2.1. 蛋白质表达和纯化

人类MST1 SARAH结构域（残基432-480）和人类RASSF5 SARAH区域（残基366-418）在大肠杆菌作为谷胱甘肽的菌株BL21S公司-转移酶（GST）融合蛋白并如前所述纯化（Hwang等。, 2007). 硒代蛋氨酸（SeMet）标记的人类MST1 SARAH结构域在25°C下培养过夜的蛋氨酸-辅营养素B834（DE3）细胞（Novagen）中表达。为了制备MST1–RASSF5 SARAH异二聚体样品，将纯化的MST1 SARAH结构域和RASSF5SARAH区域以1:2摩尔比混合，并通过凝胶过滤从混合物中分离出MST1-RASSF5-SARAH异源二聚体色谱法（Superdex 75）用25 m平衡M（M）4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH 7.0，100 mM（M）氯化钠，2米M（M）二硫苏糖醇（DTT）。收集含有MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的组分，并浓缩至20 mg ml⁻¹用于单波长反常衍射（SAD）实验的硒代亚砜蛋白也如上所述制备。人类MST2 SARAH结构域（残基436-484）表达于大肠杆菌菌株BL21是一种GST融合蛋白，如前所述进行纯化（Hwang等。, 2010). 将人MST2 SARAH同源二聚体浓缩至40 mg ml⁻¹在25 m的结晶缓冲液中M（M）HEPES pH 7.0，100 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT公司。

2.2. 结晶和结构测定

使用悬挂滴蒸气扩散法在20°C下生长人MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的天然晶体。通过混合蛋白质溶液（20 mg ml）获得晶体⁻¹)具有相同体积的井缓冲液，包括35%(v（v）/v（v）)2-甲基-2,4-戊二醇（MPD），醋酸盐pH 4.8。这些晶体属于空间组 C类222₁并含有一个异二聚体复合物非对称单元。人MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的SeMet标记晶体是从含有2M（M）硫酸铵，3-（环己基氨基）-1-丙磺酸（CAPS），pH 10.5,0.2M（M）硫酸锂。使用最终浓度为20%的乙二醇对晶体进行冷冻保护(v（v）/v（v）)并在100K的氮气流中闪蒸冷却。在韩国浦项市浦项加速器实验室的束线4A和日本筑波光子工厂的束线17A上，使用同步辐射收集了本地和SAD数据集。使用从SeMet标记的蛋白质晶体和解决方案（Terwilliger和Berendzen，1999年). 该阶段进一步得到改善决心（特威利格，2000年)初始模型由ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008). 所有数据集都使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）); 表1总结了数据收集的统计数据。该模型是使用模型构建的迭代循环完成的库特（Emsley和Cowtan，2004年)和精炼具有菲尼克斯（亚当斯等。, 2010). 所有最终模型均由验证PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993).

采用悬挂滴气相扩散法在20°C下获得了MST2 SARAH同二聚体晶体，蛋白质浓度为40 mg ml⁻¹以及由2.0组成的储层溶液M（M）氯化钠、8%聚乙二醇（PEG）6000。这些晶体属于空间组 P（P）4₁2₁2中含有一个同二聚体复合物非对称单元。使用最终浓度为20%的乙二醇对晶体进行冷冻保护(v（v）/v（v）)并在100K的氮气流中闪蒸冷却。本地数据集是使用光子工厂光束线17A上的同步辐射收集的。所有数据集都使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）); 表1总结了数据收集统计数据. The晶体结构利用MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的结构作为搜索模型，通过分子置换法测定MST2 SARAH同二聚体相位器（麦考伊等。, 2007). 使用模型构建的迭代循环完成模型库特（Emsley和Cowtan，2004年)和精炼具有菲尼克斯（亚当斯等。, 2010).

