PPARγ拮抗剂通过调节铁凋亡和二硫中毒发挥抗肿瘤作用

摘要

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞癌的一种常见亚型，导致疾病复发和低生存率。PPARγ是一种配体依赖的核转录因子，在肿瘤发生发展中具有重要意义。然而，PPARγ在OSCC发展中的作用尚未完全阐明。通过转录组测序分析，我们发现经PPARγ拮抗剂治疗后，铁凋亡相关分子显著富集。我们随后通过透射电镜、铁检测等证实了铁下垂的发生。值得注意的是，铁下垂抑制剂不能完全挽救PPARγ抑制剂引起的细胞死亡，当二硫中毒和铁下垂抑制剂共存时，挽救效果最大。我们确认确实存在二硫中毒表型。从机制上讲，通过qPCR和Western blotting，我们观察到PPARγ的抑制导致血红素加氧酶1（HMOX1）上调，从而促进铁沉积，而溶质载体家族7成员11（SLC7A11）也上调，促进OSCC中的二硫沉积。最后，利用飞行流式细胞术分析和多重免疫组织化学染色来表征PPARγ拮抗剂处理的小鼠舌原位移植瘤模型中OSCC组织的免疫状态，结果表明，PPARγ的抑制导致了铁下垂和二硫中毒，促进cDC和CD8的聚集⁺T细胞，并抑制OSCC的进展。总之，我们的研究结果表明，PPARγ在调节OSCC细胞死亡中起着关键作用，靶向PPARγ可能是OSCC的一种潜在治疗方法。

1.简介

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种侵袭性肿瘤，起源于口腔粘膜的鳞状上皮细胞，是影响口腔的最常见癌症之一。在大多数情况下，手术干预是OSCC的主要治疗方法[1]. 肿瘤细胞清除不足会增加局部和区域复发的风险，从而降低长期生存率。在晚期进展的病例中，可以进行术后治疗，如放疗、放化疗、针对癌基因的靶向治疗和免疫治疗，但这些治疗未能有效提高生存率[2,三]. 因此，寻求新的口腔鳞癌治疗方式至关重要。

PPARγ是一种核受体蛋白，在调节体内各种生理过程中起着关键作用[4]. 一些研究表明，PPARγ的激活可以调节细胞对葡萄糖的摄取和利用[5,6]. 值得注意的是，PPARγ在肿瘤中的作用是复杂的，其结果似乎受癌症类型、发展阶段、特定遗传和分子背景等因素的影响[7]. 先前的研究表明，与PPARγ表达较低的OSCC患者相比，PPARγ高表达OSCC患者的预后较差[8]. 然而，其调控机制和靶向治疗潜力仍不清楚。此外，PPARγ被认为通过与铁沉积的发生和抵抗相关的多个途径调节细胞内氧化还原平衡和脂质代谢。PPARγ激活可通过调节细胞内抗氧化防御系统、减少脂质过氧化和铁离子积累来抑制铁下垂[9,10]. 近年来，铁下垂在癌症界引起了极大的兴趣，部分原因是铁下垂是一种由铁依赖性脂质过氧化促进的程序性细胞死亡机制，它在机制和形态特征上不同于其他形式的调节性细胞死亡，具有巨大的治疗癌症的潜力。肿瘤细胞已经进化出多种机制来逃避铁下垂并促进肿瘤的发展和转移，包括限制多不饱和脂肪酸（PUFA）-PL的积累和过氧化，限制游离铁的可用性，以及上调细胞抗氧化防御系统途径[11,12].

众所周知，SLC7A11介导的胱氨酸摄取在保护细胞免受铁凋亡中至关重要[13,14]. 矛盾的是，在葡萄糖缺乏的情况下，SLC7A11促进细胞死亡[15,16]. Gan等人发现，在SLC7A11高表达的癌细胞中，NADPH供应不足会导致二硫化物应激，这称为二硫中毒[17]. 然而，在肿瘤细胞死亡过程中，二硫中毒和铁凋亡能否共存尚待验证。

