1.简介
葡聚糖调解过多的短暂的、特定的、非酶的生物接触,有时被称为“识别事件”。例如,白细胞沿着小静脉内内皮细胞滚动粘附,是由弱聚糖-蛋白质相互作用控制的,这种相互作用允许局部白细胞活化,并在外渗之前形成更紧密的相互作用(诺曼等。, 2000). 先天免疫中的自我/非自我区别可能触发不可逆免疫反应,提供了瞬态聚糖-蛋白质复合物(Blaum等。, 2015; 汉森等。, 2016). 细胞结合聚糖通常参与细胞-细胞通信,也参与病毒与其靶细胞之间的识别,有时在其他高亲和力受体发挥作用之前。从生物物理的角度来看,大多数聚糖-蛋白质相互作用的特点是亲和力低(K(K)d日值>1µM(M))由芳香族氨基酸(通常是色氨酸)与氢键(包括结构水分子)之间的疏水相互作用产生。这种微弱的,因此经常是短暂的相互作用不容易用结构生物学的方法来研究。饱和传递差核磁共振(STD-NMR)实验(Mayer&Meyer,1999), 2001)然而,在这种瞬态相互作用范围内工作得特别好。唯一的要求是调查中的相互作用可以近似在体外具有大的类蛋白实体(高达百万道尔顿或更高)和数百道尔顿至数千道尔顿范围内的小寡糖(或其他小配体)。例如,类蛋白相互作用伙伴可以是膜结合受体(Claasen等。, 2005),一种病毒(贝尼等。, 2003)或整个细胞(Claasen等。, 2005). 通过STD-NMR研究了大量与聚糖结合相关的蛋白质。该清单包括与组织血型抗原(Heggelund)结合的细菌毒素等。, 2012; 瓦西里等。, 2014)、糖基转移酶(安古洛等。, 2006; 贾亚拉克什米等。, 2004)抗聚糖抗原抗体(Enríquez-Navas等。, 2015; 霍利斯顿等。, 2007, 2009; 茨韦特科夫等。, 2012)、半乳糖凝集素(Kövér等。, 2010; 米勒等。, 2011; 永业等。, 2012)、植物糖苷酶(Kuntothom等。, 2010),人类补体因子H(Blaum等。, 2015, 2016)以及先天免疫受体DC-SIGN和langerin(Mari等。, 2005; 穆尼奥斯·加西亚等。, 2015; 波尔科拉布等。, 2017)等等。STD-NMR实验在研究多糖受体病毒(如多瘤病毒(见下文)、呼肠孤病毒(Reiss等。, 2012)流感病毒(Haselhorst等。, 2008; 瓦西里等。, 2014)、轮状病毒(弗莱明等。, 2014)、鼻病毒(贝尼等。, 2003),诺如病毒(Rademacher&Peters,2008)和腺病毒(Lenman等。, 2018). 在这篇文章中,我们主要回顾了我们自己在多瘤病毒衣壳蛋白方面的工作,以说明结晶学和STD-NMR(Blaum)之间的协同作用等。, 2015; Neu公司等。, 2012, 2013).