2.3。尿素诱导变性

蛋白质样品（0.2 mg ml⁻¹)与0–7.5平衡M（M）10m尿素M（M）25°C时pH值为7.4的磷酸钠缓冲液。通过使用在韩国基础科学研究所的Jasco J710分光偏振仪的1mm路径长度的比色皿在298K下测量222nm处的摩尔椭圆率来监测蛋白质去折叠。数据通过非线性回归拟合到一个二态模型，以获得展开的自由能（Santoro&Bolen，1988）).

2.4. 计算分析

使用以下公式计算MST2同型二聚体和MST1–RASSF5异二聚体的溶剂可及表面积（ASA），以及MST1、MST2和RASSF4的单体NACCESS公司v.2.1.1版(https://www.bioinf.manachester.ac.uk/naccess网站)该方法基于Lee&Richards（1971）的方法). 我们在ASA计算中使用了默认的探头半径1.4º。将H原子添加到MST1、MST2和MST1–RASSF5二聚体结构中，并使用CHARMM22_PROT力场和CHARMM22电荷集在真空电介质中进行10000步共轭梯度能量最小化VEGA ZZ公司第2.4.0版(https://nova.colombo58.unimi.it网址). 二聚体及其单体的非极性ASA之间的差异给出了界面处埋藏的非极表面面积（疏水埋藏）。

MST1、MST2和MST1–RASSF5的能量是根据SYBYL-X公司2.0版(https://tripos.com). 使用Powell算法和Tripos力场在电介质80中实现Gasteiger–Hückel电荷集，对结构进行能量最小化，迭代10000次，终止梯度为0.05 kcal-mol⁻¹ Å⁻¹.

使用Korteme及其同事描述的方案，对MST1和MST2同源二聚体以及MST1–RASSF5异二聚体进行计算丙氨酸扫描（Korteme&Baker，2002; Korteme公司等。, 2004). 该方法确定了蛋白质-蛋白质界面的潜在热点。我们使用了>1.0 kcal-mol的截止值⁻¹确定有助于界面结合和稳定性的最重要残基。

3.1. MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的结构

通过将过量的RASSF5与MST1 SARAH域溶液混合，然后通过尺寸排除色谱法以分离异二聚体部分。如补充图S1所示¹过量的RASSF5比异二聚体早洗脱。我们收集异二聚体结晶峰的馏分（馏分40–42）。我们通过SDS–PAGE证实了收集的组分中MST1和RASSF5-SARAH结构域的蛋白质比例为1:1（补充图S1b条). 这个晶体结构由MST1（残基432-480）和RASSF5（残基366-418）SARAH结构域组成的SARAH复合物的SAD由SeMet衍生的单一晶体在SeK边缘。在非对称单元在里面空间组 C类222₁透明电子密度允许追踪MST1的残基Ser438–Lys480和RASSF5的残基Val365–Glu412，显示出紧密的异二聚体复合物（图2一和2d日). 虽然RASSF5的SARAH结构域由两个螺旋组成（h1，残基Glu66–Ser373；h2，残基Ile374–Glu412），但MST1的结构域只有一个螺旋，对应于MST1同二聚体结构中的h2螺旋（Hwang等。, 2007). MST1 SARAH结构域（Asp432–Lys437）的六个N端残基的电子密度，对应于短N端3₁₀-螺旋h1从我们之前研究的MST1同型二聚体中的h2螺旋扭结（Hwang等。, 2007)，在MST1–RASSF5异二聚体中缺失（图2一和补充图S2b条). 与MST1 SARAH结构域的h2螺旋相对应的螺旋结构始于异二聚体中的Ser438，而MST1同二聚体的螺旋结构则始于Val441（Hwang等。, 2007). 因此，MST1–RASSF5异二聚体中的h2螺旋比MST1同二聚体长三个残基。这些观察结果表明，MST1 SARAH结构域的h1螺旋变得非结构化，当其与RASSF5 SARAH区域结合时，h2螺旋延伸到N末端；这一点在当前研究中通过溶液中的核磁共振波谱得到了证实。由于化学交换或该区域信号的快速弛豫引起的谱线加宽（用补充图S2中的红色箭头表示），残基Asp432–Ser438的主链连接性在三重共振光谱中缺失一). MST1–RASSF5异二聚体结构中MST1 SARAH h1螺旋的展开可能是由于空间位阻MST1 h1螺旋通过直RASSF5 h2螺旋，这在同二聚体和异二聚体的重叠结构中很明显（补充图S3）。