在这项研究中，我们观察到OSCC细胞在PPARγ抑制时表现出铁中毒表型，而铁凋亡抑制剂可以部分缓解这种表型。此外，PPARγ被抑制后也出现了二硫中毒表型，同时给予铁凋亡和二硫中毒抑制剂可以改善这种细胞死亡。从机制上讲，我们发现抑制PPARγ可以通过上调血红素氧化酶1（HMOX1）促进OSCC细胞的铁凋亡，并通过上调SLC7A11促进二硫代谢。在小鼠原位移植瘤模型中，PPARγ被抑制后，免疫细胞数量增加；这些细胞包括树突状细胞和CD8⁺T细胞，并通过脱铁和二硫化物变性募集，从而抑制OSCC中的肿瘤发展。

2.材料和方法

2.1. 动物

我们从华西口腔疾病中心模型中选择了5-6周龄SPF C57BL/6成年雌性小鼠（体重20-25 g）。给小鼠提供不受限制的食物和水，将其置于无致病性的笼子中，进行12小时的光/暗循环，并将其保持在20至26°C之间的调节温度。动物实验是随机和盲法的。这些小鼠被安乐死，以尽可能减少疼痛。本研究根据赫尔辛基宣言的指导方针进行，并经四川大学华西牙科伦理委员会机构伦理委员会批准（WCHSIRB-D-2023-6382023年11月23日）。

2.2. 体内小鼠模型及分析

4MOSC2细胞在KSFM中培养，添加或不添加GW9662（20µM，Sigma，St.Louis，MO，USA），持续24小时。然后，将细胞重新悬浮在无血清培养基中，准备注射。使用无菌一次性1mL注射器，细胞悬液，含1×10⁶将100µL体积的细胞注射到小鼠的舌头中。然后将小鼠分为两组：实验组和对照组。实验组每三天腹膜内注射一次GW9662（2.5 mg/kg），而对照组以相同的时间间隔给予二甲基亚砜。12天后，或者当动物达到安乐死标准时，他们被安乐死。收集的样本通过飞行时间（cyTOF）分析和免疫组织化学的细胞术进行综合评估。

2.3. 细胞培养

四川大学华西口腔医学院口腔科国家重点实验室提供了人口腔鳞癌细胞系UM1和CAL27以及鼠口腔鳞状细胞系4MOSC2。UM1和CAL27细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；BI，Kibbutz Beit HaEmek，以色列）和1%青霉素-链霉素溶液（HyClone，Logan，UT，美国）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；Sigma，St.Louis，MO，USA）中适当培养。同时，将4MOSC2细胞保存在特定的无血清角质形成细胞培养基中（KSFM；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。所有细胞均在37°C下在含有5%CO的增湿大气中培养₂根据刺激条件，将细胞与GW9662（20µM）、T0070907（中国上海塞莱克20µM）、Liproxstatin-1（2µM，Sigma，美国密苏里州圣路易斯）、Rosiglitazone（10µM、Sigma、美国密苏达州圣路易）或TCEP（中国上海赛莱克1 mM）预培养24小时、48小时或72小时。用作溶剂的二甲基亚砜（DMSO）的最终浓度不超过0.1%。

2.4. 透射电子显微镜

UM1和CAL27细胞（1×10⁵)在DMEM或含有GW9662的DMEM中培养。在4°C孵育后，将细胞固定在3%戊二醛中12小时，然后固定在1%四氧化锇中1小时。在逐渐脱水后，将细胞浸入乙酸丁酯中，然后嵌入Epon812树脂中。使用超薄切片机切割约60-90纳米厚的超薄切片。这些切片用醋酸铀酰染色10–15分钟，柠檬酸铅染色1–2分钟。用透射电子显微镜（JEM-1400FLASH，JEOL，东京，日本）获取载有切片的铜网格的图像。

