]. 通过使用特定的小抑制剂靶向DGAT1和DGAT2来抑制TAG合成，有效地耗尽了LDs的形成，并根据癌细胞中FA的类型对细胞生长产生不同的影响[38,73,74]. 在目前的研究中，PA浓度的增加以时间和剂量依赖的方式增加了EC细胞系中LD的形成。DGTA1/2抑制剂阻断LDs的积累有效增强了PA在两种EC细胞系中抑制细胞增殖的能力。由于DGAT1和DGAT2是催化TAG合成最后一步并控制LD生物生成的酶，因此抑制它们的功能会导致游离FA和其他脂质在细胞质中的浓度增加，最终导致癌细胞更高的“脂质毒性”[38,75]. 最近的研究证实，DGAT1缺陷细胞对脂质应激敏感，导致caspase 3和7活化增加，而siRNA敲低DGAT1可减少LD形成，导致前列腺癌LNCaP细胞自噬并抑制细胞生长[75,76]. 因此，药物抑制DGAT1/2可能在癌症治疗中具有治疗潜力，包括EC[74].

PA作为一种细胞内信号分子，参与各种信号通路的激活和失活以调节肿瘤生长。PA抑制或促进肿瘤细胞生长通常依赖于具有不同功能的多种途径，而不涉及任何特定的信号通路[18]. 例如，PA通过抑制结直肠癌细胞中IL-10-STAT3-NF-κB信号轴来抑制细胞增殖和M2-TAM诱导的迁移和侵袭特性[40]. 另一方面，200µM PA治疗神经母细胞瘤细胞并不影响细胞活性，但阻断了胰岛素诱导的代谢激活，抑制了胰岛素/PI3K/Akt通路的激活，并激活了mTOR激酶[77]. 有趣的是，接触400µM PA的肉瘤细胞通过T366的PTEN磷酸化促进细胞增殖并激活AKT/mTOR/S6通路[78]. 我们的结果表明，250µM PA显著降低石川和ECC-1细胞中磷酸化AKT、S6、4-EBP1、p38和p42/44的表达，并抑制PA处理的肿瘤组织中S6和p42/44的磷酸化表达。这些结果支持了PA在EC中通过AKT/mTOR和MAPK途径抑制肿瘤生长的事实。

一些研究证实，PA在不同类型的癌症中对癌细胞增殖和侵袭具有相反的作用，即使在同一类型的癌症内，PA在临床前癌症模型中对肿瘤生长也有不同的影响[18,25,79]. 鉴于PA要么是癌细胞生长的能量来源，要么是调节癌细胞增长的信号分子，很难从肿瘤类型的角度解释这些现象。代谢重编程、癌症表型、PA的稳态平衡以及细胞膜的PA成分可能是这些差异的原因。此外，尽管健康受试者的PA血浆浓度差异很大，从0.1到4.1 mmol/L不等，但我们在本研究中使用的剂量为100和250μM，均在PA的生理浓度范围内[18,80,81]. 100和250μM PA处理EC细胞显著增加细胞LD形成和TG浓度，诱导细胞应激，并导致细胞凋亡。这个LKB1号机组^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}10 mg/kg PA治疗4周后，小鼠的血清TG浓度、体重或肝脏重量没有增加，但治疗组出现气球状肝细胞。这些结果表明，这些剂量的外源性PA可有效地在体内外引起生物功能的变化。一项类似的研究还表明，100和200μM PA显著诱导EC细胞株RL95-2和HEC-1A的凋亡、DNA损伤和细胞周期阻滞[80]. 此外，对血液样本的代谢组学分析发现，与健康女性相比，I期和II期EC患者的PA浓度显著降低[82]. 总的来说，根据目前的研究结果和其他少数关于PA在EC中的研究，我们认为外源性PA的生理浓度可以通过各种生物途径发挥抑癌作用，参与诱导细胞反应和凋亡，从而抑制EC中的细胞增殖和凋亡。在我们的EC细胞系和LKB1号机组^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}EC小鼠模型。

除了PA的抗肿瘤活性外，最近的研究表明，PA与化疗药物或生物分子结合可以显著提高癌细胞对这些药物的敏感性[83]. 在HepG2异种移植模型中，PA通过增强CHOP增加对甲基硒酸诱导的凋亡和抑制肿瘤生长的敏感性[33]. 与单一疗法相比，纳米粒子包裹的PA联合阿霉素可降低乳腺癌细胞和小鼠模型的细胞增殖、肿瘤生长和转移能力[84]. 此外，生理浓度的PA增加了顺铂和阿霉素对人EC细胞生长抑制的敏感性[80]. 虽然PA对这些药物敏感性增加的机制目前尚不清楚，但值得评估PA与顺铂和紫杉醇在EC细胞中的联合应用，以及LKB1号机组^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}在我们即将进行的项目中。

5.结论

目前关于FAs对EC细胞增殖和肿瘤生长的影响的数据有限。我们报道PA在EC细胞中表现出抗增殖和抗肿瘤活性，并且在EC细胞内具有抗肿瘤活性磅1^{飞行/飞行}第53页^{飞行/飞行}通过诱导细胞应激和凋亡以及抑制AKT/mTOR和MAPK通路建立EC小鼠模型。细胞应激是介导PA对EC细胞生长、凋亡侵袭和肿瘤生长影响的关键成分。PA结合靶向LDs的形成可能为EC的治疗提供新的见解。需要进一步研究PA的抗肿瘤机制，以及与卡铂、，为将来在肥胖驱动的EC中进行这种新型膳食补充剂的临床研究奠定了基础。