图2 SARAH二聚体的总体结构。MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的结构(一,d日)，MST2 SARAH同源二聚体(b条,e（电子）)和MST1严重急性呼吸系统综合征同源二聚体(c（c）,（f）)分别以带状图和曲面表示形式显示。为了便于比较，所有面板中显示的方向都是相同的。对于MST1–RASSF5 SARAH异二聚体(一,d日)，蓝色带表示MST1 SARAH结构域的主链结构，而粉红色带表示RASSF5 SARAH结构域的主链结构。(克)同型二聚体（浅绿色）和异型二聚物（蓝色）中MST1 SARAH结构域的单体结构的比较。注意MST1 SARAH结构域的短h1螺旋缺失，MST1 h2螺旋的长度在MST1–RASSF5异二聚体中延长。

异二聚体和同二聚体之间MST1结构的另一个差异是α-脯氨酸残基Pro453和Pro472处MST1–RASSF5异二聚体中MST1原聚体的螺旋。Pro453和Pro472的侧翼螺旋轴的角度分别为28.5和39°，远大于MST1（分别为9°和32°）或MST2（分别是16°和27°）同源二聚体的角度（补充图S4）。与MST1或MST2同型二聚体中的直螺旋相比，这些尖锐的扭曲提供了更大的结合界面。主要α-MST1-RASSF5异二聚体中RASSF5原聚体的螺旋h2是直的，在相应位置没有脯氨酸残基（补充图S4b条).

MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的特征是两个原聚体的头尾相互作用，在拉长的α-MST1 SARAH螺旋和RASSF5 SARAH的h2螺旋。二聚体结构通过疏水相互作用和氢键稳定。异二聚体中有24个残基ΔΔG公司>1.0千卡摩尔⁻¹计算丙氨酸扫描（图3一和表2)：来自MST1、Leu444、Leu 448、Leu 451、Met455、Glu458、Ile459、Ile462、Tyr466、Arg470、Ile473、Ile4.77和Lys480的12个残基，以及来自RASSF5、Trp369、Ile 374、Leu377、Leu381、Leu38、Glu387、Glu38、Ile392、Val395、Tyr399、Leu406和Leu410的12种残基。另一方面，MST1同型二聚体（Hwang）中只有18个残基等。, 2007)展出的ΔΔG公司>1.0千卡摩尔⁻¹在计算丙氨酸扫描中。

图3 基于计算丙氨酸扫描的SARAH结构域二聚体相互作用的比较。(一,b条,c（c）)MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的计算丙氨酸扫描显示了描述具有二聚体相互作用残基侧链的带状表示(一)，MST2 SARAH同源二聚体(b条)和MST1 SARAH同源二聚体(c（c）). 残留物ΔΔG公司绑定>1.0千卡摩尔−1在计算中，丙氨酸扫描用棒状模型表示。在残留物中，RASSF5的Trp369、Ile374和Glu387以及MST2的Phe437和Leu440在图中未显示，也未标记以便于澄清。二聚体界面中具有极性相互作用的残基显示为绿色。红球代表介导两个原生质体之间氢键的水分子。对于MST1–RASSF5 SARAH异二聚体(一)，浅蓝色缎带代表MST1 SARAH域的主干结构，浅粉红色缎带代表RASSF5 SARAH区域的主干结构。(d日,e（电子）)显示了MST1严重急性呼吸系统综合征同源二聚体的N-末端螺旋-转弯-螺旋区形成的疏水核心侧链的带状表示(d日)和MST1–RASFF5 SARAH异二聚体(e（电子）). 残留物ΔΔG公司绑定>1.0千卡摩尔−1在计算中，丙氨酸扫描显示为黄色条。红色棒状物代表与疏水核心中的芳香残基相互作用的侧链。线性模型表示参与异构体间氢键的残基，其值较小ΔΔG公司绑定大于1.0 kcal mol−1.