2.5. 光学显微镜研究

采用TUNEL法（中国武汉BOSTER）检测OSCC细胞的凋亡。CM-H2DCFDA（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科学公司）用于检测OSCC细胞中的ROS。使用Image-iT™脂质过氧化试剂盒（Th Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）评估脂质过氧化。将OSCC组织固定在4%中性缓冲甲醛溶液中（Biosharp，中国合肥），嵌入石蜡中，然后切片。采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学分析（Biosharp，中国合肥）。对于免疫组织化学染色，使用柠檬酸钠抗原回收液（中国上海贝约泰）或EDTA抗原回收液进行抗原回收（中国上海贝约泰）。将载玻片在4°C下培养过夜，然后用3%的BSA溶液稀释初级抗体。使用抗PPARγ抗体（Abcam，波士顿，马萨诸塞州，美国，1:250）、GPX4抗体（Abcam，波士顿，美国，1:300）、SLC7A11抗体（Abcam，波士顿。随后，将组织切片与相应的二级抗体（Zsbio，中国北京）在37°C下孵育30分钟，并使用二氨基联苯胺（DAB，Gene-Tech，南旧金山，加利福尼亚州，美国）进行可视化。组织切片图像是使用Aperio ScanScope（Leica microsystems，Wetzlar，德国）采集的。使用ImageJ软件（ImageJ 1.x，NIH，Bethesda，MD，USA）对切片中的三个随机选择的区域进行染色区域的定量分析。

2.6. MDA的测量

按照制造商的说明，使用丙二醛（MDA）检测试剂盒（Sigma，St.Louis，MO，USA）测定脂质过氧化产物的浓度。本试验采用硫代巴比妥酸（TBA）反应定量MDA，并在532 nm处测量MDA-TBA加合物的吸光度。

2.7. 铁含量测定

铁和亚铁离子（Fe²⁺)根据制造商指南，使用铁测定试剂盒（美国马萨诸塞州波士顿Abcam）评估水平和比率。铁²⁺与探针形成稳定的颜色络合物，在593nm处测量。铁^3个+还原为铁²⁺用于量化总铁（Fe²⁺/铁^3个+).

2.8条。细胞活力

使用细胞计数试剂盒-8（Biosharp，中国合肥）评估处理后的细胞增殖。将UM1和CAL27细胞悬浮液（200µL，2000个细胞/孔）接种到96 well板中。将细胞与5%CO在37°C下孵育₂在装有GW9662（20μM）、T0070907（20μM）、liproxstatin-1（2μM）或TCEP（1 mM）的增湿培养箱中。药物治疗持续24、48或72小时。每个孔添加20µL CCK-8溶液，并培养1.5小时。使用紫外分光光度计测量450 nm处的吸光度。

2.9. 葡萄糖测量

按照制造商的协议，使用葡萄糖检测试剂盒（中国北京索拉比奥）测定UM1和CAL27细胞培养基中的葡萄糖含量，并将其归一化为每个样品中的总细胞数。

2.10. NADPH测量

采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA；中国泉州瑞信生物技术有限公司）测定NADPH水平。定量基于细胞计数，使用微孔板阅读器在450 nm处读取吸光度。然后通过标准曲线计算浓度。

2.11. Western Blot分析

用无菌PBS清洗细胞三次，用RIPA裂解缓冲液提取蛋白质。使用Pierce™BCA蛋白质分析试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）测定蛋白质浓度。为了还原Western Blot，使用了带有还原剂的蛋白质负载缓冲液，而非还原WesternBlot使用了不含还原剂的缓冲液。样品在95°C下加热10分钟，然后进行SDS-PAGE电泳，随后转移到PVDF膜上（Millipore，Bedford，MA，USA）。用5%脱脂牛奶封闭1小时后，在4°C下将膜与主要抗体孵育过夜：抗GLUT1（Proteintech，中国武汉，1:1000）、抗PPARγ（Abcam，波士顿，马萨诸塞州，美国，1:1000，抗SLC7A11（Abcam，波士顿，马萨诸塞州，美国，1:2000）、抗GAPDH（Abcam，波士顿，美国，1:10000）、抗Pan-Actin（Cell Signaling Technology，Danvers，马萨诸塞诸塞州（美国，1:500）和抗β-Actin（Proteintech，中国武汉，1:5000）。然后将膜与HRP-结合的抗鼠或抗兔二级抗体（ZSbio，中国北京，1:10000）孵育1小时。在用化学发光底物培养后，使用ImageReader AS-2000（日本东京富士胶片公司）捕获图像，并使用ImageJ软件（ImageJ 1.x，NIH，Bethesda，MD，USA）进行分析。原始数字可以在中找到补充资料.

