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目录
裂解缓冲液
不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同,其中含有十二烷基硫酸钠 (SDS)和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力,因此最有可能获得最高得率。
选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性样品,抗体数据表会加以说明,这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂 (NP-40、Triton®声波风廓线仪X-100)的裂解缓冲液。
蛋白质位置及相应裂解缓冲液的选择
蛋白质位置
推荐缓冲液
全细胞
NP-40型
细胞质(可溶)
三氯化氢
细胞质(细胞骨架结合)
Tris-Triton®声波风廓线仪
膜结合
NP-40型或 RIPA公司
细胞核
里帕或约定*
路线
里帕或采用线粒体结构组分实验方案*
*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物。这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用。请参阅我们的亚细胞组分分离实验方案。
裂解缓冲液配方:
NP-40型日本
这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来,那么利用 里帕缓冲液更适合,因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。
里帕日本(放射免疫沉淀分析缓冲液)
*可制备成 10% 的母液,避光保存。
里帕缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白,而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含 NP-40型或 Triton®声波风廓线仪X-100的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用,因此可能会给免疫沉淀分析和下拉实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用,或需最大限度避免蛋白质变性,应使用不含离子去垢剂(例如 SDS)的缓冲液,理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂(例如 Triton®声波风廓线仪X-100)
使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作,通常利用 杜恩斯匀特里斯缓冲液即可,但如前文所述,要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白,必须使用含有去垢剂的缓冲液。
三氯化氢日本
Tris-Triton®声波风廓线仪日本(细胞骨架蛋白)
以上 4种缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周,分装之后可在 -20 ℃ 下储存长达 1年。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂
一种4 ℃ 下,并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂,能够显著减缓这些反应。
许多供应商都提供即用型抑制剂混合物,但您也可以自行制备抑制剂混合物。
抑制剂
可抑制的蛋白酶/磷酸酶
在裂解缓冲液中的最终浓度
母液(储存于 -20 ℃)
抑肽酶
胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶
2微克/毫升
用水稀释至 10毫克/毫升不同意
亮抑酶肽
溶酶体蛋白酶
5–10微克/毫升
用水稀释。不得反复使用融化的分装试样。
胃酶抑素A类
天冬氨酸蛋白酶
1微克/毫升
用甲醇稀释至 1毫米
PMSF公司
丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶
1百万
用乙醇稀释。可反复使用同一分装试样。
乙二胺四乙酸
需要 镁2+和 锰2+的金属蛋白酶
5毫米
用蒸馏水稀释至 0.5米将 酸碱度调节至 8.0。
EGTA公司
需要 钙2+的金属蛋白酶
氟化钠
丝氨酸/苏氨酸磷酸酶
5-10毫微米
用水稀释。解冻之后不得反复使用。
原钒酸钠
酪氨酸磷酸酶
制备原钒酸钠
所有步骤均在通风橱中进行。
1. 用双蒸水制备 100毫摩尔原钒酸钠溶液。
2. 用 盐酸将 酸碱度调节至 9.0。
3. 煮沸至无色。稍微盖住溶液,尽量减小由蒸发造成的体积变化。
4. 冷却至室温。
5. 再次将 酸碱度完9.0。
6. 煮沸至无色。
7. 重复以上循环,直到煮沸并冷却溶液之后的 酸碱度保持 9.0
8. 用水补至初始体积。
9. 分装之后保存于 -20 ℃。如果样品变黄,丢弃样品。
制备细胞培养物裂解物
1. 将细胞培养皿置于冰上,用预冷的 美国公共广播电视公司洗涤细胞。