2.通过“基于配体的”核磁共振探测相互作用
核磁共振波谱可以观察水溶液中生物分子及其相互作用和动力学。与其他形式的光谱学(如UV–Vis)一样,NMR使用电磁辐射来诱导和探测分子中不同能级之间的跃迁。与…对比光学光谱学技术,核磁共振中诱导的跃迁总能量较低,这就是为什么使用射频脉冲的原因。顾名思义,核磁共振依赖于原子核的性质,即它们的角动量(“自旋”)和耦合磁矩。核磁共振能级代表在强外场影响下的不同核自旋态,即永久核磁共振磁体。在核磁共振波谱仪的检测装置中,当原子核共振频率(核磁共振术语中的化学位移)与射频脉冲相匹配时,会记录微小电流,并引发能级跃迁。由于共振频率极易受化学环境变化的影响,因此可用于提取结构信息并表征导致所谓的结合事件化学变换`扰动',即氨基酸的化学位移的变化,这些氨基酸的原子环境因配体结合而改变。
大量研究涉及蛋白质受体与配体的相互作用,配体比受体蛋白质小得多(分子量<1–2 kDa)。一般来说,有两种核磁共振方法可以产生关于蛋白质-配体相互作用的信息。一种方法是基于蛋白质并监测蛋白质化学变换配体滴定的扰动(Williamson,2013). 这种方法需要蛋白质受体的稳定同位素标记(通常15N) 以及二维核磁共振谱的记录,并且受到蛋白质大小的限制。而配体本身在化学变换扰动实验,即它的化学位移没有被记录,它与15N标记蛋白以残留物特异性的形式显示化学变换随后用于描述配体结合位点和/或变构结合效应的变化。另一方面,STD-NMR实验属于“基于配体的”NMR实验,其中使用小分子配体而不是蛋白质作为复合物形成的探针(Meyer和Peters,2003). 在基于配体的核磁共振实验中,蛋白质仍然“不可见”,只观察到配体的化学位移。作为配体检测的结果,基于蛋白质的NMR的许多缺点得以避免:使用STD-NMR,大分子量蛋白质不是问题,不需要同位素标记,蛋白质浓度通常在低摩尔范围内。由于小配体的核数有限,其核磁共振谱包含的核数很少光谱重叠,无处不在的共鸣1可以使用H核(核磁共振术语中的质子)。因此,STD-NMR实验可以在任何NMR光谱仪上进行,通常只需要测量时间的一小部分化学变换扰动实验,以及未标记的蛋白质。在有利的情况下,在不到1小时的时间内即可获得高质量的光谱。另一方面,STD-NMR不能提供有关蛋白质的任何直接结构信息。相反,完全从配体的角度观察到蛋白质与配体的相互作用。
4.多瘤病毒展示
多瘤病毒(PyV)是一类小型双链DNA病毒,可在哺乳动物、鸟类和鱼类中引起轻微到致命的疾病(包括癌症)。大多数PyV与唾液酸结合聚糖在宿主细胞质膜上呈现为鞘糖脂头部基团或聚糖分支糖蛋白。在一些PyV中聚糖作为唯一的受体,而在其他受体中,已经确定了其他受体。最著名的PyV之一是猿猴病毒40(SV40),早期脊髓灰质炎活疫苗的污染物,由恒河猴肾细胞产生。幸运的是,SV40与人类疾病无关(Sweet&Hilleman,1960; Strickler公司等。, 1998). SV40受体是一种小的唾液酸化糖脂,神经节苷脂GM1(Tsai等。, 2003),其结合直接引发膜弯曲和内陷,并最终引发病毒的细胞摄取(Ewers&Schelhaas,2012). 每个PyV衣壳主要由360个主要衣壳蛋白VP1拷贝构成,该蛋白采用所谓的胶状卷曲折叠(Liddington等。, 1991; Stehle&Harrison,1997年; 施特勒等。, 1996)衣壳内部覆盖着不同数量的小衣壳蛋白。五个VP1单体组装形成五聚体VP1 capsomer,其中72个组成二十面体衣壳。在大多数已知结构的PyV中,五个唾液酸结合位点围绕VP1五聚体的中心五倍轴对称排列(图2). 尽管VP1五聚体的整体结构保持不变,唾液酸结合位点在三个暴露环之间的位置也经常保持不变,但结合位点的结构、环中的氨基酸残基和聚糖特异性在不同的PyV(Neu等。, 2011, 2012; 施特勒等。, 1994; 斯特罗赫等。, 2015). 虽然非还原末端唾液酸(Neu5Ac)“帽状物”是迄今为止大多数PyV的主要接触物,但Neu5Aic配位以外的一些额外相互作用赋予了不同的聚糖特异性,反映在不同的聚糖微阵列图谱中,转导实验中的血凝模式和受体使用(Neu等。, 2008, 2012, 2013). 而SV40结合支链、单唾液酸化的GM1五糖(图2)人类PyVs BKPyV(可导致肾脏移植患者肾病)和默克尔细胞PyV(MCPyV,默克尔细胞癌的病原体)不与GM1结合(埃里克森等。, 2009; 低等。, 2006). 相反,BKPyV特别参与α2–8个二乙酰化神经节苷脂,例如GD3,以及包含线性GD3四糖作为分支聚糖结构的一部分的更复杂的神经节苷酯(例如GD1b和GT1b聚糖;见图2; 低等。, 2006; Neu公司等。, 2013). 迄今为止,MCPyV的功能性受体尚不清楚,但已经证明MCPyV-VP1五聚体结合GT1b神经节苷脂和较短的线性唾液酸化物聚糖包含α2–3链接Neu5Ac(埃里克森等。, 2009; Neu公司等。, 2012).