2.12. 定量实时PCR

使用TRIzol试剂（GENSTONE BIOTECH，中国北京）从每个样品中提取总RNA，并根据制造商的协议使用PrimeScript RT Kit（Vazyme，中国南京）进行逆转录。用于Q-PCR的引物如下：Hmox1正向：5′-AAGCCGAATGCTGAGTTCA-3′，Hmos1反向：5′-GCCGTGATATGTAGAGAAAGGA-3′；Slc7a11正向：5′-GCTTTTGTCTTATGCTGAATTGG-3′，Slc7al11反向：5′-TGCAGGGCGTTATGGAGGAG-3′；Gapdh正向：5′-AGGTCGGTGAACGGATTTG-3′，Gapdh反向：5′-GGGTGTTGATGGCAACA-3′。使用SYBR进行定量PCR。使用绿色系统（Vazyme，中国南京），样品在ABI 7300实时PCR仪器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上运行。

2.13. 肌动蛋白的荧光染色

用PBS清洗载玻片上的细胞，并用4%多聚甲醛固定。固定后，用渗透缓冲液（PBS中0.5%Triton X-100）使细胞渗透5分钟。肌动蛋白丝用100 nM肌动蛋白染色555指骨蛋白（美国科罗拉多州丹佛市Cytosketon）染色30分钟。然后用含有DAPI的固定介质（VECTASHIELD，Vector Labs，美国加利福尼亚州伯灵盖姆）固定载玻片并在荧光显微镜下检查。

2.14条。多重免疫组织化学

根据制造商的说明，使用多重免疫组织化学（mIHC）试剂盒（Akoya Biosciences，Marlborough，MA，USA）处理组织切片。所使用的主要抗体包括CD8a（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA，1:400）、CD11c（Cell Signaling Technology，丹弗斯，MA，美国，1:400稀释）和PANCK（Abcam，Boston，MA，US，1:2000）。用含有DAPI（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的ProLong™Gold Antifade Mountant对细胞核进行复染。最后，在免疫荧光显微镜下仔细检查样品，以获取详细的荧光图像。

2.15. CyTOF公司

收集原位肿瘤形成实验中获得的小鼠OSCC组织，用飞行时间质谱进行分析。将两个小鼠的肿瘤合并为一个样本，保存在一个存储溶液中，然后提交给PLTTECH（中国杭州），使用CyTOF技术对不同组的OSCC组织的免疫特性进行全面分析。

2.16. 数据处理

使用GraphPad Prism软件（8.0版）进行数据分析，数据结果显示为平均值±标准偏差。这个第页-值由未配对学生的t吨-测试或方差分析，以及相应的样本量(n个) ≥ 3. 统计显著性测定于第页< 0.05. “*”表示第页<0.05，“**”代表第页<0.01，“***”代表第页< 0.001.

3.结果

3.1. PPARγ拮抗剂GW9662诱导OSCC细胞铁凋亡

为了探讨PPARγ在OSCC生长中的作用，我们使用了PPARγ拮抗剂GW9662[18]，治疗OSCC细胞。CCK-8分析显示，与对照组相比，GW9662治疗组的两种OSCC细胞系的存活率显著降低(图1a） 。随后，我们使用了之前获得的RNA-seq数据[8]评估使用或不使用GW9662处理的OSCC细胞中差异表达基因（DEG）和相关信号通路。因此，GW9662治疗组中多个铁凋亡相关基因的表达增加，铁凋亡相关通路丰富(图1b、 c）。然后，我们使用透射电子显微镜（TEM）观察了经或不经GW9662处理的OSCC细胞亚细胞结构的变化，发现细胞中线粒体的数量减少，GW9662治疗的细胞中线粒体嵴的数量减少甚至缺失(图1d） ●●●●。随后，为了排除其他程序性死亡的发生，我们使用凋亡检测试剂盒来验证GW9662治疗后OSCC细胞没有发生凋亡，结果与我们的预期一致(图1e） ●●●●。此外，我们发现GW9662处理后OSCC细胞的脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量增加(图1f） ●●●●。此外，GW9662处理后，OSCC细胞中亚铁离子的含量和比例增加(图1g） ●●●●。总之，这些结果强烈表明，抑制PPARγ可以促进OSCC细胞的铁凋亡。