2. 吸出 PBS、中国(每 107细胞/100毫米培养皿/150厘米2培养瓶加入 1毫升每 5×106细胞/60毫米培养皿/75厘米2培养瓶加入 0.5毫升)
3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞,然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。或者,也可先用胰蛋白酶处理细胞并用 美国公共广播电视公司涤、微、胞
4. 在 4 ℃ 下以恒定速率搅拌 30分钟。
5. 4 ℃ 下在微型离心机中离心。您可能需要根据不同的细胞类型调整离心力和离心时间;建议以 12000转/分离心 20分钟,但具体设置须根据您的实验确定()
6. 轻轻地从离心机中取出离心管并置于冰上,吸取上清液并转移至放置在冰上的新离心管中,弃去沉淀。
制备组织裂解物
1. 用干净的工具切取目标组织,此操作最好在冰上进行,并且应尽快完成,以防止样品被蛋白酶降解。
2. 将组织置于圆底微量离心管或 埃彭多夫管中,并浸入液氮中进行速冻。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用,或放置在冰上直接进行匀浆。
3. 对于约 5毫克的组组,向离心管中快速加入约 300微升预测2x 300微升裂解缓冲液冲洗刀片两次,然后在 4 ℃ 下持续搅拌 2小时(例如,置于冰箱中的回旋振荡器上)。裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。蛋白质提取物不应过度稀释,避免蛋白质损失和凝胶上样体积过大。我们推荐的最低浓度为 0.1毫克/毫升最佳浓度为 1–5毫克/毫升
4. 使用微量离心机在 4 ℃ 下以 12000转/分离心 20路线图
确定蛋白质浓度
1. 进行 布拉德福德分析、劳里分析或二喹啉甲酸 (BCA)分析。通常使用牛血清蛋白 (牛血清白蛋白)工作
2. 确定每个样品的浓度之后,可将其冻存于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 以备后续使用,或以备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。
制备用于凝胶上样的样品
变性、还原样品
抗体通常识别目标蛋白的一小部分(被称为“表位”),这一结构域可能位于蛋白质的三维结构内。要使抗体能够接近该部分,必须使蛋白质展开,即使其变性。
要使蛋白质变性,加入含阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS)的上样缓冲液,并在 95–100℃下煮沸混合物 5分钟。也可在 70 ℃ 下加热混合物 5–10 分钟,这种处理方式适用于多次跨膜蛋白研究。煮沸处理使膜蛋白质聚集,而蛋白质聚集体无法有效进入凝胶中。
标准的上样缓冲液被称为 2×莱姆利日本(莱姆利英国,1970年。噬菌体T4头部组装过程中结构蛋白的裂解。《自然》,227680-5)也可将其制备成 4× 和 6× 缓冲液,以尽量降低样品的稀释度。2倍缓冲液应按照 1:1 的比例与样品混合。
2×莱姆利缓冲液配方
用 SDS公司处理蛋白质时,所有蛋白质都附着在 SDS公司阴离子上并因此带负电荷。SDS公司和蛋白质以 1.4:1 的质量比特异性地结合,因此 SDS公司赋予多肽的负电荷与其长度成正比。变性的多肽变为带负电荷的“棒”、“路线”、“路线”
SDS公司的纯度对于实现高质量的蛋白质分离至关重要:如果整块凝胶的蛋白质染色背景中的蛋白质条带模糊不清或只能勉强看清,表明所用的 SDS公司过于陈旧或质量不佳。向缓冲液中加入 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇能减少二硫键,这对于根据分子大小进行的蛋白质分离十分必要。
向上样缓冲液中加入甘油可增加待上样样品的密度,从而将样品维持在样品孔底部,避免样品外溢和凝胶中上样不均匀。
为了使蛋白质的迁移可见,通常要向上样缓冲液中加入小分子阴离子染料(例如溴酚蓝)。由于染料为阴离子且分子较小,它的迁移速度比混合物中所有待分离的组分都快,因此提供了可监测分离进程的迁移前沿。
处理蛋白质样品的过程中,加热步骤前后都应涡旋混合样品,以使蛋白质的分辨率达到最佳。
天然、非还原样品
某些抗体可识别由不连续氨基酸组成的表位。虽然组成表位的氨基酸在一级序列中相互分离,但它们在蛋白质的折叠三维结构中相互靠近,抗体只能识别折叠结构表面上的表位。
在这种情况下,必须在非变性条件下进行蛋白质印迹,数据表的应用部分将对此加以说明。一般来讲,非变性条件即不向样品和迁移缓冲液中加入 SDS、并且不加热样品。
某些抗体只能识别非还原形式的蛋白质(尤其是半胱氨酸残基),在这种情况下,上样缓冲液和迁移缓冲液中不应添加 β-巯DTT公司
蛋白质状态
凝胶条件
上样缓冲液
迁移缓冲液
还原、变性
还原且变性
添加 2-巯DTT公司和 SDS公司
添加 SDS公司
还原、天然
还原且天然
添加 2-巯基乙醇或 DTT公司和 SDS公司
不添加 SDS公司
氧化、变性
非还原且变性
不添加 2-巯基乙醇或 DTT公司和 SDS公司
氧化、天然
非还原且天然
不添加 2-巯DTT公司和 SDS公司
一般原则:除非数据表特别指出,蛋白质都为还原且变性状态。