| 图2 多瘤病毒VP1五聚体的结构,以及文本中使用的典型聚糖结合位点和神经节苷脂寡糖的位置。左:SV40 VP1五聚体(灰色卡通表示),五个GM1聚糖结合位点中有三个被占领(Neu等。, 2008). GM1使用3D-SNFG(聚糖图形表示的符号命名法)表示法显示。右、顶行、左至右:3D-SNFG中的GM1聚糖、3D-SNFG图标和SNFG表示。右、下一行、左至右:b系列神经节苷脂GD3、GD1b和GT1b低聚糖在SNFG表示中。这个绘图聚糖-SNFG服务器(Cheng等。, 2017)和3个D-SNFG公司脚本(Thieker等。, 2016)对于供应商管理部(汉弗莱等。, 1996)用于生成SNFG类型表示。 |
PyV家族衣壳-聚糖相互作用的结晶分析相对简单,因为N端和C端截短的VP1结构可以在大肠杆菌并形成VP1五聚体,无法组装成完整的衣壳,重量约为150 kDa(Stehle&Harrison,1997; 图2). 虽然由于晶体接触,VP1五聚体中的一些暴露的聚糖结合位点可能无法接近,但VP1五聚合体中的五个相同位点仍然允许通过结晶学测定VP1-聚糖复合物。为了确定不同多瘤病毒之间聚糖特异性的差异,我们对一些PyV VP1–glyan复合物进行了X射线结晶学和STD-NMR光谱分析,阐明了该病毒类(Neu等。, 2011, 2012, 2013; Ströh&Stehle,2014年; 斯特罗赫等。, 2015).
7.将结构生物学扩展到大型复杂系统
迄今为止,结构生物学中高分辨率技术的一个主要缺点是需要高纯度和均匀的样品。对于多域蛋白质,截短的结构体通常更容易结晶,但这种结构体的发现最好在全蛋白的背景下进行仔细研究。多组分系统也是如此,按照“分而治之”的策略,它们通常被分割成更小的部分用于晶体研究。然而,将一种蛋白质从其生物背景中剔除可能会导致其功能失活。这对膜蛋白来说尤其困难,膜蛋白通常在结构研究或重新整合到脂质体中之前溶解在洗涤剂中。在这两种情况下,STD-NMR都可以填补实验空白,因为NMR样品中的“蛋白质”部分实际上可能是一个复杂、不均匀、含蛋白质的实体,它本身会抵制高分辨率技术。使用完整的病毒或带有聚糖受体的病毒样颗粒(Benie等。, 2003; 哈塞尔霍斯特等。, 2008; Rademacher&Peters,2008年). 我们利用该技术筛选了一种具有19个不同柔韧性的连接子的多糖基化20域蛋白中潜在的低聚糖配体,并将结果应用于两域结构体的结晶(Blaum等。, 2015). 事实上,可以使用活的哺乳动物细胞作为选择性激发成分(Claasen)来记录STD-NMR光谱等。, 2005; 玛丽等。, 2005; 瓦西里等。, 2018). 未经修饰的细胞和过度表达特定膜蛋白的细胞(或者相反,含有一个蛋白的敲除)的组合可以产生小分子与膜包埋蛋白(Vasile)结合的结论性结果等。, 2018). 例如,采用类似的策略评估脂质体整合整合素的功能完整性:记录此类脂质体和整合素结合肽的STD-NMR谱,并与天然血小板(Claasen等。, 2005). 或者,所研究系统的复杂性也可能源于“缓冲区”,而不是选择性激发的实体。