3.2. PPARγ拮抗剂处理后OSCC细胞除铁凋亡外还发生了硫中毒

为了验证铁沉降的发生，我们同时使用GW9662和/或铁沉降抑制剂在荧光显微镜下观察活性氧物种（ROS）和脂质过氧化物（LPO）的形成。我们发现，在GW9662治疗后，OSCC细胞产生的ROS浓度显著增加，并且通过添加铁凋亡抑制剂而受到抑制(图2a） 。与这些发现一致，GW9662治疗后OSCC细胞产生的LPO水平显著增加，而在存在铁凋亡抑制剂的情况下，LPO浓度显著降低(图2b） 。罗格列酮作为PPARγ的高选择性激活剂，能有效恢复GW9662诱导的OSCC细胞死亡(补充图S1). 这一结果加强了我们的假设，即PPARγ是调控OSCC细胞死亡的关键靶点。令人惊讶的是，CCK-8分析显示，铁下垂抑制剂liproxstatin-1部分挽救了GW9662引起的细胞死亡(图2c、 d）。

为了揭示PPARγ抑制后铁凋亡抑制剂不完全挽救细胞死亡的原因，我们探索了一种新的细胞死亡类型二硫中毒；在葡萄糖饥饿的情况下，NADPH的供应不足，癌细胞中SLC7A11的高表达导致二硫化物的异常积累，导致细胞死亡[17]. 我们的转录组测序数据表明，GW9662治疗后SLC7A11的表达显著增加，PPARγ被报道与葡萄糖摄取和转运有关[19,20,21,22]. 基于上述发现，我们探讨了PPARγ被抑制时是否会发生二硫化物变性。首先，我们测量了48小时内OSCC细胞在完整培养基中的葡萄糖消耗量，发现PPARγ被抑制后葡萄糖消耗量下降(图2e） ●●●●。考虑到葡萄糖转运蛋白GLUT1的抑制剂可以有效抑制细胞葡萄糖摄取，从而在SLC7A11高表达的细胞中诱导二硫化物变性[15,17]，我们研究了GLUT1的蛋白表达，预计在PPARγ被抑制后，GLUT1表达会显著降低(图2f） ●●●●。接下来，我们用ELISA检测细胞中NADPH酶的含量，发现用PPARγ两种拮抗剂处理OSCC细胞后，NADPH的酶含量显著降低(图2g） ●●●●。值得注意的是，二硫代谢抑制剂TCEP还显著地挽救了GW9662或其他PPARγ受体拮抗剂T0070907引起的细胞死亡，当TCEP和前列腺素-1同时存在时，对细胞死亡的挽救作用最大(图2h、 我和图S2a，b). 肌动蛋白分子之间二硫键的形成导致蛋白质聚集或交联，从而形成大小不等的复合物。在非还原条件下，这会使它们在凝胶中的迁移速度多样化，从而形成宽的涂抹带。因此，利用先前学术调查的见解[17]，我们进行了非还原性蛋白质印迹分析，以确定肌动蛋白中是否存在二硫键。在UM1和CAL27细胞暴露于PPARγ拮抗剂24小时后，观察到肌动蛋白电泳迁移显著延迟(图2j和图S2c). 随后，在两种PPARγ拮抗剂治疗后，OSCC细胞的细胞骨架显著收缩(图2k和图S2d). 这些数据清楚地表明，在PPARγ抑制后，OSCC细胞同时发生铁沉积和二硫沉积。

3.3. HMOX1和SLC7A11通过抑制PPARγ上调，分别促进铁下降和二硫中毒

我们的转录组测序显示了多个铁凋亡相关基因的变化，其中HMOX1被强调。HMOX1在血红素降解中发挥关键作用，将血红蛋白分解为一氧化碳、游离铁和胆红素[23,24]. qPCR证实，经PPARγ抑制剂GW9662和T0070907处理的OSCC细胞中HMOX1的表达显著上调(图3a、 b）。PPARγ抑制后，HMOX1及其转录因子p-NRF2的表达显著增加，而降铁核心调节物谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达显著降低(图3c、 d）。此外，qPCR检测到，经GW9662或T0070907处理后，OSCC细胞中SLC7A11的mRNA表达水平上调(图3e、 f）。SLC7A11的蛋白表达水平与其mRNA水平一致(图3g、 h）。这些结果表明，PPARγ活性降低可以上调HMOX1和SLC7A11的表达，这两种表达分别促进了铁沉积和二硫沉积。