此外，发现RASSF5的Lys398侧链与MST1的Glu458形成分叉氢键。RASSF5的Tyr399与Glu458形成了额外的氢键。此外，MST1的Arg470的胍与RASSF5的Glu388的侧链羰基形成分叉氢键。反过来，Glu388的羰基通过水分子间接地与MST1的Arg463的骨架羰基形成氢键。此外，MST1的Lys480的侧链氨基与RASSF5的Asp370和Phe372的主链羰基形成了分叉氢键（图3一). 异二聚体中直接间异构体氢键（包括分叉氢键）的总数为10，而MST1（Hwang等。, 2007)和MST2（见下文）分别为3和8（补充图S5一，第5页b条和S5c（c）). 因此，我们认为MST1–RASSF5复合物中广泛的疏水性和极性接触比它们稳定同二聚体结构更好地稳定异二聚体的结构。

发现MST1–RASSF5异二聚体中h2螺旋的两个螺旋轴的平均距离为10.0 Au，而MST1和MST2同二聚体的螺旋轴分别为10.2和10.8 Au。这一结果表明，MST1–RASSF5异二聚体中的两个反平行螺旋比同二聚体的反平行螺旋相互结合更紧密。MST1–RASSF5异二聚体和MST1和MST2同二聚体中h2螺旋总能量的比较表明，当同二聚物变为MST1-RASSF6异二聚物时，能量显著降低（表2). 这与变性用尿素进行的实验（见下文）。

3.2. MST2 SARAH同源二聚体的结构

这个晶体结构MST2 SARAH同源二聚体（残基436–484）如图2所示(b条)和2(e（电子）). 结构由以下因素决定分子置换从MST1–RASSF5 SARAH异二聚体结构开始。这个非对称单元发现在空间组 P（P）4₁2₁2.MST2 SARAH同源二聚体的整体结构与MST1 SARAH-同源二聚物的整体结构非常相似，尽管在局部结构上存在一些细微差异（图2b条和2e（电子）). 与我们之前研究中研究的MST1 SARAH同二聚体一样（Hwang等。, 2007)，MST2 SARAH同型二聚体具有反平行螺旋二聚体结构，短N末端螺旋h1向二聚体结合伙伴的h1′折叠。主要的二聚体相互作用包括非极性侧链的疏水相互作用和几个分子间氢键。然而，MST2 SARAH结构域和MST1 SARAH结构域之间存在一些特征性差异。

首先，在MST2 SARAH同源二聚体中发现两个原聚体的结构略有不同，而在MST1萨拉同源二聚体中的结构相同。MST2同源二聚体中保守脯氨酸残基处主螺旋h2的畸变A类Pro457和Pro476的角度分别为16°和27°，而原聚体的角度为B类为12°和15°（补充图S4d日和S4e（电子）). 因此，一个原聚体的h2的结构比另一个原聚体的更具线性。除了这种差异之外，两个原聚体的h2螺旋之间的氢键是不对称的。原聚体中的Tyr470A类在原聚体中被发现与Glu462氢键合B类和原聚体中的Tyr470B类被发现与原聚体中的Asp456氢键结合A类（图3b条和补充图S6）。当我们覆盖MST2同型二聚体的两个原异构体时，我们发现两个原聚体中Tyr470和Arg474的侧链构象彼此之间存在显著差异（补充图S6一)这导致羟基苯基定位在二聚体界面的另一侧，而大多数主链和侧链结构都很好地收敛，主链原子的根-平方偏差（r.m.s.d.）为0.81º，重原子为1.22º。此外，原生质体中Arg474的侧链A类在二聚体界面中远离Tyr470，但在原聚体中B类它靠近Tyr470（补充图S6b条和S6c（c）). MST2同型二聚体中两个原聚体之间的结构差异似乎是由晶体阻塞力引起的。有几例报道同型二聚体结构对称性被破坏；Brown（2006）对这些进行了审查). 确定MST2 SARAH同型二聚体的对称性在溶液中是否也会断裂是一件有趣的事情。MST2 SARAH结构域的异核单量子相干（HSQC）光谱中的主链酰胺信号已被指定（Hwang等。, 2010)，但它们只包含一组信号，这表明在解决方案中，MST2 SARAH域具有一个对称结构，或者处于两个不对称结构之间的快速动态平衡。此外，MST2同型二聚体中的短N末端螺旋h1和h1′被鉴定为典型的α-螺旋，而MST1同源二聚体中的螺旋是3₁₀-螺旋（补充图S4c（c）–S4系列（f）).

