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为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同?
蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲,蛋白质越小,在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响,因此,观察到的实际条带大小可能与预测的不同。常见的因素包括:
1翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白质大小。
2. 翻译后切割 - 例如,许多蛋白先被合成为前蛋白,然后被切割产生活性形式,例如前半胱天冬酶。
3. 剪接变体和异形体 - 可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。
4. 相对电荷-氨基酸(工作
应该上样多少样品?
细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物:每孔上样 20至 30微克是的
这可能需要根据测试样品中的蛋白质表达水平进行一些优化。纯化蛋白(重组或内源):上样 10至 100纳克蛋白。
检测重组蛋白时难以获得条带。为什么?
抗体检测重组蛋白质时,存在难以克服的困难,有必要加以考虑。我们推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。
同时,如果重组蛋白带有标签,标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的 C类或 N个末端,以降低这种情况发生的可能性(而不是位于蛋白质的阅读框中间)。
中国人
样品需要还原和变性吗?
我们推荐查看数据表获取更多详情。阿布卡姆抗体将仅在还原和变性条件下进行测试,除非数据表中另有说明,我们推荐使用还原和变性条件。
在一些情况下,阿布卡姆抗体也将在非还原条件下进行测试,在这种情况下,我们将在数据表上详细说明(参见应用备注部分或Abreviews公司)。如果我们有表明抗体在某种或其它条件下无效的数据,数据表会加以说明。
牛奶和 英国标准协会封闭有区别吗?
抗体可能对封闭剂敏感,我们推荐查看数据表确定是否有数据表明抗体在 英国标准协会还是牛奶中效果更好。如果有,阿布卡姆将在数据表中加以说明。
一般来讲,英国标准协会会产生更清晰的结果,因为 英国标准协会含有较少的蛋白,因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此,有些抗体在牛奶中的效果更好,因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白,能封闭更多不同类型的蛋白质。
能否用室温下孵育一抗 1小时代替 4 ℃ 为什么
蛋白质印迹中一抗孵育时间需要最终用户进行优化。一般来讲,4 ℃ 过夜孵育将产生更高效、更特异的染色。但许多抗体在室温下孵育 1或 2小时效果也非常好。
浏览量(参见可用的Abreviews、出版物和图像数据)。
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