例如,检测和表位抗GM1抗体的特性通过经证实,在补充GM1聚糖后,直接从格林-巴利综合征和费希尔综合征患者的血清中获得STD-NMR(霍利斯顿等。, 2007). 在这样的样品复杂性水平上,可以使用一个额外但简单的“过滤器”:虽然激发可能仍然是选择性的,只要没有激发配体共振(可以用只包含配体的单独样品进行检查),激发可能对单个蛋白质不具有选择性,由此产生的STD-NMR差谱可能包含来自与研究中配体或溶液中其他小分子的额外相互作用的信号。然而,这个问题可以简单地通过减去使用对照获得的STD-NMR差异光谱来解决,例如,没有过表达的感兴趣的膜结合蛋白的细胞悬浮液或没有添加所述配体的血清光谱,从而产生所谓的饱和转移双差(STDD;Blaum等。, 2015; 克拉森等。, 2005). 或者,可以使用一种完全不以天然形式表达所研究膜蛋白的细胞类型。例如,在293T细胞中表达的人和禽流感病毒株血凝素可以根据流感病毒受体部分Neu5Ac进行研究α2–6加仑β1–4GlcNAc,无任何细胞背景(Vasile等。, 2018). 不用说,STD-NMR实验也可以用于评估特定蛋白质批次的质量脂质体当在与表征良好的参考批次相同的条件下记录光谱时,对STD强度进行比较。与任何配体结合分析的质量控制类似,给定制剂中折叠/活性蛋白的百分比可以通过STD-NMR(Da Veiga等。, 2016).
9.STD-NMR实验逐步解释
从概念上讲,从更物理的角度来看,STD-NMR实验期间发生的事情可以分为不同的步骤,如下所述。
9.1. 蛋白质的选择性激发和饱和
在实验开始时,使用级联高斯形射频脉冲进行选择性激发,最长持续数秒(饱和时间)。这种脉冲级联的应用会导致饱和(也称为预饱和),反映了自旋系统的一种状态,在这种状态下,由于弛豫过程不能再超过能量的流入,不再吸收更多的能量。本质上,在这种状态下,自旋布居是均衡的,各个跃迁不再可观察到。STD-NMR中的选择性饱和是通过将射频辐射调节到仅由受体蛋白共振填充的光谱窗口来实现的。蛋白质选择性饱和的典型光谱窗口在1-4 p.p.m.范围内(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和苏氨酸中的蛋白质甲基)或6-8的芳香族和NH区域p.p.m.(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸侧链),假设这些光谱区域中至少有一个没有配体共振(图1b条).
9.3. 差异频谱
实际上,STD-NMR实验包括两个以成对方式记录的略有不同的NMR谱:所谓的共振谱,其中选择性激发频率设置在上述蛋白质的甲基或芳香共振上,以及所谓的非共振谱,选择频率远远超出两个分量的光谱窗口。因此,在非共振谱中,有效地不实现预饱和(但射频脉冲的小样本加热效应与非共振谱的小样本热效应相同),从而产生混合物的普通无偏核磁共振谱。如果蛋白质非常大(例如一个完整的病毒),仅仅因为过度的谱线加宽,在这个谱中没有观察到蛋白质共振;因此,非共振光谱可能看起来很像无偏的自由配体光谱。为了进行分析,从非共振谱中减去非共振谱。此过程的原因是饱和传递效应通常很小,因此更容易被视为差谱。非共振谱可作为STD效应量化的参考通过所谓的振幅因子(Mayer&Meyer,2001).