对二聚体界面中有序水分子的分析表明，与MST2 SARAH同二聚体相比，MST1–RASSF5 SARAH异二聚体包含更多的水分子，这些水分子介导了蛋白质间氢键（补充图S5c（c）和S5d日). MST2 SARAH结构中的水分子B类 因子值低于25º²，只有一个水分子介导了分子间的相互作用，而MST1–RASSF5 SARAH结构中的六个水分子被鉴定为分子间氢键的介体。我们认为，水介导的极性接触数量的差异进一步解释了MST1–RASSF5异二聚体比MST2同二聚体具有更高的结构稳定性这一事实。

3.3、。SARAH二聚体界面的计算丙氨酸扫描

为了确定SARAH二聚体相互作用的“热点”，我们进行了计算丙氨酸扫描（Korteme等。, 2004)它预测了哪些氨基酸侧链在突变为丙氨酸时会破坏界面的稳定性。丙氨酸扫描测量C以外侧链原子缺失的影响^β氨基酸原子对二聚体相互作用的亲和力。我们使用了Korteme描述的协议等。(2004). 吉布斯自由能变化大于1.0 kcal-mol的临界残基⁻¹丙氨酸取代后，即 ΔΔG公司_结合>1.0千卡摩尔⁻¹，表示为图3中的杆模型(一), 3(b条)和3(c（c）). 结构分析表明，二聚体界面上的许多疏水性和极性残基影响了二聚体相互作用的稳定性。在SARAH结构域中的保守残基中（图1)，MST1–RASSF5 SARAH异二聚体中酪氨酸突变为丙氨酸在所有测试的二聚体组中产生了最显著的影响ΔΔG公司_结合=4.1千卡摩尔⁻¹MST1–RASSF5 SARAH异二聚体中的17个非极性残基ΔΔG公司_结合>1.0千卡摩尔⁻¹而MST1中的15个残基和MST2 SARAH同源二聚体中的19个残基显示了这种变化。对于极性残基，MST1–RASSF5异二聚体中的七个氨基酸、MST1同二聚体和MST2同二聚体中的三个氨基酸具有ΔΔG公司_结合>1.0千卡摩尔⁻¹这一结果反映了这样一个事实，即对于MST1–RASSF5 SARAH异二聚体中二聚体相互作用稳定性具有能量重要性的残基数量大大大于MST1 SARAH同二聚体。在我们之前的研究中（Hwang等。2007年)，当MST1与RASSF5混合时，发现MST1 SARAH结构域的原聚体自发地与其同二聚体结合伙伴分离，与RASSF 5 SARAH区域形成更稳定的异二聚体。据认为，MST1–RASSF5 SARAH结构域中增加的极性和非极性相互作用是稳定异二聚体的主要因素。