3.4. PPARγ活性降低可通过抑制铁凋亡和二硫中毒促进OSCC的抗癌作用

为了探讨PPARγ拮抗剂是否对口腔鳞癌有抗癌作用，我们在小鼠舌头上制备了原位口腔鳞癌，并用GW9662治疗小鼠(图4a） 。GW9662治疗组的肿瘤比对照组小，肿瘤体积显著减少(图4b、 c和图S3). 为了确定铁下垂和二硫中毒是否有助于GW9662治疗小鼠肿瘤模型的抗癌作用，通过IHC染色评估肿瘤组织中PPARγ、HMOX1、GPX4、p-NRF2和SLC7A11的表达水平。正如预期的那样，GW9662治疗的肿瘤组织中PPARγ和GPX4水平低于对照肿瘤。HMOX1、p-NRF2和SLC7A11在GW9662处理的肿瘤组织中的表达水平高于对照肿瘤组织(图4d、 e）。总之，降低PPARγ活性可以通过促进铁沉积和二硫沉积来抑制OSCC的生长和发育。

3.5. DC和CD8的数量⁺PPARγ活性降低后OSCC中T细胞增加

由于脱铁性贫血和其他细胞死亡模式有可能重塑肿瘤免疫微环境，它们可以显著影响肿瘤的发展[25,26]. 随后，我们在12天后使用单细胞质量细胞仪（CyTOF）分析了GW9662治疗组和对照组的整个OSCC队列中肿瘤组织内免疫细胞亚群的变化。使用包含42个免疫蛋白标记的小组(补充表S1)，我们描述了主要免疫细胞类型，并绘制了各种免疫检查点基因的复杂图景。使用单细胞免疫图谱，我们检查了健康和受感染的OSCC组织，并确定了几个簇，如CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞、常规树突状细胞（cDC）、自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞。这是通过在二维（2D）t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图上显示特征良好的细胞标记来实现的。(图5a、 b）。我们发现GW9662治疗的肿瘤组织中CD11c和CD8a的表达明显高于对照肿瘤组织(图5c） 以及cDC和CD8的数量⁺GW9662治疗的肿瘤组织中的T细胞明显多于对照组织(图5d、 e）。通过多重免疫组织化学（mIHC），我们证实了cDC和CD8的数量⁺经PPARγ抑制剂治疗的OSCC肿瘤中的T细胞明显大于对照组(图5f） ●●●●。上述结果表明，在OSCC中PPARγ被抑制后，肿瘤细胞可能发生铁沉降和二硫中毒，从而促进cDC和CD8的募集⁺T细胞抑制OSCC肿瘤的发生。

4.讨论

口腔鳞癌是头颈部鳞状细胞癌的主要类型，恶性程度高。尽管手术切除辅以放疗、化疗和靶向治疗是OSCC的标准治疗方法，但5年总生存率仍相当低。主要原因是OSCC微环境的复杂性和不确定性以及缺乏可靠的治疗靶点。因此，迫切需要发现治疗口腔鳞癌的有价值靶点。以往对PPARγ的研究主要集中在PPARγ在调节脂质代谢、糖代谢等方面的作用[27,28]. 随着研究的深入，PPARγ在肿瘤中的作用越来越明显。然而，其在肿瘤中的作用仍存在争议。在这里，我们发现抑制OSCC中的PPARγ可以通过上调HMOX1和通过上调SLC7A11以及随后补充额外的cDC和CD8来促进二硫中毒，从而促进铁凋亡⁺T细胞抑制肿瘤发展。

GW9662是一种有效的PPARγ拮抗剂，通过与受体的配体结合域共价结合发挥作用，有效阻断其他激动剂的活性，而不是诱导大规模的受体构象重塑。GW9662的结合并没有显著改变PPARγ与辅活化子或辅抑制剂之间的相互作用平衡，因此表现出转录中性效应。T0070907是GW9662的类似物，与之不同的是碳氮替代。当与PPARγ结合时，T0070907表现出两种长寿命构象状态，其中一种类似于GW9662的结合状态[29,30]. 这些变化可能不会直接抑制所有受体功能，但会通过影响转录程序与特定协同调节因子的相互作用，微妙地调整转录程序，从而对某些基因表达产生转录中性或选择性影响。这种构象的微调可以保持或改变受体的部分活性，影响下游信号通路的精细调节。相反，使用RNA干扰技术（如shRNA或siRNA）沉默PPARγ直接减少细胞中该受体的总量。这种策略不仅可以阻止激动剂的激活作用，还可以全面影响所有PPARγ依赖的生物过程，包括那些仍然可以维持在拮抗状态的基本活动。PPARγ在生理和病理过程中起着至关重要的作用，其激活或抑制可深刻影响各种肿瘤的发生和发展。鉴于PPARγ在调节多种细胞功能中的中心位置，其活性状态的微小变化可能会导致生理或病理效应的显著差异。结构改变和整体表达减少之间的区别表明，在设计针对PPARγ的治疗时，我们需要仔细考虑干预策略的特异性和潜在的系统性影响。