10.如何进行STD-NMR光谱:实际考虑、建议和结论
对于一个开始使用STD-NMR波谱来研究蛋白质-碳水化合物复合物的结构生物学家来说,有一些挑战和考虑。首先,当然,结构生物学家通常手头没有核磁共振仪器或不知道如何操作它。这实际上是一个相当小的障碍,因为任何(合成)化学部门的分析部分都可以使用仪器进行实验,并且通常具有与其操作关联的服务。信噪比和光谱分辨率随着场强的增加而增加,但如果没有更高的场强,则可以使用400–500 MHz仪器。用于操作核磁共振光谱仪的软件附带一组标准实验(射频脉冲序列),至少对于Bruker仪器而言,该组包含STD实验。
在使用蛋白质-碳水化合物相互作用的标准脉冲序列之前,需要考虑的一个重要方面是水分抑制。作为迄今为止任何液体生物NMR样品中浓度最高的组分,水共振在生物NMR应用和相应的脉冲序列中通常被抑制。使用时碳水化合物,这一事实需要仔细考虑:水抑制技术对物质没有选择性;相反,它们抑制了水质子共振频率范围。碳水化合物,不幸的是,往往含有在水质子频率附近共振的质子,尤其是异聚质子(图4和5). 当使用水抑制时,这些信号也会被抑制,至少部分地与水共振一起被抑制,并从频谱中消失或被人为降低。这个问题可以通过使用高纯度的氘化水而不是氢来解决2O(5–10%D)2出于技术原因,O也用于水基核磁共振样品中),并从脉冲序列中去除水抑制方案。因此,碳水化合物和蛋白质需要溶解或缓冲交换成基于高纯度D的缓冲溶液2O.缓冲液交换在旋转浓缩器或旋转柱中最可行,因为透析可能会使用太多昂贵的D2O。
另一个重要问题是缓冲液的组成:大多数生物缓冲物质含有与低聚糖(和其他小分子配体)共振重叠的质子共振,并且在配体上存在大量过剩。这可能导致STD-NMR差分光谱中重要配体共振的位置出现丑陋的减法伪影。同样,最好通过选择其他化学物质作为缓冲液来克服这一障碍,即那些不含脂肪族质子(核磁共振波谱学家最喜欢的缓冲液是磷酸盐)或定量氘化的化学物质,如HEPES(d18)或Tris(d11)比磷酸盐更贵。综上所述,结构糖生物学实验室转入STD-NMR的初始费用是非常可控的。虽然高纯度D2O和氘化缓冲液价格昂贵,核磁共振管(内径3mm的MATCH管)和磷酸盐价格低廉。
最后,但并非最不重要的是,了解STD-NMR谱中的共振是什么很重要。各种分配低聚糖在数据库和文献中也可以找到其他小分子,但当缓冲条件和温度发生变化时应小心,因为质子共振对这种变化非常敏感。如果你找不到你喜欢的配体的共振分配,你可能需要向你喜欢的核磁共振波谱师寻求帮助。通常,对于小配体,会有一系列一维光谱,例如1H TOCSY和1H COSY光谱如图4所示足够了,每一个都不到一分钟就可以录制。如果13由于1H尺寸和13C标记是不可能的,1米M(M)需要记录配体样品和几个小时的测量时间1H、,13C HSQC或HMBC光谱13C核(1.1%)。
不管你正在研究的系统是什么,也不管性病实验是否适用于特定的系统,实验还有另一个有用的方面:你有没有想过你的宝贵聚糖或其他昂贵的配体是它的标签上写的?或者它可能有多纯净?核磁共振会告诉你。
致谢
BSB非常感谢位于图宾根的马克斯·普朗克发育生物学研究所NMR设施的Vincent Truffault博士的支持。
资金信息
以下资金已获认可:德国联邦基金会(授予Bärbel Blaum第1294/3-1号;授予Thilo Stehle第STE 1463/7-1号;向Thomas Peters授予Pe494/12-1号和Pe494/11-1号;授予Ursula Neu第NE 2076/1-1号);美国国立卫生研究院(授予Thilo Stehle编号NIH-P01 NS 065719)。
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