SARAH结构域异源二聚的一个重要贡献是由一个原聚体的N末端螺旋-转螺旋区域和二聚体伴侣的h2螺旋的C末端形成的疏水核（图3d日和3e（电子）). 我们确定了形成疏水核心的关键残基中的哪些具有ΔΔG公司_结合大于1.0 kcal mol⁻¹在MST1同型二聚体中，发现疏水核心由一个原聚体的三个亮氨酸残基Leu436、Leu444和Leu448以及另一个原聚体的两个异亮氨酸残基Ile473和Ile477稳定（图3d日). 两个疏水核对称地位于MST1同源二聚体中h2螺旋的两端。相反，MST1–RASSF5异二聚体只有一个疏水核，但具有更广泛的相互作用，由RASSF5Trp369、Ile374、Leu377和Leu381以及MST1的Ile473和Ile477稳定。此外，Trp369的芳香侧链被两种苯丙氨酸Phe372和Phe380包围，这进一步稳定了MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的疏水核（图3e（电子）)而MST1同型二聚体疏水核中的所有残基都是脂肪族的（图3d日).

3.4. 尿素诱导的比较变性SARAH域曲线

在我们之前的研究中（Hwang等。, 2007)，我们分析了核磁共振波谱变化，发现MST1 SARAH同型二聚体的两个原聚体在溶液中遇到RASSF5 SARAH结构域时容易解离形成异二聚体。在溶液中添加RASSF5 SARAH结构域的MST2 SARAH同二聚体的滴定实验中获得了类似的结果（补充图S7）。为了比较SARAH结构域的结构稳定性，我们进行了脲诱导变性同时监测远紫外线圆二色性（CD）。通过监测摩尔剩余椭圆度[θ]在222nm处，我们观察到尿素诱导的二级结构变化变性。由于SARAH域包括α-螺旋，结果表明过渡浓度(C类_米)尿素变性的α-螺旋结构。图4显示了尿素诱导的变性SARAH域曲线。我们发现MST1–RASSF5和MST2–RASF5异二聚体C类_米MST1和MST2同二聚体的值（图4). 结果与结构观测结果一致。

图4 尿素诱导的严重急性呼吸系统综合征结构域变性曲线的比较。通过监测摩尔椭圆度，观察到尿素浓度增加时SARAH结构域的二级结构变化[θ]222 nm（远紫外）圆二色性MST1–RASSF5 SARAH异二聚体的（CD）(一)，MST1 SARAH同二聚体(b条)，MST2–RASSF5 SARAH异二聚体(c（c）)，MST2 SARAH同源二聚体(d日)和一个双突变MST1–RASSF5（RASSF5E388A和K398A）SARAH异二聚体(e（电子）). 虚线表示过渡浓度(C类米)尿素变性属于α-螺旋结构。

我们进一步分析了尿素诱导的实验结果变性并通过线性外推方法估计同二聚体和异二聚体之间的自由能差变性实验（佩斯和肖，2000; 李等。, 2010; Santoro&Bolen，1988年):

C类_米= 1.5 M（M）（尿素浓度），ΔG公司°=2.0±0.23千卡摩尔⁻¹;

C类_米= 4.0 M（M）（尿素浓度），ΔG公司°=4.8±0.33千卡摩尔⁻¹.

来自尿素诱导的变性MST1–RASSF5的配置文件_异二聚体和MST1_同二聚体，发现MST1–RASSF5_异二聚体比MST1更稳定_同二聚体，展开自由能分别为4.8±0.33和2.0±0.23 kcal mol⁻¹分别为。这一结果表明，异二聚体相互作用比同二聚体作用强得多。

当我们将双突变（E388A和K398A）引入RASSF5时，MST1–RASSF5SARAH异二聚体的稳定性大大降低到C类_米第3.2页M（M）尿素（图4c（c）). 尿素突变的影响变性实验和计算丙氨酸扫描分析SARAH二聚体界面的结果一致。

这些结果表明，MST–RASSF异二聚体比MST同源二聚体更稳定，并且当MST在溶液中遇到RASSF时，异二聚体的形成是优选的。因此，MST优先与RASSF形成异二聚体是合理的，从而调节其活性以及与其他结合伙伴（如SAV或RAF1）的相互作用。