目前，在各种癌症研究中已发现PPARγ受体拮抗剂可使PPARγ失活以调节肿瘤的发生和发展[31,32,33]. 先前的研究报告称，PPARγ抑制剂可能导致多种疾病中的铁下垂[34,35]. 我们还发现PPARγ抑制剂GW9662和T0070907促进了OSCC细胞的铁凋亡，导致细胞死亡。然而，脱铁抑制剂不能完全挽救PPARγ抑制剂引起的细胞死亡。我们发现，抑制PPARγ不仅导致OSCC细胞的铁凋亡，而且还导致二硫中毒。铁下垂和二硫中毒的鉴定和表征不仅加强了对细胞内稳态的基本理解，而且为各种疾病的治疗，尤其是癌症的治疗提供了重要的见解。SLC7A11不仅是脱铁性贫血的有效靶点，而且被认为是一种促进癌症治疗的适应性抵抗屏障分子，它在二硫化物血症中也发挥着至关重要的调节作用。然而，目前的研究通常将二硫中毒和铁下垂视为不同的过程，研究人员发现二硫中毒实际上排除了铁下垂的发生[17]. 目前尚不清楚它们之间的关系是相互排斥还是可能共存。值得注意的是，在我们的研究中，抑制OSCC中的PPARγ可以同时诱导铁凋亡和二硫中毒。在这里，我们首次提出靶向PPARγ可以连接这两条死亡途径以抑制肿瘤细胞增殖。

细胞死亡会导致细胞内免疫原物质的释放。死亡细胞释放的信号分子可以激活免疫细胞表面的相关受体，促使这些细胞进入更活跃的状态，增强其对肿瘤细胞的攻击性。刺激肿瘤细胞中的免疫原性细胞死亡不仅可以直接杀死肿瘤细胞，还可以进一步消除残留或转移病灶，防止肿瘤复发[36]. 多种细胞死亡途径的组合可以产生协同效应，包括减少肿瘤相关的抗凋亡信号，降低免疫抑制因子的水平，以及增强对肿瘤细胞的杀伤效果。这种综合方法可以通过同时针对多个脆弱性来避免细胞逃逸机制，从而提高治疗的整体效果。铁下垂可以改变肿瘤微环境，例如通过分泌炎症因子来激活免疫相关细胞，如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，或通过产生代谢分子，如磷脂过氧化物，从而影响免疫细胞[37]. 虽然目前对二硫中毒的研究有限，但一些研究人员发现与二硫中毒相关的基因与各种免疫细胞有关。它在影响肿瘤微环境方面具有巨大潜力[38,39]. 我们的数据证实，抑制OSCC中的PPARγ可同时诱导铁凋亡和二硫中毒。这导致招募更多的cDC和CD8⁺T细胞向肿瘤微环境迁移，有效抑制肿瘤进展。针对PPARγ抑制诱导的肿瘤细胞死亡，结合免疫治疗可能在OSCC或其他癌症的治疗中产生良好的结果。

在这项研究中，我们观察到经PPARγ抑制剂治疗后，OSCC细胞的体外生存能力显著降低。这是通过上调HMOX1促进铁凋亡，同时上调SLC7A11诱导二硫中毒来实现的。在体外OSCC模型中使用PPARγ抑制剂治疗导致cDC和CD8的数量和比例大幅增加⁺肿瘤组织中的T细胞，导致肿瘤生长显著抑制。根据这些发现，PPARγ在铁下垂和二硫中毒中的作用可能在未来的研究中探索，以改进OSCC和其他疾病的临床治疗。